Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA'larının Algılama In Situ Melezleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetişkin beyin örneklerinde yanlışlıkla lokalize mRNA'ları tespit etmektir. Bu, ön işlemle elde edilir. İkinci adım olarak mRNA moleküllerini maskelemek için kaynatma ve proteaz sindirme yoluyla numuneler Hibridizasyon gerçekleştirilir, ardından ilgilenilen mRNA'nın görselleştirilmesini sağlayan amplifikasyon ve tespit adımları takip edilir.

Sonraki aksonlar, ilgilenilen mRNA'nın aksonlara lokalize olduğunu doğrulamak için antikorlar veya boyalarla boyanır. Sonuçlar, farklı maskeleme prosedürleri ve sayaçlar, mikroskopi analizlerine dayalı boyama yöntemleri kullanılarak beyin örneklerinde bir TF dört mRNA'nın varlığını göstermektedir. Bu yöntem, sinirbilimde hangi mRNA'ların lokalize olduğu ve ekzonlar olmadan çevrildiği gibi soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu yöntem intracon protein sentezi hakkında bilgi sağlayabilse de, mRNA lokalizasyonunun meydana geldiği dendritler ve nöronal olmayan hücreler ve dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Beyin dilimlerini sabitledikten sonra, yazılı protokoldeki talimatlara göre, 60 mililitre antijen alma çözeltisi içeren bir copin kavanozu hazırlayın ve slaytları çözeltiye daldırın. Ardından, bir litrelik bir kabı damıtılmış suyla doldurun ve ısıyı tamponlamak için mikrodalgaya koyun.

Maskeyi çıkarırken, slaytları ve geri alma solüsyonunu içeren coplan kavanozunu mikrodalgaya yerleştirin. Slaytları beş dakika boyunca yüksek güçte kaynatın. Çözelti kaynamayı bıraktıktan hemen sonra, slaytları tekrar yüksek güçte beş dakika daha ısıtın.

Slaytları oda sıcaklığında soğumaya bırakın Soğuduktan sonra, slaytları yıkamak için PBS içeren bir kaba daldırın ve ardından yıkamayı iki kez daha tekrarlayın Yıkadıktan sonra, slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve iki ila üç damla veya 100 mikrolitre DAP B.Probe kontrol olarak beyin bölümüne ekleyin. Arka plan boyamasını değerlendirmek için, deney bölümlerine iki ila üç damla hedefleme probu ekleyin İlgilenilen RNA'yı tespit etmek için, burada bir TF dört RNA'sı olan farenin 20 ila 1381 kalıntılarını hedefleyen bir prob kullanılır. Probun buharlaşmasını önlemek için slaytların üzerine param yerleştirmek için forseps kullanın.

Daha sonra slaytları hibridizasyon fırınının içindeki nemlendirilmiş slayt kutusuna yerleştirin ve iki saat boyunca 40 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, slaytları oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir x yıkama tamponu ile bir tabakta yıkayın. Daha sonra, her beyin dilimine bir MP bir fl iki ila üç damla amplifikasyon reaktifi ekleyin.

Daha sonra taze para film ile örtün, slayt kutusuna yerleştirin ve hibridizasyon fırınında 40 derecede 15 dakika inkübe edin. Slaytları daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, her beyin dilimine iki ila üç damla amplifikasyon reaktifi A MP dört fl ekleyin ve perfil ile kaplayın. Slaytları sürgülü kutuda 40 santigrat derecede hibridizasyon fırınında 15 dakika inkübe edin.

Slaytları oda sıcaklığında her biri iki dakika boyunca bir x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi, son yıkamayı takiben, her dilimi mililitre başına üç miligram, BSA 100 milimolar glisin ve% 0.25 Triton X 100 içeren 100 ila 200 mikrolitre bloke edici solüsyon ile örtün, her slaytı paraform ile örtün ve 30 dakika inkübe edin İnkübasyonu takiben oda sıcaklığında, slaytlara bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 100 ila 200 mikrolitre antikor ekleyin. Burada bir anti kolin asetil transferaz antikoru, slaytları dört santigrat derecede iki gün boyunca perfil inkübe etmek ile kapladıktan sonra kullanılır.

Gerekirse beyin dilimlerinin kurumamasına dikkat edin, inkübasyondan 24 saat sonra beyin dilimlerine anti CHATT antikor solüsyonunu tekrar uygulayın. Slaytları beş dakika boyunca bir XPBS'de üç kez yıkadıktan sonra. Oda sıcaklığında, slaytlara 100 ila 200 mikrolitre uygun Alexa konjuge ikincil antikor ekleyin.

Param ile örtün ve bir saat geçtikten sonra ışıktan korunarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Slaytları daha önce olduğu gibi her biri beş dakika boyunca bir XPBS'de üç kez yıkayın ve ardından bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Slaytları DPI içeren montaj ortamıyla monte edin ve ardından beyin dilimlerini floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Resmi ve sabit parafine gömülü insan beyni örneklerini hazırladıktan sonra, protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre, slaytları sıcak ön işlem iki solüsyonuna batırarak ve 15 dakika kaynatarak ısıya bağlı antijen maskesini kaldırın. Damıtılmış suda üç ila beş kez ve taze %100 etanolde üç ila beş kez yıkadıktan sonra, proteaz kaynaklı antijen maskesini çıkarmak için slaytların oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Dört damla ön işlem ekleyin, üç kez perfil ile örtün ve hibridizasyon fırınında 40 derecede 30 dakika inkübe edin: Damıtılmış suda üç ila beş kez yıkadıktan sonra.

Daha önce olduğu gibi, arka plan lekelenmesini değerlendirmek için beyin dilimlerini kontrol etmek için dört damla DAP B prob seti ve deneysel bölümlere dört damla hedefleme probu seti ekleyin. Film kaplı slaytları slayt kutusuna yerleştirin ve hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede iki saat inkübe edin. İlgilenilen mRNA için DAB sinyalini geliştirmek için yazılı protokoldeki adımları izledikten sonra, parlak alan mikroskobu altında bir sinyalin varlığını kontrol edin.

Karşı boyama prosedürü boyunca puncta varlığının izleneceği beyin örneklerindeki referans alanlarını tanımlayın. Lekeye karşı koymak için. İlk olarak, slaytları 60 santigrat dereceye kadar ısıtılmış luxal fast blue rengine yerleştirin ve 60 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, slaytları damıtılmış suda birkaç kez durulayın ve ardından farklılaşmayı başlatmak için slaytları birkaç kez% 0.05 lityum karbonat çözeltisine batırın. Ardından, slaytları iki kez taze,% 75 etanole batırın ve damıtılmış suda durulayın. Beyin dilimlerini parlak alan mikroskobu altında kontrol edin.

Gri ve beyaz maddenin ayırt edilebilir olmaya başlaması ve RNA granüllerinin hala koyu mavi siyah puncta olarak görünür olması gerektiğini unutmayın. Aksonların açık mavi lifler olarak görünmeye başladığını doğrulayın, luxal mavi boyama prosedürünü tekrarlayın, 10 ila 20 dakikalık adımlarla luxal mavi ile inkübe edin ve optimal boyama elde edildiğinde karşı lekeyi ve RNA granüllerinin varlığını dikkatlice izleyin. Durulama slaytlarını krestal menekşe solüsyonuna yerleştirin ve inkübasyonu takiben 10 dakika inkübe edin.

Slaytları damıtılmış suyla durulayın. Slaytları beş ila 10 kez %70 etanole batırın ve ardından bir davlumbazda %100 etanolün üç hızlı değişimiyle kurutun. Ksilen içinde iki kez inkübe ederek beyin dilimlerini temizleyin.

Alternatif temizleme maddesi iki dakika ve üçüncü kez beş dakika. Oda sıcaklığında, beyin dilimlerini ksilen bazlı kalıcı montaj ortamına monte edin ve parlak alan mikroskobu altında analiz edin. Balık, proteaz kaynaklı maskeleme ve ardından kırmızı ile gösterilen kolin asetil transferazın antikor tespiti kullanılarak gerçekleştirildi.

Antikor, proteaz tedavisi yapıldığında sohbeti tanıyamadı. Aynı mikroskop ayarları ve görüntü ayarlamaları kullanılarak hedef olmayan bir prob ve bir TF dört hedefleme probu ile elde edilen sonuçların örnekleri gösterilmektedir. Aksonal lokalizasyonu belirsiz yeşil ATF dört pozitif granül soru işaretleri ile belirtilmiştir.

Mavi alanlar, balıklar ısıya bağlı antijen kullanılarak gerçekleştirildiğinde zarif lekeli çekirdeklerdir. Tekrar kırmızı ile gösterilen sohbet immünofloresan lekelenmesinin maskesini kaldırmak başarılı oldu. Aksonlara lokalize edilmiş bir TF dört pozitif granül turuncu görünür ve ish aksonları luxal ile karşı boyandıktan sonra tamam olarak işaretlenir.

Hızlı mavi ve nöronal SOTA, krestal menekşe suboptimal luxal ile karşı boyandı. Sıcaklık düşürülürse hızlı mavi lekelenme meydana gelebilir. Burada numuneler dört saat boyunca 40 santigrat derecede luxal fast blue ile boyandı.

Kazara lokalizasyonu belirsiz olan bir TF dört pozitif granül soru işaretleri ile belirtilmiştir. Optimal olmayan lekelenme, burada görüldüğü gibi kısa inkübasyon sürelerinden sonra karşı lekenin yoğunluğu kontrol edilmediğinde de meydana gelir. Hedef olmayan bir prob veya bir TF dört hedefleme probu kullanılarak ish ile birleştirilmiş optimal LFB boyama örnekleri burada gösterilmektedir.

Görüntü alımı, en iyi sinyal-gürültü oranı için otomatik olarak ayarlandı. Akson lokalize bir TF dört granül tamam olarak işaretlenir. Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, geliştirildikten sonra seçilen karşı boyama yöntemine bağlı olarak bir ila üç gün içinde yapılabilir. Bu teknik, sinirbilimcilerin mRNA translasyonunu ve nüansta lokalizasyonu keşfetmelerini sağlar.