Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Araştırmalarımız, yerel protein sentezinin nasıl düzenlendiğini ve sinir onarımı, gelişim ve dejenerasyondaki rollerini incelemektedir. Son gelişmeler arasında, düşük bolluklu aksonal MRNA'ların tanımlanması ve nöronal kültürlerin ayrılması için gdPCR gibi yüksek hassasiyetli mRNA tespit teknikleri yer almaktadır. Başlamak için 250 mikrolitre triazol, her inserte karşılık gelen 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne bir kuyuya veya altı kuyruklu bir plakaya yerleştirilir.

Tüpleri ihtiyaç duyulana kadar kenara bırakın. İkinci altı kuyu plakanın her kuyusuna iki mililitre steril PBS ekleyin, böylece kuyu veya plaka sayısının insertlerin sayısıyla eşleştiğinden emin olun. Kültür ortamını iç kısmın üst alt kısmından pipetleyin ve insert PBS içeren altı kuyu plakaya aktarın.

Şimdi, forseps kullanarak, inserti nazikçe yerleştirin, ardından üzerine iki mililitre PBS ekleyin. PBS'yi her iki taraftan aspire edin ve iki kez yıkamayı tekrarlayın. Sonra inserti taze PBS'de bırakın.

Sonra, insertin üst kısmından tüm nöron fraksiyonunu kazımak için steril bir hücre kazıyıcı kullanın. Soma lizatını insertten toplayın. Onu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü 10.000 ila 15.000 G arasında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelleti 250 mikrolitre trizol içinde yeniden askıya alın. Bu tüpü tüm nöron fraksiyonu olarak etiketleyin.

Nöurit fraksiyonunu toplamak için, steril pamuk çubuğunun bir ucunu yavaşça, nöron tarafında yukarıdan aşağıya zikzak şeklinde hareket ettirin. Inserti 90 derece döndürün ve sürüngenin diğer ucunu kullanarak tekrarlayın. Sonra sürüntü at.

Yeni bir sampon kullanın ve iç kısmın ortasından dışarıya doğru konsantrik daireler çizerek hareket edin, çevreyi de temizlediğinizden emin olun. Inserti ters çevirin ki nörid tarafı yukarı baksın. Zarı yeni steril bir bistüri bıçağı ile kesin.

Kesilen zarı, nöurit tarafı aşağıya bakacak şekilde trizol içeren altı kuyu plakaya yerleştirin. Zarın suyun altında olduğundan emin olun. Şimdi kuyudan nörit lizat içeren trizol alın.

Onu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. RNA izolasyonuna devam edin veya soma ve nörit lizatlarını daha sonraki işlem için -80 derece Celsius'ta depolayın. Droplet Digital PCR Kullanıma Hazır Evrensel Karışımı kullanarak ters transkripsiyon damlacıklı dijital PCR reaksiyonlarını hazırlayın ve uygun tamamlayıcı DNA ile belirli primerleri hedefleyin.

Reaksiyon karışımını damla üretim kartuşuna pipetleyin. Sonra üretim yağını kartuşun belirlenen kuyularına ekleyin. Şimdi, kartuşu contayla mühürle.

Damlaları damla üreteci kullanarak üretin. Damlacıklar üretildikten sonra, onları 96 kuyruklu bir PCR plakasına aktarın ve plakayı termosikleye yerleştirmeden önce folyo ile mühürleyin. Analize başlamak için QX Manager Yazılımını açın.

Göz atma seçeneğine tıklayın ve analiz edilecek dosyayı açın. Dosya yüklendiğinde, sol panelde dashboard görünümü beliriyor. İlgilendiğiniz kuyrukları Control tuşuna basılı tutup tıklarken seçin.

1D Amplitude üzerine tıklayarak bir nokta grafiki görselleştirebilirsiniz. Birden fazla kuyuya aynı eşiği uygulamak için Birden fazla Kuyu Eşik Kuyusu seçin. Pozitif ve negatif damlacıklar arasında net bir ayrım görüldüğü noktaya göre eşik değerini girin.

Şimdi veri bölümünü iyi izleyin; örnek tanımı, konsantrasyon değerleri, kabul edilen damla sayısı ile pozitif ve negatif damla sayılarını gösterin. Eşik sonuçları kaydetmek için Kaydet'e tıklayın. Ribo yeşil testiyle yapılan RNA nicelendirmesi, tüm nöron fraksiyonlarının bir insert başına 212,85 nanogram RNA verdiğini, nörit fraksiyonlarının ise 42,75 nanogram verdiğini ortaya koydu.

PCR doğrulaması, primer set 1'in Gap43 transkripti için en spesifik olduğunu ve belirgin bir tek bant gösterdiğini belirledi. Gamma-aktin için belirsiz PCR sonuçları, primer seti iki kullanılarak bir sıcaklık gradyanı testi yapılmasına yol açtı ve en güçlü amplifikasyonu 55 derece Celsius'ta gösterdi. RT-ddPCR amplitü grafikleri, hem tüm nöron hem de nöurit örneklerinde Gamma-aktin için net damlacık ayrımı göstererek güvenilir transkript tespitini doğruladı.

Gap43 için, mRNA havuzunun neredeyse %23'ü nöritlerde bulunurken, Gamma-aktine kıyasla nüritlerde mRNA havuzunun sadece %5'i bulunur ve tüm nöron fraksiyonu ile karşılaştırılır. Fizyolojik koşullarda aksonda stres granül yapılarının varlığını gösterdik; bu yapılar yerel protein sentezini engeller. Protokolümüz, nöronal bölmeleri izole etmek ve düşük ortamlı mRNA'ları tespit etmek için güvenilir ve tutarlı bir yöntem sunar.

Gelecekteki analizler, büyüme konileri ve aksonal şaft gibi farklı aksonal alt domainlerin kütle analizinin ötesinde izole edilmesi ve karakterize edilmesine odaklanacaktır.