Name: Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNAların İzolasyonu ve Nicelesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, gözenekli membran insertleri ve RT-ddPCR kullanarak aksonal mRNA'ları izole etme ve niceleme yöntemini. Bu protokol, düşük kopyalı transkriptleri yüksek hassasiyetle tespit ederek sinir bilimi araştırmalarında yerel protein sentezini incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>6-kuyu plaka için hücre kültürü insertleri, 1.0&nbsp; &mu; m Gözenek Boyutu, Steril</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>6-kuyu plaka için hücre kültürü insertleri, 3.0&nbsp; &mu; m Gözenek Boyutu, Steril</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>Dar Bıçaklı Hücre Kaldırıcı</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6-kuyu doku kültür plakaları</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plakaları&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>ddPCR Damla Okuyucu Yağı&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>QX200/QX100 Damla Jeneratörü için DG8 Kartuşları</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kiti</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Floresans bazlı, 96 kuyruklu, siyah mikroplakalar</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>PCR Plaka Isı Sızdırmazlığı, folyo, delinebilir</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Tüketim Malzemeleri</td></tr><tr><td>Poli-Lisin</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Termal Döngücü</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>QuantaSoft yazılımı</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PCR veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen Reaktif ve RNA Analiz Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>EvaGreen için QX200 Damla Üretim Yağı</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>QX200 Damla Jeneratörü</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>QX200 Damla Okuyucu</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reaktifler</td></tr></tbody></table>

gözenekli membran insertleri ve rtddpcr kullanarak aksonal mrna'ların İzolasyonu ve nicelesi

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

PLL kaplamalı 1 μm insertler üzerinde kaplamalı primer embriyonik kemirgen kortikal nöronları ve BFCN'ler sağlam yapışır ve nöriteleri in vitro (DIV) 5-7 gün boyunca membran boyunca uzatır. 11 DIV'de kültürler yoğun ağlar gösterir. Yetişkin sıçan DRG'leri için, PLL kaplamalı 3 μm eklere bir kat laminin eklemek, 5 DIV ile karşılaştırılabilir aksonal uzantıyı elde etmeye yardımcı olur. Bu gözlemler, insertlerin uzun vadeli nöronal büyümeyi destekleme ve aşağı akış RNA ekstraksiyonu için yeterli aksonal materyal sağlayabildiğini doğrulamaktadır. Ölçeklendirme ihtiyacı olduğunda, yeterli malzeme sağlamak için birden fazla inserti birleştiriyoruz.
Bireysel insertlerden TRIzol ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve ardından ddPCR için yeterli RNA sağlar. RiboGreen nicel gösterişi, tüm nöron fraksiyonlarından tutarlı RNA verimlerini (212,85 ng/insert) ve nörit fraksiyonlarından daha düşük verimleri (42,75 ng/insert) doğrular (Şekil 2). Genellikle tüm nöron fraksiyonundan ~5-7 kat RNA alırız, nörit zenginleştirilmiş fraksiyona karşılık.
Tüm primerler RTddPCR deneylerinden önce doğrulanır. Her hedef transkript için, aynı nöronal örneklerden üretilen cDNA üzerinde en az iki primer seti sipariş edilip geleneksel PCR kullanılarak test edilir. En güçlü ve en spesifik bandı üreten primer çifti RTddPCR için seçilir (Şekil 3A). Örneğin, Gap43 için primer set 1'i seçtik. Actγ için elde edilen belirsiz sonuçlarda, tavlama sıcaklıklarını optimize etmek için gradyan PCR uygularız (Şekil 3B). Bu, mutlak nicelik için yalnızca iyi doğrulanmış primerlerin kullanılmasını sağlar ve damla ayrımında artefakt olasılığını azaltır.
Kazıma ve sürünme işlemi, somatik ve nörik bölmeleri güvenilir şekilde ayırır. Tüm nöron fraksiyonlarından izole edilen RNA, Actγ46,47,48,49 gibi transkriptlerin zenginleşmesini gösterir (Şekil 4). Buna karşılık, akson/nörit fraksiyonları sınırlı hacimleriyle tutarlı olarak belirgin şekilde daha düşük toplam RNA verir, ancak Gap43 gibi distal süreçlere lokalize olduğu bilinen transkriptlerin zenginleşmesini gösterir (Şekil 4). Soma ile sınırlı transkriptlerin minimum çapraz algılanması, insertler dikkatlice ele alındığında ve optimal yoğunlukta kaplama yapıldığında yüksek bölme saflığını gösterir.
Olumlu sonuçlar şu şekilde karakterize edilir: (1) net aksonal uzantıya sahip sağlam nöron morfolojisi, (2) zar yırtılmadan temiz ayrılma bölümleri, (3) pozitif ve negatif damlacıklar arasında belirgin ayrım sağlayan doğrulanmış primerler ve (4) aksonal transkriptler için güçlü RTddPCR sinyalleri. Optimal olmayan deneyler, düşük RNA verimliliği, nörit fraksiyonlarındaki soma işaretleyicileriyle kanıtlanan çapraz kontaminasyon veya primer dimerizasyonu nedeniyle artan damla "yağmuru" gibi RTddPCR artefaktlarına yol açar. Bu sorunlar genellikle insert membran hasarı, aşırı kazıma basıncı veya yetersiz primer tavlama sıcaklığı optimizasyonu ile ilişkilidir.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Şekil 1: Membran insertleri kullanılarak bölme-spesifik RNA izolasyonuna genel bakalım. Kemirgen nöronları 1-3 μm gözenek boyutuna sahip yarı geçirgen eklerde kültürlendi; bu da nörite uzanmasına izin verirken soma kısıtlamasını sağladı. Tüm nöron hazırlığı için, üst bölmedeki hücreler steril bir kazıyıcı kullanılarak kazılıp pellet edildi ve ardından RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve RTddPCR için TRIzol ile lizleştirildi. Insert membranından kalıntı hücresel kalıntılar steril pamuk çubukla çıkarıldı. Nörit hazırlığı için, artık sadece nöritleri içeren insert membranı ters çevrilip bir smalı bıçağı ile kesildi ve doğrudan TRIzol'a batırıldı, ardından RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve RTddPCR yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Şekil 2: RiboGreen testi kullanılarak standart RNA konsantrasyon eğrisi. (A) Floresans yoğunluğu, RiboGreen RNA nicelendirme testi kullanılarak bir sıra RNA standartları üzerinde ölçüldü. Doğrusal bir regresyon analizi, RNA konsantrasyonu ile floresan sinyali arasında güçlü bir korelasyon ortaya koydu (R² = 0.9956). Bire yakın R² değeri, doğru RNA nicelendirmesi için RiboGreen testinin mükemmel doğrusal ve güvenilirliğini gösterir. (B) A'da elde edilen eğim için (y=19.738x + 14.905) denklemi kullanılarak, her kesim için toplam RNA hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Şekil 3: PCR ve agaroz jel elektroforezi ile primer doğrulaması. (A) Actγ ve Gap43 için cDNA kullanılarak PCR amplifikasyon ürünleri, primer özelliğini değerlendirmek için %2 agaroz jel üzerinde çözüldü. Her gen için iki bağımsız primer seti (set 1 ve set 2) test edildi. DNA boyut belirteçleri (merdivenler) bitişik şeritlerde moleküler ağırlıklar gösterilir (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Beklenen boyuttaki belirgin tek bantlar, seçilen primer setlerinin başarılı amplifikasyonunu ve özgüllüğünü doğrular. (B) PCR amplifikasyonu, Actγ primer seti 2 kullanılarak bir sıcaklık gradyanı (55-65 °C) boyunca yapılarak optimal tavlama sıcaklığı belirlendi. Amplifikasyon ürünleri, %2 agaroz jeliyle ve DNA merdiveni (şerit 2, boyutlar gösterilmiştir) çözdü. Test edilen aralıkta beklenen boyutta tutarlı tek bantlar gözlemlenmiş, en güçlü amplifikasyon 55 °C olarak tespit edilmiştir; bu da bu primer seti için optimal sıcaklık olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Şekil 4: Seçilen transkriptlerin RTddPCR analizi ve mRNA kopyalarının nicelendirilmesi. (A,B) (A) Actγ ve (B) Gap43 için damla ayrımını gösteren temsil tek boyutlu genlik grafikleri. Her nokta tek bir damlayı temsil eder; mavi damlacıklar pozitif amplifikasyonu, gri damlacıklar ise negatif amplifikasyonu gösterir. Y ekseni genliği, X ekseni ise ddPCR plakasındaki kuyu konumunu gösterir. Pozitif (mavi) ve negatif (gri) damlacıklar arasındaki net ayrım, hedef transkriptlerin belirtilen primer setleriyle sağlam bir şekilde tespit edildiğini doğrular. (C) Tüm nöron ve nörit fraksiyonlarında Actγ ve Gap43 transkriptleri için toplam RNA transkriptlerinin μL/μL ve ng başına kopya sayısını özetleyen tablo. Kopya sayı tahminleri, ddPCR damlacık sayıları kullanılarak mutlak niceliklendirme yoluyla elde edildi (A,B panellerinde gösterilmiştir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

isolation-quantification-axonal-mrnas-using-porous-membrane-inserts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem...

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu makale, biyokimyasal ve immünositokimyasal analizler için büyük miktarlarda saf aksonal numune elde etmek için kullanılabilecek bir nöronal kültür sistemini açıklamaktadır. Bu teknik, normal aksonal fizyolojinin ve nörodejenerasyona yol açan sinyal yollarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Bu çalışmada, yeni bir platformu geliştirdi ve valide edilmiş bipolar bozukluk (BD) tedavi yanıtının intranöronal moleküler imzaları araştırmak. BD hastaların Koku epitel burun biyopsi ile elde edildi. Sonra lazer yakalama mikrodiseksiyon BD lityum yanıt moleküler imza araştırmak için Gerçek Zamanlı RT PCR ile kombine edilmiştir.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Öğrenin, gözenekli membran insertleri ve RT-ddPCR kullanarak aksonal mRNA'ları izole etme ve niceleme yöntemini. Bu protokol, düşük kopyalı transkriptleri yüksek hassasiyetle tespit ederek sinir bilimi araştırmalarında yerel protein sentezini incelemeyi kolaylaştırır.

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Daha fazla video keşfet