Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Bu prosedürün genel amacı, biyouyumlu nanopartiküllerden oluşan ultra küçük popülasyonlar sentezlemek, bunların fiziksel özelliklerini karakterize etmek ve partikül-hücre etkileşimlerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle lipid nanopartikülleri sentezlemek için faz tersinme sıcaklığı yönteminin kullanılmasıyla gerçekleştirilir. Bu süreç sırasında, lipid ve sürfaktan başlangıçta birlikte eritilir.

Belirli miktarda su eklendikten sonra, karışım faz ayrışması gerçekleşene kadar ısıtılır. Ardından, nanoemülsiyon oluşana ve katı lipid nanopartiküllerin veya sln sentezi tamamlanana kadar karışım sürekli karıştırılır. Sonrasında, partikül boyutu ve polidispersiteyi ölçmek için dinamik ışık saçılması veya DLS kullanılır.

Diferansiyel tarama kalorimetrisi veya DSC, partikülleri daha detaylı karakterize etmek amacıyla erime noktasını ve erime gizli ısısını belirlemek için kullanılan ek bir tekniktir; sonuç olarak, partikül-hücre etkileşimlerini incelemek için floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılabilir. Bu tekniğin, ultrasonikasyon, mikroakışkanlar ve yüksek basınçlı homojenizasyon gibi mevcut yüksek enerjili yöntemlere göre temel avantajı, hem basit hem de ölçeklendirilebilir, nispeten nazik bir sentez tekniği olmasıdır. LNS sentezlemek için 0,6 mg floresan boya veya diğer lipofilik bileşik ile 0,10 g doğrusal alkan veya lipid karıştırın.

15 mililitrelik bir viyol içerisinde bileşenleri 90 °C'de eritip karıştırın ve 0,11 gram lineer noniyonik sürfaktan ekleyin. Ardından, elde edilen karışımı 90 °C'de eritip karıştırın. Son olarak, karışıma 1,79 gram steril su ekleyip 90 °C'ye ısıtın ve iki faz gözlemlenene kadar çözeltiyi görsel olarak takip edin.

Şimdi şeffaf bir nano emülsiyon oluşana kadar karışımı karıştırın. Kontrol örneği olarak hizmet etmesi için, paralel olarak floresan boya eklemeden ayrı bir nano emülsiyon hazırlayın. Daha sonra her bir nano emülsiyonu steril 0.2 micron filtre kullanarak sterilize edin.

Slns'lerin partikül boyutunu ve polidispersite indeksini ölçmek için bir cam küvet kullanarak DLS uygulayın. Örneklerin ölçümünden önce, partikül boyutu ölçümü için tasarlanmış bir cihazda, üreticinin standart hazırlama ve ölçüm protokolünü takip ederek iki bilinen standardın partikül boyutu ölçülmelidir. Ardından, hazırlanan örneklerin her birini ölçün. Ölçümler için 100 saniyelik çalışma süresi, suyun kırılma indisi ve suyun 20 °C'deki viskozite değerlerini kullanın.

S LN'lerin termal davranışını DSC kullanarak incelemek için ortalama partikül çapını ve partikül boyutu dağılımının polidispersitesini raporlayın; öncelikle S LN'lerden yaklaşık 25 mg kütlesinde bir miktarı 40 µL'lik alüminyum panın içine pipetleyin. DSC taraması sırasında nem kaybını en aza indirmek için panı evrensel bir krimp pres kullanarak hermetik olarak mühürleyin. Her bir nanoemülsiyonu 5 °C'den 80 °C'ye kadar ölçmeden önce, çukurun erime noktasını ve eğrinin altındaki alanın integralinin gizli erime ısısını temsil ettiği DSC grafiğinden erime noktasını ve gizli erime ısısını raporlayın.

DSC grafiğinde, malzeme miktarına bölünen değer, kültürün erime gizli ısısını temsil eder. Primer insan fibroblastlarını, üreticinin talimatlarına uygun olarak, insan dermal fibroblast kültürleri için kullanılan sıvı besiyerinde yetiştirin. Düşük serum büyüme takviye kiti ile desteklenen hücreleri; 37 °C sıcaklıkta, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde muhafaza edin ve hem MTT hem de görüntüleme analizi için hücre ekimi yapmadan önce %80 konfluense ulaştıklarında pasajlayın.

Kuyu başına 20,000 hücre yoğunluğunda 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Hücrelerin, zaman sıfırındaki SLN maruziyeti öncesinde gece boyunca 37 °C'de dengelenmesini sağlayın. İstenen lipid konsantrasyonuna ulaşmak için SLN'leri komple besiyerinde seyreltin ve 96 kuyucuklu plaktaki her bir tekerrür kuyucuğuna 10 µL ekleyin. SLN'lerle 24 saatlik inkübasyonun ardından, üretici protokolüne uygun olarak MTT analizi kullanarak hücresel canlılığı belirleyin. Hücreleri bir kez yıkayın ve her birine 100 µL taze besiyeri ekleyin.

Kontrol kuyucukları, taze besiyeri ile değiştirilmeden önce %70'lik metanol çözeltisi içinde 10 dakika inkübe edilerek öldürülür. Mikropalyanın her bir kuyucuğuna kuyucuk başına 10 µL MTT reaktifi eklenir ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir; gece boyu süren inkübasyonun ardından, hücre içi form ve kristaller sağlanan deterjan çözeltisinin 100 µL'si ile çözünür hale getirilir. Üretici protokolüne uygun olarak, absorbans değerleri elde edilmeden önce hücreler deterjan çözeltisi içinde oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edilir.

Mikroskopi hazırlığı için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Fibroblastları steril fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın. Fibroblastlara lns dozajlamasını takiben belirlenen zaman noktalarında hücreleri soğuk, %70 metanol ile 10 dakika boyunca fikse edin.

10 dakika sonra, ters mikroskop kullanarak görüntüler yakalamadan önce metanolü fosfat tamponlu salin veya PBS ile değiştirin. Sentezlenen S SLN'ler, MTT analizi kullanılarak ortalama parçacık çapı 18,59 ve polidispersite indeksi 5,83 olan kontrol S LNS'ler ile ortalama parçacık çapı 16,87 nanometre ve polidispersite indeksi 4,47 olan Nile red yüklü SLM'ler şeklinde sonuçlanmıştır. Hücresel metabolizma üzerindeki doz yanıt etkisi ölçülmüş ve artan parçacık konsantrasyonunun hücresel canlılıkta azalmaya yol açtığı belirlenmiştir.

Yalnızca SLN'ye maruz kalan hücreler ile Nile red yüklü SLN'ye maruz kalan hücreler arasında toksisite açısından herhangi bir fark gözlemlenmemiştir. Paralel olarak hücrelerin doku kültürü polistirenine tutunmaları görsel olarak incelenmiştir. Mililitre başına beş mikrograma eşit bir doz kullanılarak, hem temsili hücresel morfolojiyi hem de floresan partiküllerin zamanla alımını göstermek amacıyla görüntüler alınmıştır.

Lipid partikül alımı, maruziyetten iki saat sonra gözlemlenmiştir. Nanopartikül inklüzyon seviyesi, fare kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (B MDC'ler) Nile red floresans yoğunluğu akış sitometrisi ile ölçülerek belirlenmiştir. Kullanılan SNS konsantrasyonu ile B MDC'lerde değerlendirilen floresans miktarı arasında doğrudan bir korelasyon gözlemlenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarının nasıl sentezleneceği, fiziksel özelliklerinin nasıl karakterize edileceği ve partikül-hücre etkileşimlerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.