Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular
17 Kasım 2015
Bu çalışmada, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarını sentezlemek için bir yöntemin yanı sıra, hücresel etkileşimlerini değerlendirmek için birkaç in vitro yöntem tanımlanmıştır.
Bu prosedürün genel amacı, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarını sentezlemek, fiziksel özelliklerini karakterize etmek ve partikül hücresi etkileşimlerini araştırmaktır. Bu, ilk olarak lipid nanopartiküllerini sentezlemek için faz ters çevirme sıcaklığı yönteminin kullanılmasıyla gerçekleştirilir. Bu işlem sırasında, lipit ve yüzey aktif madde başlangıçta birlikte eritilir.
Belirli bir miktarda su eklendikten sonra, karışım faz ayrımı gerçekleşene kadar ısıtılır. Karışım daha sonra bir nano emülsiyon oluşturulana ve katı lipid nanopartiküllerinin veya sln'nin sentezi tamamlanana kadar sürekli olarak karıştırılır. Daha sonra, parçacık boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için dinamik ışık saçılımı veya DLS kullanılır.
Diferansiyel taramalı kalorimetri veya DSC, partikülleri daha fazla karakterize etmek için erime noktasını ve gizli erime ısısını belirlemek için kullanılan ek bir tekniktir, sonuçta partikül hücresi etkileşimlerini araştırmak için floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılabilir. Bu tekniğin ultra sonikasyon mikroakışkan ve yüksek basınçlı homojenizasyon gibi mevcut yüksek enerji yöntemlerine göre ana avantajı, bunun hem basit hem de ölçeklenebilir olan nispeten yumuşak bir sentez tekniği olmasıdır. LNS'yi sentezlemek için 0.6 miligram floresan boya veya başka bir lipofilik bileşik ve 0.10 gram lineer alkan veya lipidi birleştirin.
15 mililitrelik bir şişede, bileşenleri 90 santigrat derecede eritin ve karıştırın, 0.11 gram doğrusal iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin. Daha sonra elde edilen karışımı 90 santigrat derecede karıştırın ve karıştırın. Daha sonra, karışıma 1.79 gram steril su ekleyin, 90 santigrat dereceye ısıtın ve iki faz gözlenene kadar çözeltiyi görsel olarak izleyin.
Şimdi karışımı şeffaf bir nano emülsiyon oluşana kadar karıştırın. Kontrol numunesi olarak hizmet etmek için floresan boya eklemeden paralel olarak ayrı bir nano emülsiyon hazırlayın. Her nano emülsiyonu steril bir 0,2 mikron filtre kullanarak daha fazla sterilize edin.
Numune miktarını ölçmek için partikül boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için DLS'yi kullanın Numunelerin ölçümünden önce partikül boyutunu ölçmek için bir alet tasarımında bir cam kullanarak, bilinen iki standardın partikül boyutu, üreticinin standartların hazırlanması ve ölçümü için yaptığı protokole göre ölçülmelidir. Ardından, numuneleri her biri için hazırlandığı gibi ölçün. 100 saniyelik bir çalışma süresi, suyun kırılma indisi ve 20 santigrat derecede suyun viskozitesini kullanın.
DSC kullanarak S lns'nin termal davranışını araştırmak için partikül boyutu dağılımının ortalama partikül çapını ve poli dağılımını bildirin, önce S LNS'yi yaklaşık 25 miligram kütleli 40 mikrolitrelik bir alüminyum tavaya pipetleyin. DSC taraması sırasında nem kaybını en aza indirmek için evrensel bir sıkma presi kullanarak tavayı hava geçirmez şekilde kapatın. Her nano emülsiyonu beş ila 80 santigrat derece arasında ölçmeden önce, vadinin erime noktasını ve eğrinin altındaki alanın integralini temsil ettiği DSC grafiğinden erime noktasını ve gizli erime ısısını bildirin.
DSC grafiğinde, malzeme miktarına bölünmesi, erime kültürünün gizli ısısını temsil eder. İnsan dermal fibroblastlarının kültürü için sıvı ortamda üreticinin talimatlarına göre birincil insan fibroblastları. Düşük serum büyüme takviyesi kiti ile desteklenmiş, hücreleri hem MTT hem de görüntüleme analizi tohum hücreleri için% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra% 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve alt kültürde nemlendirilmiş bir atmosferde tutun.
Kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakada. Hücrelerin SLN'ye maruz kalmadan önce gece boyunca 37 santigrat derecede dengelenmesine izin verin, sıfır zamanda istenen lipid konsantrasyonunu elde etmek için SLM'leri tam ortamda seyreltin ve 24 saatlik inkübasyondan sonra 96 oyuklu plakadaki her bir kuyuya 10 mikrolitre ekleyin, S lns ile inkübasyondan sonra, üreticinin protokolüne göre MTT testini kullanarak hücresel canlılığı belirleyin. Hücreleri bir kez yıkayın ve her birine 100 mikrolitre taze ortam ekleyin.
Taze ortamla değiştirmeden önce% 70'lik bir metanol çözeltisinde 10 dakika inkübe ederek kontrol kuyularını öldürün. MTT reaktifini mikroplakanın her bir oyuğuna oyuk başına 10 mikrolitre ekleyin ve gece boyunca inkübe ettikten sonra gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, hücre içi formu ve kristalleri sağlanan 100 mikrolitre deterjan çözeltisi ile çözündürün. Üreticinin protokolüne göre, absorbans değerlerini elde etmeden önce deterjan çözeltisindeki hücreleri oda sıcaklığında üç saat inkübe edin.
Mikroskopiye hazırlanmak için bir mikroplaka okuyucu kullanma. Fibroblastları steril fosfat şişirilmiş tuzlu su ile iki kez yıkayın. Fibroblastların lns ile dozlanmasını takiben hücreleri belirli zaman noktalarında soğuk,% 70 metanol ile 10 dakika
sabitleyin.10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntü yakalamadan önce metanolü fosfat tamponlu salin veya PBS ile değiştirin. Sentezlenen S SLN, ortalama partikül çapı 18.59 ve poli dağılımı 5.83 olan S LNS kontrolü ve ortalama partikül çapı 16.87 nanometre olan Nil kırmızı yüklü SLM'ler ve bir MTT tahlili kullanılarak 4.47 poli dispersitesi ile sonuçlandı. Hücresel metabolizma üzerindeki doz yanıtı etkisi, artan partikül konsantrasyonunun hücresel canlılıkta bir azalmaya neden olduğu durumlarda ölçüldü.
Tek başına SLN'ye maruz kalan hücreler ile Nil kırmızısı yüklü hücreler arasında toksisite açısından gözlenen bir fark yoktu. SLN. Paralel olarak hücreler doku kültürüne yapışma açısından görsel olarak incelendi. Polistiren ve görüntüler, mililitre başına beş mikrograma eşit bir doz kullanılarak, hem temsili hücresel morfolojiyi hem de zaman içinde floresan parçacıkların alımını göstermek için alındı.
Lipid partikül alımı, maruziyetten iki saat sonra gözlendi. Nanopartikül dahil etme seviyesi, murin kemik iliği türevi dendritik hücrelerde veya akış sitometrisi yoluyla B MDC'lerde Nil kırmızısı floresan yoğunluğunun ölçülmesiyle belirlendi. Kullanılan SNS konsantrasyonu ile B MDC'lerde değerlendirilen floresan miktarı arasında doğrudan bir ilişki gözlenmiştir.
Bu videoyu izledikten sonra, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarının nasıl sentezleneceğini, fiziksel özelliklerinin nasıl karakterize edileceğini ve partikül hücresi etkileşimlerinin nasıl araştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, ultra küçük biyokompatibilite nanopartikül popülasyonlarını sentezlemek ve çeşitli in vitro yöntemlerle hücresel etkileşimlerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nanopartikül sentezi
- Biyokompatibilite
- Hücresel etkileşimler
Arka Plan
- Biyolojik sistemlerde nanopartikül davranışının anlaşılması kritik öneme sahiptir.
- Biyokompatibilite nanopartiküllerin ilaç taşıma potansiyeline sahiptir.
- Nanopartiküllerin karakterizasyonu, etkili kullanımları için esastır.
- In vitro yöntemler, hücresel etkileşimler hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Ultra küçük biyokompatibilite nanopartiküller sentezlemek.
- Fiziksel özelliklerini karakterize etmek.
- Nanopartiküller ve hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nanopartikül sentezi için faz tersine dönüş sıcaklığı yöntemi.
- Lipid ve yüzey aktif maddenin birlikte eritilmesi.
- Nano emülsiyon oluşturmak için ısıtma ve faz ayırma.
- Parçacık boyutu ve polidispersiteyi ölçmek için dinamik ışık saçılması (DLS).
Ana Sonuçlar
- Ultra küçük lipid nanopartiküllerin başarılı sentezi.
- Fiziksel özelliklerin karakterizasyonu biyokompatibiliteyi doğruladı.
- In vitro yöntemler önemli hücresel etkileşimler ortaya çıkardı.
- Dinamik ışık saçılması doğru parçacık boyutu ölçümleri sağladı.
Sonuçlar
- Sentezlenen nanopartiküller biyomedikal uygulamalar için umut vericidir.
- Karakterizasyon teknikleri, nanopartikül özelliklerini değerlendirmek için etkilidir.
- In vivo etkileşimleri araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Solid lipid nanoparticles (SLNs) offer a scalable, biocompatible platform for intracellular targeting, enabling precise modulation of cellular signaling and gene expression in discovery workflows. Their synthesis via the phase inversion temperature method supports reproducible nanoparticle production for preclinical evaluation of drug delivery systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by characterizing nanoparticle-cell interactions across relevant cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled nanoparticle delivery to primary human fibroblasts and murine dendritic cells.
- Operational Value: Provides a standardized system for assessing cellular uptake and toxicity using fluorescence microscopy and flow cytometry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating nanoparticle concentration with cellular response via MTT assay and fluorescence intensity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative particle size and polydispersity data via DLS for formulation consistency in screening campaigns.
- Operational Value: Establishes biocompatible nanoparticle preparations suitable for high-throughput cellular interaction assays.
- Assay Readiness: Uses MTT assay to define non-toxic dosing ranges prior to mechanistic studies, improving assay window reliability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates intracellular targeting capability in two distinct cell types, supporting extrapolation to disease-relevant models.
- Biomarker Alignment: Facilitates fluorescent dye loading (e.g., Nile red) for tracking nanoparticle biodistribution in preclinical systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on uptake kinetics and viability thresholds observed in dose-response studies.
Pipeline & Workflow Integration
SLN synthesis and characterization fit within the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification through formulation optimization and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Tests delivery hypotheses by tracking nanoparticle internalization and cellular effects over time.
- Screening: Delivers standardized, ultra-small nanoparticles with defined size (16.87 nm) and low polydispersity (4.47) for consistent compound or probe evaluation.
- Analytics: Provides multi-parametric readouts including particle size (DLS), thermal behavior (DSC), viability (MTT), and uptake (fluorescence/flow cytometry).
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by demonstrating biocompatibility and cellular interaction in primary human and murine cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular nanoparticle platform adaptable to various lipophilic payloads for repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in delivery studies by correlating nanoparticle dose with cellular response.
- Operational Value: Enables reproducible synthesis via a simple, scalable phase inversion temperature method without high-energy equipment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing late-stage failure through early assessment of nanoparticle-cell interactions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery systems based on uptake efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid-based nanoparticle formulation and phase behavior analysis.
- Dependent on access to DLS, DSC, fluorescence microscopy, and flow cytometry for characterization.
- Necessitates standardized cell culture protocols for primary human dermal fibroblasts and murine dendritic cells.
- Requires optimization of surfactant-lipid ratios and aqueous phase volume for reproducible nanoemulsion formation.
- Limited to lipophilic payloads due to the lipid matrix encapsulation mechanism of SLNs.
