Analizi Yersinia enterocolitica Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, vernia tip üç sekresyon sistemi yoluyla konakçı hücrelere efektör protein translokasyonunu ölçmektir. Bu, efektör füzyonlarının HELOC hücrelerine translokasyonuna izin vermek için heela hücrelerinin, efektör TEM bir beta laktamaz füzyonunu eksprese eden yersinia mutantları ile inkübe edilmesiyle elde edilir. İkinci bir adım olarak, enfekte HELOC hücreleri, hücresel estro tarafından floresan CCF dörtte yüklü olana işlenen ve böylece hücre içinde hapsedilen bir hücre permean fret raportör bileşiği ile yüklenir.

CCF dördünün trans yerleşimli beta-laktamaz tarafından bir sonraki bölünmesi, verici ve alıcı floresan yoğunluklarını analiz etmek için lazer tarama mikroskobu ile kaydedilen fre'nin bozulmasına neden olur. Sonuçlar, donör floresan artışının farklı kinetiğine dayalı olarak farklı miktarlarda trans yerleşimli efektör TEM bir beta laktamaz füzyonunu göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre ana avantajlarından biri, CCF dört bileşiğinin hücreler arası işlenmesinin, translokasyonu ölçmek için oldukça spesifik ve hassas bir araç sağlamasıdır.

Yöntem, bakteriyel patogenez alanında, enfeksiyondan bir gün önce bakteri ve konakçı hücrelerin etkileşimi sırasında translokasyonun nasıl ince ayarlandığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Üç mililitre LB ortamı ve gerekli antibiyotikleri içeren üç ayrı şişeyi, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan dönüştürülmüş Y enterocolitica suşlarının her birinden bir koloni ile aşılayın. Ayrıca, enfeksiyondan bir gün önce 200 mikrolitre kültür ortamında 15.000 hücreyi 96 oyuklu bir plakanın dokuz oyuğuna ekerek topuk hücreleri içeren plakalar hazırlayın, hücreleri enfeksiyon gününde 37 santigrat derecede% 5'lik bir CO2 inkübatörde inkübe edin.

Gece boyunca kültürün iki mililitresini antibiyotik kullanmadan 40 mililitre taze lb ortama aşılayın. Bakterileri 180 RPM'de bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Bu, 90 dakika sonra tip üç sekresyon sisteminin ekspresyonunu indükleyecek, kültürleri taze bir tüpe aktaracak ve kültürleri buz üzerinde tutacaktır.

Bu noktadan itibaren. Bakterileri peletlemek için kültürleri 5.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, peleti iki ila üç mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın, bakteri süspansiyonunu mililitre başına 800 milyon koloni oluşturan birim konsantrasyona seyreltin ve ardından kültürleri buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra her bir kültürün karşılık gelen optik yoğunluğunu belirleyin. Her suştan 3.5 mikrolitre bakteri süspansiyonunu hazırlanan 96'nın farklı kuyucuklarına ekleyin. Ortamı iki kez hafifçe pipetleyerek iyice kaplayın ve karıştırın, bakterilerin hücre başına yaklaşık 100 bakterilik bir enfeksiyon motiyonunda hücrelere tortu bırakmasına izin verin.

Enfeksiyonları 30 dakikalık aralıklarla başlatarak ve hücreleri 37 santigrat derecede %5 CO2 odasında tutarak bir zaman seyri gerçekleştirin. Her enfeksiyondan sonra, ilk enfeksiyondan 90 dakika sonra, hela hücrelerinin hiçbirini çıkarmadan ortamı dikkatlice aspire edin. Daha sonra mililitre başına 20 mikrogram kloramfenikol ve 2.5 milimolar pronik içeren 50 mikrolitre PBS ekleyin.

Bu, efektörlerin ekspresyonunu durduracak ve CCF dördünün ihracatını azaltacaktır. Mikroskopi hazırlamak için, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak daldırma ortamını kuyuların dibine yayarak sürekli daldırma sağlayın. Daldırma ortamında herhangi bir hava kabarcığı sıkıştırmaktan kaçının.

Daha sonra 96 oyuklu plakayı mikroskop aşamasına aktarın ve her birinde daha sonra analiz için uygun noktaları bulun. Bu adımı 10 dakika içinde bitirin. Daha sonra her birine 70 mikrolitre CF 4:00 yükleme solüsyonu ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, yükleme çözeltisini aspire edin ve mililitre kloramfenikol başına 20 mikrogram ve 2.5 milimolar pronik içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin. Ardından hızla mikroskobu başlatın.

20 kat büyütmeli yüksek sayısal diyaframlı daldırma objektifini yerine yerleştirin ve dedektör iğne deliğini 2,5 havadar birime açın ve 96 oyuklu plakayı konfokal lazer tarama aşamasına aktarın. Ardından, aynı anda aktif verici ve alıcı kanallara sahip yüksek hassasiyetli galyum arsenit fosfat dedektörlerini seçin. Sekiz bit derinlikli üç katlı kare ortalaması ve 405 nanometre diyot lazerin %10'u ile uyarın.

Doğru nicelemeyi sağlamak için, her iki kanalın dedektör kazancını aynı değere ayarlayın ve doymuş piksellerden kaçının. Ardından, iletilen ışığı etkinleştirin ve temsili görüş alanlarını her birinde yeniden kontrol edin, kalibre edilmiş bir otomatik aşama kullanarak konumları gerektiği gibi iyi ayarlayın ve yeniden kaydedin. Son olarak, zaman atlamasını iki dakikaya, süreyi iki saate ayarlayın ve görüntüleri almaya başlayın.

Görüntü alımının ardından, veri kümesini piksel matrislerinin aritmetik hesaplamalarına izin veren bir yazılıma aktarın. Önce menüye tıklayarak aynı ofseti kullanarak her iki kanaldaki arka planı çıkarın ve ardından görüntü işlemeye gidin ve temel çıkarmayı seçin. Ardından her bir kanalı seçin ve taban çizgisi değerini girin.

Donör kanalın kanamasını düzeltin, önceden belirlenmiş düzeltme faktörü ile birinci kanalı alıcı kanal iki kanalına yerleştirin ve bu amaçla yeni bir kanal kanalı iki ana kanal oluşturun. Menüye tıklayın ve ardından görüntü işlemeyi ve ardından kanal Aritmetiği'ni seçin ve ikinci kanalın mutlak değerini 33 kez nokta ile çıkarılarak girin. Daha sonra birinci kanal, ikinci kanalı silin ve düzeltilmiş Kabul Edici kanalından geçen taşma payının yeni kanal iki olarak kaldığından emin olun.

Ardından, bağıl perde katsayısını belirlemek için burada gösterilen işlemle yeni bir kanal oluşturun. Ardından, kanal aritmetiği menüsüne geri dönün ve perde kanalının düzgün bir şekilde görselleştirilmesi için kanal iki'yi kanal bir artı kanal ikiye bölünerek girin. Sekiz bitlik bir görüntüde, üçüncü kanalın 255 katına eşit olan dördüncü bir kanal kanal dört oluşturun.

Görüntü özellikleri menüsüne giderek kanal rengini değiştirin, dördüncü kanalı seçin, ardından eşlenmiş rengi, ardından renk tablosu dosyasını seçin ve jet'i seçin. Ardından, üçüncü ve dördüncü kanallara üçe üç medyan filtre uygulayın. Bu, görüntü işleme menüsüne girerek ve yumuşatmayı seçerek görüntülerdeki gürültüyü azaltacaktır.

Medyan filtrenin ardından, her iki kanalı da seçin ve hücresel sinyallerin nicelleştirilmesi için üçe üçer birer bir filtre boyutu uygulayın. Görünümü aş'ı seçerek ve simgeye tıklayarak dördüncü kanaldaki hücreleri tespit edin. Yeni yüzeyler ekleyin.

Yüzey penceresinde algılama algoritması parametrelerini tanımlayın ve iki onay kutusunu etkinleştirin. Yalnızca bir ilgi alanını segmentlere ayırın ve görüntünün tamamını işleyin. Son olarak, daha sonra, boyutlarını düzenleyerek ilgilenilen bölgeyi tanımlayın.

Kaynak kanal olarak dördüncü kanalı seçin ve eşikleme menüsüne gidip arka plan çıkarmada öğesini seçerek eşiği ayarlayın. Çapı 10 mikrometreye, minimum yoğunluk eşiğini manuel olarak sıfıra ve maksimum eşiği maksimum yoğunluğa ayarlayın. Yapıları alana göre filtreleyin ve minimum değeri 187 mikrometre kare olarak ayarlayın.

Ardından yüzey algılamayı bitirin. Son olarak, birinci kanaldaki donör floresan yoğunluğu ve üçüncü kanaldaki bağıl fret katsayısı için ortalama değerleri, hücresel varlıktaki standart sapmalarıyla birlikte çıkarın. Bu yöntemin hedef hücrelere efektör translokasyonunu kantitatif olarak analiz etme yeteneğini göstermek için, hem donör floresan hem de nispi fret katsayıları kullanılarak farklı translokasyon kinetiklerine sahip iki yersinia suşu incelendi.

Vahşi tip enfekte hücreler zamanla floresan yoğunluğunda bir artış gösterir. Beklendiği gibi, floresan yoğunluğunun maksimum eğimi, enfeksiyonun uzunluğu ile pozitif olarak ilişkilidir, bu da farklı çevrilmiş beta laktamaz konsantrasyonlarının önceki çalışmalara göre ayırt edilebileceğini gösterir. Yersinia YOPE delesyon mutantı ile enfekte olmuş hücreler, vahşi tip suşa kıyasla daha hızlı floresan yoğunluğu artışı sergiler.

İlginç bir şekilde, enfeksiyonu 90 dakikaya genişletmek, 60 dakikalık enfeksiyona kıyasla donör floresansının yükselişini daha da hızlandırmadı Bu prosedürü denerken, CCR dört bileşiğinin işlenmesinin eklenmesinden hemen sonra başladığını akılda tutmak önemlidir. Bu nedenle, görüntü alımına zamanında başlamak önemlidir.