Name: Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal yollarına müdahalesini ayırt etmek için uyarlanabilir ifade sistemleri kullanarak. Bu yöntem apoptoz ve diğer hücre ölümü mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) aracılığıyla A.L. ve C.B.'ye ve ERA-NET PathoGenoMics 3. çağrı aracılığıyla A.L.'ye yapılmıştır.

Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim <ol><li> Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco&#39;s GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücrelerin tekrar süspansiyon. Yeni 75 cm 2 hücre kültürü şişesi içine pipetle 1 ml 14 mi ortamı eklenir. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını analiz. </li><li> Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum HEK293 hücreleri, 24 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Transfeksiyon için transfeksiyon reaktif üreticisi tarafından sağlanan protokolünü kullanır. Transfeksiyon ayıracı kullanılarak pEGFP-C2 ya da pEGFP-C2-CaeB olan hücreleri transfekte. Kullanmak transfeksiyon extra pure ısınmak için önceent ve RT için gerekli ortam. DNA transfeksiyon reaktifi: 1 oranını 3 kullanın. <ol><li> Ayrıntılı olarak, bir pipet ile doğrudan serumsuz DMEM ortamı içinde 50 ul transfeksiyon reaktifi 1.5 ul. Kompleks oluşumu için, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden karışıma kodlayan DNA, GFP ya da GFP-CaeB 0.5 mg pipet ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Bir damla damla bir tarzda, reaksiyon karışımı ekleyerek hücreleri transfekte ve 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> 1 mg ekleme /% 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de GFP-pozitif klonların seçilmesi için geneticin&#39;e ml. </li><li> : 1 oranında 6 gün sonra, 1, orta ve HEK293 süpernatan barındıran bir 96-çukurlu plaka içinde sıralama akış sitometrisi ile, tek hücrelerin izole eder. 4966 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj edildi kültürlenmiş konfluent HEK293 hücrelerinden HEK293 süpernatant oluşturur. </li><li> Ertesi gün, ortam 1,5 ihtiva eden kültür ortamı yerine0 mg / ml genetisin. Haftada bir kez medya değiştirin. Hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için, bir 24-çukurlu plaka aktarın. 1.5 mg / ml genetisin içeren ortamda 5: 1 arasındaki bir oranda, haftada iki kez hücreleri alt yetiştirirler. Son olarak, bağışıklık beneklenme analizi ile GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi analiz etmek ve akış sitometrisi. </li></ol> Bağışıklık beneklenme analizi ile kararlı hücre kuşaklarının 2. analizi <ol><li> Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C &#39;de 5 ila 95 ° C&#39;de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın. </li><li> PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0 gözenek boyutu.Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde 45 um). </li><li> PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar. </li><li> MPT 4 ml anti-GFP antikorunun 4 ul seyreltilir ve 4 ° C&#39;de membranlar O / N inkübe edin. </li><li> 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları. </li><li> MPT 4 ml yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor, 0.8 ul membranlar inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (2.6 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın. </li></ol> 3. Bir Akış Sitometreyi Kullanarak Hücreleri analiz edin. <ol><li> PBS hücrelerin tekrar. Ileri sc ayarlamak için negatif kontrol olarak HEK293 hücreleri kullanınardıl (FSC) ve yan dağılım (SSC) hücreleri ölçekte böylece. Hücre çiftleri, agrega ve hücre artıkları dışlayarak canlı hücrelerin üzerinde bir kapı çizin. </li><li> Lekesiz hücreler çok FL1 kanalı (488 nm argon lazer) için histogram soldaki böylece photomultiplier tüp (PMT) kazanç ayarlayın. </li><li> HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinin floresan yoğunluğu analiz etmek FL1 kanalının histogram açıp kapı nüfus 10.000 olayları kazanır. </li><li> Ticari FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz. </li></ol> Uyarımlı Ekspresyon Vektör Sistemi ile Sabit bir Hücre Serisinin 4. transfeksiyonu <ol><li> Tohum HEK293 hücreleri / oyuk 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde GFP ya da GFP-ifade eden CaeB. </li><li> 19 saat sonrası tohumlama, regülatör plazmid ve tepki plazmid ya kodlayan Bax veya aktive kaspaz 3 ile hücreleri co-transfect. <ol><li> Stabil HEK293 hücrelerinin birlikte transfekte edilmesipWHE125-P regülatörü plazmid 100 ng (Şekil 2) ve yanıt plazmid pWHE655-hBax ya pWHE655-revCasp3 (Şekil 3) ve polietilenimin 0.4 ul, 100 ng. </li><li> Opti-MEM ortamı 75 ul DNA ve polietilenimin transfeksiyon reaktifi, her hazırlama ve oda sıcaklığında tam olarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Kompleks oluşumu için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca her iki karışımları birlikte inkübe edilir. </li></ol></li><li> Polietilenimin / DNA solüsyonu damla damla hücrelere ilave edin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Apoptoz 5. İndüksiyon <ol><li> Post-transfeksiyon 5 saat, kültür ortamına 1 ug / ml doksisiklin ilavesiyle pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükler. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe hücreleri. </li></ol> İmmünoblot Analizi Ana Hücre Apoptoz 6. Analizi <ol><li> H öncesinde hücrelerin kontrol edinışık mikroskobu altında arvesting hücre ölümü indüksiyonu için kontrol edin. Apoptotik hücreler ölüyor hücreyi çevreleyen apoptotik cisimlerin varlığıyla algılanabilir vardır. </li><li> Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C &#39;de 5 ila 95 ° C&#39;de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın. </li><li> Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0.45 um gözenek boyutu). </li><li> PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar. </li><li> 4 μ seyreltinMPT 4 ml anti-ayrıldı poli ADP-riboz polimeraz (PARP) antikorun L ve 4 ° C de O / N inkübe edin. </li><li> 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları. </li><li> 4 mi MPT içinde seyreltilmiş 0.8 ul yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile membranlar inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (6.7 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın. </li><li> 7 mi Western Blot Sıyırma Tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek suretiyle bağlanan antikorlar çıkarın. </li><li> PBS ile üç yıkamadan /% 0.05 (6.7 de tarif edildiği gibi), Tween 20 sonra, 4 ° C&#39;de MPT O / N 4 ml anti-aktin antikor 4 ul membranlar prob. </li><li> (6.7 de tarif edildiği gibi) MPT üç yıkama aşamasından sonra, ho, 0.8 ul membranlar inküberseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor MPT 4 ml seyreltilmiştir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra,% 0.05 / PBS ile membranlar 6.7 de tarif edildiği gibi Tween 20 (üç defa yıkamak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için bir film gelişimi için standart donanım uygulayın. Not: Tüm bekletme işlemleri, belirtilen süre ve sıcaklıkta, bir plaka karıştırıcısı üzerinde gerçekleştirilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Galán, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
<li>Banga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+inhibits+macrophage+apoptosis+by+targeting+pro-death+members+of+the+Bcl2+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).</li>
<li>Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legionella+pneumophila-translocated+substrate+that+is+required+for+growth+within+macrophages+and+protection+from+host+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).</li>
<li>Schmid, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translocated+bacterial+protein+protects+vascular+endothelial+cells+from+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis.</a> PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).</li>
<li>Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pathogen-induced+apoptosis+by+a+Coxiella+burnetiitype+IV+effector+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).</li>
<li>Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+pathogens+and+mitochondrial+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).</li>
<li>Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+type+IV+secretion+system+substrate+CaeB+inhibits+intrinsic+apoptosis+at+the+mitochondrial+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level.</a> Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).</li>
<li>Raymond, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+trafficking%2C+apoptosis%2C+and+innate+immunity+by+type+III+secretion+system+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors.</a> Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).</li>
<li>Eckart, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiapoptotic+activity+of+Coxiella+burnetii+effector+protein+AnkG+is+controlled+by+p32-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking.</a> Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).</li>
<li>Byrne, G. I., Ojcius, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+and+apoptosis%3A+life+and+death+decisions+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).</li>
<li>Delft, M. F., Huang, D. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Bcl-2+family+of+proteins+interact+to+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis.</a> Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).</li>
<li>Willis, S. N., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+the+balance%3A+how+BH3-only+proteins+induce+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).</li>
<li>Cory, S., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl2+family%3A+regulators+of+the+cellular+life-or-death+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch.</a> Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).</li>
<li>Adams, J. M., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosomes%3A+engines+for+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosomes: engines for caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).</li>
<li>Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xk-related+protein+8+and+CED-8+promote+phosphatidylserine+exposure+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells.</a> Science. 341 (6144), 403-406 (2013).</li>
<li>Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+throes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell death throes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).</li>
<li>Enari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-activated+DNase+that+degrades+DNA+during+apoptosis%2C+and+its+inhibitor+ICAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD.</a> Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).</li>
<li>Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mammalian+gene+regulation+concepts+on+functional+genomic+research%2C+metabolic+engineering%2C+and+advanced+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies.</a> Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).</li>
<li>Felsher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+oncogene-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Reversibility of oncogene-induced cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Kozlova, E. N., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+differentiation+of+stem+cells+in+vivo+by+tetracycline-controlled+expression+of+key+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors.</a> Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).</li>
<li>Reijmers, L., Mayford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+active+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic control of active neural circuits.</a> Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hillen, W., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+expression+of+Tn10+.encoded+tetracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance.</a> Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).</li>
<li>Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-reversible+silencing+of+eukaryotic+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters.</a> Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mouse+strain%2C+position+of+integration+and+tetracycline+analogue+on+the+tetracycline+conditional+system+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice.</a> Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).</li>
<li>Rang, A., Will, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetracycline-responsive+promoter+contains+functional+interferon-inducible+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements.</a> Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).</li>
<li>Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetracycline+controlled+activation%2Frepression+system+with+increased+potential+for+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.</a> J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).</li>
<li>Knott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+conditional+suicide+switch+using+doxycycline-dependent+expression+of+human+tBid%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid.</a> Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).</li>
<li>Danilchanka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+channel+protein+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+exotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).</li>
<li>Danke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjusting+transgene+expression+levels+in+lymphocytes+with+a+set+of+inducible+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters.</a> J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).</li>
<li>Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+rapid+and+slow+induction+of+apoptosis+obtained+by+inducible+expression+of+pro-apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins.</a> Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+constitutively+active+recombinant+caspases-3+and+-6+by+rearrangement+of+their+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).</li>
<li>Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+two+gene+activities+by+tetracycline+via+a+bidirectional+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter.</a> Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).</li>
<li>Anastassiadis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictable+ligand+regulated+expression+strategy+for+stably+integrated+transgenes+in+mammalian+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture.</a> Gene. 298 (2), 159-172 (2002).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneity+and+long-term+stability+of+tetracycline-regulated+gene+expression+with+low+basal+activity+by+using+the+rtTA2S-M2+transactivator+and+insulator-flanked+reporter+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors.</a> Gene. 327 (1), 61-73 (2004).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Agha-Mohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+tetracycline-regulatable+promoter%3A+repositioned+tet+operator+elements+optimize+transactivator+synergy+while+shorter+minimal+promoter+offers+tight+basal+leakiness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness.</a> J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).</li>
<li>Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+transgene+expression+by+lentivirus+vectors+containing+second-generation+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters.</a> J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).</li>
<li>Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetracycline-dependent+expression+vector+with+low+basal+expression+and+potent+regulatory+properties+in+various+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).</li>
<li>Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Tet-responsive+promoters+with+minimized+background+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression.</a> BMC Biotechnol. 10, 81(2010).</li>
<li>Heinz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+and+transposon-based+tet-regulated+all-in-one+vectors+with+reduced+background+expression+and+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).</li>
<li>Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+transcription+regulatory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems.</a> Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).</li>
<li>Ye, H., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+gene+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birçok patojen bakteri salgılar veya konakçı hücreye bakteri efektör proteinleri yerini değiştirmek için salgılama sistemleri liman. Bu efektör proteinler bakteriler hayatta ve ilgili hücre içi niş içinde kopyalanmasına olanak tanıyan, konakçı hücre süreçleri ve yolların modüle kapasitesine sahiptir. Biyokimyasal faaliyetler ve efektör proteinlerin moleküler mekanizmaların anlaşılması patojenite daha iyi anlaşılmasına yönelik yardımcı olacak ve bu hastalıkla mücadele için yeni tedavi araçları geliştirmek için yardımcı o...

birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler 1 temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi 2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur. Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon 10 immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü 11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom 15 kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi 16 fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin 17,18. Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi 19 kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık 20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan 24 indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya 24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR 25 füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto 24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin 25 bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların 20,23,24 kontrol edilebilir. TTA&#39;nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda 27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA 28 (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin 29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA 28 bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) 30 TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri 31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir. Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Poliscienleri</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Hücre</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Önceden Boyanmış Protein Merdiveni</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&nbsp;</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>bölünme önleyici PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-aktin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG (H + L) -HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG (H + L) -HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus Western Blot Sıyırma Tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

bir uyarılabilir İfade sistemi uygulamak hücre içi sinyali ile bakteriyel virulans faktörler girişim eğitim için

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Burada sunulan teknik, bir sinyal yolunun bileşenleri ile etkileşime girer, biri bir hedef proteini ya da alternatif olarak, küçük bir molekül adım analiz etmeyi sağlar. yöntem dayanır, bir yandan, belirli bir proteinin endüklenebilir ifadesi üzerindeki seçilen sinyalleşme kademeli olarak tanımlanmış ve önceden tespit edilmiş bir aşamada bir sinyal olayını gerçekleştirmek için kullanılır. Ifade edilen hedef proteinin aktivitesi elde edilen sinyal yolunun okumaya bağlı olarak, yukanya doğru yer alan veya başlatılan sinyal olayının alt baş halinde birlikte ifadesi, diğer yandan, söz konusu genin, sonra araştırmacı değerlendirmelerini sağlar. Burada, apoptotik kaskad protokolü özelliğe göstermek için belirli bir sinyal yolu olarak seçilmiştir. Böyle Coxiella burnetii gibi patojenik bakteriler, hücre içinde bakteri hayatta kalmasını sağlamak için konak hücreye konak hücre ölümü indüksiyon müdahale efektör proteinleri yerini değiştirmek ve geliştirmek için onlarınOrganizmada yaygınlaştırılması. C. burnetii&#39;nin efektör protein, CaeB etkili bir UV ışığı veya staurosporin ile apoptoz indüksiyonu sonrasında konakçı hücre ölümünü engeller. Adım CaeB apoptotik sinyalin yayılma müdahale ettiği daraltmak için, iyi karakterize edilmiş, pro-apoptotik etkinliğe sahip seçilen proteinler doksisiklin indüklenebilir bir şekilde geçici olarak ifade edilmiştir. CaeB Bu proteinlerin yukarı hareket ederse, apoptoz engelsiz devam edecektir. CaeB aşağı hareket ederse, hücre ölümü önlenir. seçilen test proteinleri büyük cellat proteazıdır mitokondri düzeyi ve kaspaz 3, en davranır Bax idi. CaeB Bax ifadesi ile indüklenen hücre ölümü engeller, ama kaspaz 3 sentezlenmesiyle. CaeB, bu şekilde, bu iki protein arasında apoptotik kaskad ile etkileşime girer.

İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Ancak, bu deney belirleyemiyor. Bu ...

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyalizasyonla olan etkileşimini incelemektir. Bu, ilgilenilen proteinin eksprese edildiği stabil hücre hatları oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, proteinin aktivitesini toplu hücre düzeyinde incelemek için, konak hücre sinyalizasyon kaskadının belirli bir basamağında aktive edilmesine olanak tanıyan indükleyebileceğir bir ekspresyon vektör sistemi kurulur. Ardından, ilgilenilen proteinin aktivite noktasını daraltmak amacıyla, bu proteinin konak hücre sinyalizasyon kaskadının aktivasyonuna müdahale edip edemeyeceği analiz edilecektir; western blotting analizi sonuçları, cozy yellow Burnett virülans faktörü KA B'nin, BAK'ın aşağısında ve kaspaz 3 aktivasyonunun yukarısındaki apoptotik kaskada müdahale ettiğini göstermektedir.Bu yöntem, belirli bir bakteriyel efektör proteinin bir sinyal iletim kaskadında hangi kritik adımda müdahale ettiğinin belirlenmesi gibi, enfeksiyöz biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, yalnızca patojenik mikroorganizmaların konakçılarını nasıl manipüle ettiğini daha iyi anlamamıza değil, aynı zamanda bu temel hücresel süreçlerin nasıl çalıştığını anlamamıza da yardımcı olacaktır. Bu yöntem, apoptotik hücre ölümünün gerçekleşmesini önlemeye yönelik bakteriyel stratejilere dair içgörü sağlayabildiği gibi, hücre ölümü alanındaki diğer sinyal iletim sistemlerine (nekroptoz veya piroptoz gibi) veya hücre proliferasyonu, gen regülasyonu ya da bağışıklık sistemi reaksiyonlarında yer alan sinyal ağlarına da uygulanabilir.Bu prosedür, Mann laboratuvarından lisansüstü öğrencisi Stephanie Besler tarafından gerçekleştirilecektir. İşleme, GFP veya GFP-say B'yi stabil olarak eksprese eden HEK 2 93 hücrelerini, her kuyucukta 100.000 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 12 kuyucuklu bir plakaya ekerek başlayın.Ardından, DNA'yı ve polietilen transfeksiyon reaktifini ayrı ayrı 75 µL opt medyum içerisinde hazırlayın ve kompleks oluşumu için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her iki karışımı birlikte oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bunun ardından, polietilen DNA çözeltisini hücrelere damla damla ekleyin ve 37 °C'de %5 karbon dioksit ortamında inkübe edin.Transfeksiyondan beş saat sonra, kültür ortamına mililitre başına bir mikrogram doksisiklin ekleyerek pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükleyin. Ardından hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda, ışık mikroskobu altında 18 saat boyunca inkübe edin. Hasat öncesinde hücrelerde hücre ölümü indüksiyonu olup olmadığını kontrol edin.Apoptotik cisimlerin varlığıyla tespit edilebilen indüklenmiş apoptotik hücreleri inceleyin. Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve yapışmış hücreleri yıkayın. Hücreleri bir kez ılık PBS ile yıkadıktan sonra 100 µL 2x Laemmli örnek tamponu içinde yeniden süspande edin.Ardından beş dakika boyunca 95 °C'de ısıtın ve daha sonraki kullanımlar için -20 °C'de saklayın. Sonrasında, moleküler ağırlık belirteci olarak ticari bir protein merdiveninden 6 µL yükleyin. Ardından, %12 SDS page jeline örnek başına yaklaşık 40.000 hücre yükleyin.Jelleri, bir kat laly yürütme tamponu ile 180 volt sabit gerilim altında 45 ila 60 dakika boyunca bir jel elektroforez sisteminde yürütün. Ardından, proteinleri PVDF membranlara 16 volt sabit gerilimde 60 dakika boyunca aktarın. Bunun için bir trans blot SD yarı-kuru transfer hücresi kullanın, ardından membranları oda sıcaklığında bir saat boyunca 10 mililitre MPT içinde bloke edin.Yedi mikrolitre anti cleaved PARP antikorunu yedi mililitre MPT içinde seyreltin. PVDF membranı antikor çözeltisi ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Antikor çözeltisini uzaklaştırın ve PBS 0.05%Tween 20 ile üç kez 10 dakikalık yıkama işlemi gerçekleştirin; inkübasyonun ardından membranları, yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1.4 mikrolitre horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Membranları üç kez PBS 0.05%Tween 20 ile yıkayın, horseradish peroxidase aktivitesini üretici protokolüne uygun olarak ticari bir kit ile tespit edin. Protein bantlarını görüntülemek için film geliştirme amacıyla standart ekipman kullanın. Ardından, membranları üç kez PBS 0.05%Tween 20 ile yıkadıktan sonra, bağlanmış antikorları uzaklaştırmak için membranları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yedi mililitre western blot stripping tamponu ile inkübe edin; membranları, dört santigrat derecede gece boyunca dört mililitre MPT içinde dört mikrolitre anti actin antikoru ile probe edin.Ertesi gün, membranları yaklaşık 10 mililitre %0,05 Tween 20 içeren PBS ile üç kez 10 dakikalık yıkama aşamalarından geçirin, ardından membranları yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1,4 mikrolitre horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Membranları %0,05 Tween 20 içeren PBS ile üç kez yıkayın, horseradish peroksidaz aktivitesini ticari bir kit ile tespit edin ve protein bantlarını görselleştirmek için standart film geliştirme ekipmanlarını uygulayın. Bu deneyde, stabil ekspresyonu göstermek için HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin tüm hücre lizatları GFP için immünoblotlandı.HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi, GFP ekspresyonunun yoğunluğunu göstermektedir. İntrinsik apoptozu indüklemek için HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücreleri altı saat boyunca dört mikromolar sporin ile tedavi edilmiştir. Apoptoz, cleaved PARP immünoblot analizi ile incelenmiş ve PARP cleavage düzeyinin HK 2 9 3 GFP SA B hücrelerinde, HK 2 93 GFP hücrelerine kıyasla azaldığı tespit edilmiştir.CB, bax kaynaklı apoptozdan korur ancak caspase three kaynaklı apoptozdan korumaz. Bu prosedürü uygularken, etkileşim aşamasının tanımlanmasına yardımcı olmak için sinyal yolunun mümkün olduğunca çok bileşenini incelemek önemlidir. Ayrıca, seçilen efektör proteinin yolun kendisine mi yoksa bu prosedürü takip eden aktivasyon aşamasına mı müdahale ettiğini belirlemek için proteinlerin hem bazal hem de aktive olmuş durumlarında test edilmesi faydalıdır.Bu mikrobiyal efektörlerin normal konak hücre fizyolojisini manipüle etmek için kullandıkları kesin moleküler mekanizmalar nelerdir ve bu durum patojenin hayatta kalmasına ve yayılmasına nasıl yardımcı olur gibi ek soruları yanıtlamak için; knockdown, knockout, maya iki hibrid pull-down, post-translasyonel modifikasyon veya proteolitik stabilite analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Berens, C. ve diğerleri. Bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal ile girişimini incelemek için indüklenebilir bir ifade sistemi uygulamak. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bakteriyel efektör protein CaeB'nin konak apoptotik kaskadını nerede bozduğunu belirlemek için indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Tetrasiklin-tepkili bir sistemle CaeB-eksprese eden hücrelerin transfekte edilmesi, pro-apoptotik gen ekspresyonunu indüke etmek ve zincir içindeki...

İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Bu video, ilgilenilen bir gen ve düzenleyici bir plazmid içeren bir plazmit ile transfeksiyon yoluyla kültürlenmiş hücrelerde gen ekspresyonunu düzenleme yöntemini açıklar. Bu plazmitin ekspresyonu, tetrasiklin veya sentetik analogları tarafından kontrol edilebilir, bu da bu sistemi düzenlenebilir gen ekspresyonunu incelemek için yararlı bir model haline getirir.

İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Tarif edilen hidrofobik kokültivasyon sistemi, metal örgülü elekler ile bozulmamış bitkileri destekler ve bunları bakteriler ile birlikte yetiştirir. Bitki dokuları, bakteriler ve salgılanan moleküller daha sonra aşağı akış analizleri için ayrıca hasat edilebilmekte, aynı anda her iki bitki barınağının ve etkileşen mikropların veya mikrobiyolojilerin moleküler tepkileri araştırılabilmektedir.

Bitki / Mikrop Moleküler Etkileşimlerinin ve Sinyalizasyonunun Eşzamanlı ve Sistematik Analizi için Hidroponik Birlikte Yetiştirme Sistemi

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Öğrenin bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal yollarına müdahalesini ayırt etmek için uyarlanabilir ifade sistemleri kullanarak. Bu yöntem apoptoz ve diğer hücre ölümü mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Daha fazla video keşfet