Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyalleme ile etkileşimini incelemektir. Bu, ilgilenilen proteini ifade eden kararlı hücre hatları oluşturarak elde edilir İkinci bir adım olarak toplu hücre seviyesindeki aktivitesini incelemek için, tanımlanmış bir adımda bir konak hücre sinyal kaskadını aktive etmeye izin veren indüklenebilir bir ekspresyon vektör sistemi oluşturulur. Daha sonra, ilgilenilen proteinin, ilgilenilen proteinin aktivite noktasını daraltmak için konak hücre sinyal kaskadının aktivasyonuna müdahale edip edemeyeceği analiz edilecektir, sonuçlar, rahat sarı Burnett virülans faktörü KA B'nin, batı blot analizine dayalı olarak apoptotik kaskad aşağı akışa müdahale ettiğini göstermektedir.

Bu yöntem, belirli bir bakteriyel efektör proteinin müdahale ettiği bir sinyal iletim kaskadındaki anahtar adımın belirlenmesi gibi bulaşıcı biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, yalnızca patojenik mikroorganizmaların konakçılarını nasıl manipüle ettiğini değil, aynı zamanda bu temel hücresel süreçlerin nasıl işlediğini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntem, apoptotik hücre ölümünün meydana gelmesini önlemek için bakteri stratejileri hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre ölümü alanındaki ons veya piropitoz gibi diğer sinyal iletim sistemlerine veya ayrıca hücre proliferasyonu, gen regülasyonu veya bağışıklık sistemi tarafından reaksiyonlarda yer alan sinyal ağlarına da uygulanabilir.

Bu prosedürü göstermek, Mann'ın laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Stephanie Besler olacaktır. Bu prosedüre, GFP veya GFP'yi kararlı bir şekilde ifade eden HEK 2 93 hücrelerini tohumlayarak başlayın, örneğin 12'de B. Kuyu başına 100.000 hücre yoğunluğunda kuyu plakası.

Daha sonra, DNA ve polietilen ortalama transfeksiyon reaktifini 75 mikrolitre opt ortamında ayrı ayrı hazırlayın ve kompleks oluşumu için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her iki karışımı da oda sıcaklığında 15 dakika birlikte inkübe edin. Bundan sonra, polietilen DNA çözeltisini hücrelere damla damla ekleyin ve% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Transfeksiyondan beş saat sonra, kültür ortamına mililitre doksisiklin başına bir mikrogram ekleyerek pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükleyin. Daha sonra hücreleri ışık mikroskobu altında% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. Hasattan önce hücreleri hücre ölümü indüksiyonu açısından inceleyin.

Apoptotik cisimlerin varlığı ile tespit edilebilen indüklenmiş apoptotik hücreleri inceleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve yapışan hücreleri yıkayın. Sıcak PBS ile bir kez, hücreleri 100 mikrolitre iki x lamby numune tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve daha sonra kullanım için eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bundan sonra, moleküler ağırlık belirteci olarak altı mikrolitre ticari bir protein merdiveni yükleyin. Ardından, %12'lik bir SDS sayfa jeli üzerine numune başına yaklaşık 40.000 hücre yükleyin.

Jelfleri bir jel elektroforez sisteminde 180 voltluk sabit bir voltaj altında 45 ila 60 dakika boyunca bir x laly çalışan tampon ile çalıştırın. Daha sonra, proteinleri 60 dakika boyunca 16 voltluk sabit bir voltajda PVDF membranlarına BLO'layın. Bir trans blot SD yarı kuru transfer hücresi kullanarak, zarları oda sıcaklığında bir saat boyunca 10 mililitre MPT'de bloke edin.

Yedi mikrolitre anti bölünme önleyici PARP antikorunu yedi mililitre MPT ile seyreltin. PVDF membranını antikor çözeltisi ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Antikor çözeltisini çıkarın ve PBS% 0.05 Tween 20 ile 10 dakikalık üç yıkama yapın, membranları inkübasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1.4 mikrolitre at turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları ile inkübe edin.

Membranları PBS %0.05 Tween 20 ile üç kez yıkayın, yaban turpu peroksidaz aktivitesini üreticinin protokolüne göre ticari bir kit ile tespit edin. Ve protein bantlarını görselleştirmek için film geliştirme için standart ekipman uygulayın. Daha sonra, PBS% 0.05 Tween 20 ile üç yıkamadan sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yedi mililitre western blot sıyırma tamponu ile membranları inkübe ederek bağlı antikorları çıkarın, membranları dört mikrolitre anti aktin antikoru ile dört mililitre MPT'de bir gecede dört santigrat derecede inceleyin.

Ertesi gün, yaklaşık 10 mililitre PBS% 0.05 Tween 20 ile membranlar üzerinde 10 dakikalık üç yıkama adımı gerçekleştirin, daha sonra membranları yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1.4 mikrolitre at turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları ile inkübe edin Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyondan sonra. Membranları PBS %0,05 Tween 20 ile üç kez yıkayın, ticari bir kit ile at turpu peroksidaz aktivitesini tespit edin ve protein yasaklarını görselleştirmek için film geliştirme için standart ekipman uygulayın. Bu deneyde, HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin tüm hücre lizatları, GFP'nin stabil ekspresyon göstermesi için immün kana tabi tutuldu.

HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi, GFP ekspresyonunun yoğunluğunu gösterir. HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücreleri, intrinsik apoptozu indüklemek için altı saat boyunca dört mikromolar sporin ile tedavi edildi. Apoptoz, HK 2 93 GFP 93 GFP hücrelerine kıyasla HK 2 9 3 GFP SA B hücrelerinde PARP bölünmesinin azaldığı parçalanmış PARP immün blot analizi ile analiz edildi.

CB, bax kaynaklı apoptozdan korur, ancak kaspaz üç kaynaklı apoptozdan korumaz. Bu prosedürü uygularken, etkileşim adımını tanımlamaya yardımcı olmak için sinyal yolunun mümkün olduğunca çok bileşenini araştırmak önemlidir. Seçilen efektör proteinin yolun kendisine veya daha doğrusu bu prosedürü takip eden aktivasyon adımına müdahale edip etmediğini belirlemek için hem topraklarında hem de aktive durumlarında aktive olan proteinleri test etmek de iyidir.

Bu mikrobiyal efektörlerin normal konakçı hücre fizyolojisini manipüle etmek için kullandığı tam moleküler mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için knockdown, knockout maya, iki hibrid, pull down translasyonel modifikasyon veya proteolitik stabilite testleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Ve bu, patojenin hayatta kalmasına ve yayılmasına nasıl fayda sağlar?