Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyalizasyonla olan etkileşimini incelemektir. Bu, ilgilenilen proteinin eksprese edildiği stabil hücre hatları oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, proteinin aktivitesini toplu hücre düzeyinde incelemek için, konak hücre sinyalizasyon kaskadının belirli bir basamağında aktive edilmesine olanak tanıyan indükleyebileceğir bir ekspresyon vektör sistemi kurulur. Ardından, ilgilenilen proteinin aktivite noktasını daraltmak amacıyla, bu proteinin konak hücre sinyalizasyon kaskadının aktivasyonuna müdahale edip edemeyeceği analiz edilecektir; western blotting analizi sonuçları, cozy yellow Burnett virülans faktörü KA B'nin, BAK'ın aşağısında ve kaspaz 3 aktivasyonunun yukarısındaki apoptotik kaskada müdahale ettiğini göstermektedir.

Bu yöntem, belirli bir bakteriyel efektör proteinin bir sinyal iletim kaskadında hangi kritik adımda müdahale ettiğinin belirlenmesi gibi, enfeksiyöz biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, yalnızca patojenik mikroorganizmaların konakçılarını nasıl manipüle ettiğini daha iyi anlamamıza değil, aynı zamanda bu temel hücresel süreçlerin nasıl çalıştığını anlamamıza da yardımcı olacaktır. Bu yöntem, apoptotik hücre ölümünün gerçekleşmesini önlemeye yönelik bakteriyel stratejilere dair içgörü sağlayabildiği gibi, hücre ölümü alanındaki diğer sinyal iletim sistemlerine (nekroptoz veya piroptoz gibi) veya hücre proliferasyonu, gen regülasyonu ya da bağışıklık sistemi reaksiyonlarında yer alan sinyal ağlarına da uygulanabilir.

Bu prosedür, Mann laboratuvarından lisansüstü öğrencisi Stephanie Besler tarafından gerçekleştirilecektir. İşleme, GFP veya GFP-say B'yi stabil olarak eksprese eden HEK 2 93 hücrelerini, her kuyucukta 100.000 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 12 kuyucuklu bir plakaya ekerek başlayın.

Ardından, DNA'yı ve polietilen transfeksiyon reaktifini ayrı ayrı 75 µL opt medyum içerisinde hazırlayın ve kompleks oluşumu için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her iki karışımı birlikte oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bunun ardından, polietilen DNA çözeltisini hücrelere damla damla ekleyin ve 37 °C'de %5 karbon dioksit ortamında inkübe edin.

Transfeksiyondan beş saat sonra, kültür ortamına mililitre başına bir mikrogram doksisiklin ekleyerek pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükleyin. Ardından hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda, ışık mikroskobu altında 18 saat boyunca inkübe edin. Hasat öncesinde hücrelerde hücre ölümü indüksiyonu olup olmadığını kontrol edin.

Apoptotik cisimlerin varlığıyla tespit edilebilen indüklenmiş apoptotik hücreleri inceleyin. Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve yapışmış hücreleri yıkayın. Hücreleri bir kez ılık PBS ile yıkadıktan sonra 100 µL 2x Laemmli örnek tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından beş dakika boyunca 95 °C'de ısıtın ve daha sonraki kullanımlar için -20 °C'de saklayın. Sonrasında, moleküler ağırlık belirteci olarak ticari bir protein merdiveninden 6 µL yükleyin. Ardından, %12 SDS page jeline örnek başına yaklaşık 40.000 hücre yükleyin.

Jelleri, bir kat laly yürütme tamponu ile 180 volt sabit gerilim altında 45 ila 60 dakika boyunca bir jel elektroforez sisteminde yürütün. Ardından, proteinleri PVDF membranlara 16 volt sabit gerilimde 60 dakika boyunca aktarın. Bunun için bir trans blot SD yarı-kuru transfer hücresi kullanın, ardından membranları oda sıcaklığında bir saat boyunca 10 mililitre MPT içinde bloke edin.

Yedi mikrolitre anti cleaved PARP antikorunu yedi mililitre MPT içinde seyreltin. PVDF membranı antikor çözeltisi ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Antikor çözeltisini uzaklaştırın ve PBS 0.05%Tween 20 ile üç kez 10 dakikalık yıkama işlemi gerçekleştirin; inkübasyonun ardından membranları, yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1.4 mikrolitre horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Membranları üç kez PBS 0.05%Tween 20 ile yıkayın, horseradish peroxidase aktivitesini üretici protokolüne uygun olarak ticari bir kit ile tespit edin. Protein bantlarını görüntülemek için film geliştirme amacıyla standart ekipman kullanın. Ardından, membranları üç kez PBS 0.05%Tween 20 ile yıkadıktan sonra, bağlanmış antikorları uzaklaştırmak için membranları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yedi mililitre western blot stripping tamponu ile inkübe edin; membranları, dört santigrat derecede gece boyunca dört mililitre MPT içinde dört mikrolitre anti actin antikoru ile probe edin.

Ertesi gün, membranları yaklaşık 10 mililitre %0,05 Tween 20 içeren PBS ile üç kez 10 dakikalık yıkama aşamalarından geçirin, ardından membranları yedi mililitre MPT içinde seyreltilmiş 1,4 mikrolitre horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Membranları %0,05 Tween 20 içeren PBS ile üç kez yıkayın, horseradish peroksidaz aktivitesini ticari bir kit ile tespit edin ve protein bantlarını görselleştirmek için standart film geliştirme ekipmanlarını uygulayın. Bu deneyde, stabil ekspresyonu göstermek için HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin tüm hücre lizatları GFP için immünoblotlandı.

HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi, GFP ekspresyonunun yoğunluğunu göstermektedir. İntrinsik apoptozu indüklemek için HEK 2 93 GFP ve HEK 2 93 GFP sabe hücreleri altı saat boyunca dört mikromolar sporin ile tedavi edilmiştir. Apoptoz, cleaved PARP immünoblot analizi ile incelenmiş ve PARP cleavage düzeyinin HK 2 9 3 GFP SA B hücrelerinde, HK 2 93 GFP hücrelerine kıyasla azaldığı tespit edilmiştir.

CB, bax kaynaklı apoptozdan korur ancak caspase three kaynaklı apoptozdan korumaz. Bu prosedürü uygularken, etkileşim aşamasının tanımlanmasına yardımcı olmak için sinyal yolunun mümkün olduğunca çok bileşenini incelemek önemlidir. Ayrıca, seçilen efektör proteinin yolun kendisine mi yoksa bu prosedürü takip eden aktivasyon aşamasına mı müdahale ettiğini belirlemek için proteinlerin hem bazal hem de aktive olmuş durumlarında test edilmesi faydalıdır.

Bu mikrobiyal efektörlerin normal konak hücre fizyolojisini manipüle etmek için kullandıkları kesin moleküler mekanizmalar nelerdir ve bu durum patojenin hayatta kalmasına ve yayılmasına nasıl yardımcı olur gibi ek soruları yanıtlamak için; knockdown, knockout, maya iki hibrid pull-down, post-translasyonel modifikasyon veya proteolitik stabilite analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.