Name: Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Keşfedin canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin dinamiklerini inceleme yöntemini. E. coli kullanarak zamana duyarlı çapraz bağlama ve immünopresipitasyon ile montaj ara ürünlerini belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

1. Plazmid Yapısı
<ol>
	<li>İlgilenilen bir proteini uygun bir ekspresyon vektörüne kodlayan bir geni klonladıktan sonra, bölgeye yönelik bir mutajenez kiti kullanarak istenen yerlere kehribar mutasyonları sokun. 
	NOT: Yapısal bilgiler ve yüzey maruziyet tahminleri, mutasyonların konumlarını belirlemek için yararlı kılavuzlar olarak hizmet edebilir. Kehribar bastırma ve çapraz bağlamanın etkinliği önemli ölçüde değişebileceğinden, kehribar mutasyonları birden fazla pozisyonda tanıtılmalıdır. Ayrıca, Bpa, tirozin ve fenilalaninin bir analogu olduğundan, protein yapısı ve işlevindeki bozulmaları en aza indirmek için normalde büyük hidrofobik amino asitleri kodlayan pozisyonlarda kehribar mutasyonları oluşturmaya çalışın. Son olarak, bir ifade vektörü seçerken, ilgilenilen bir proteinin çok yüksek bir seviyede aşırı üretilmesinin Bpa dahil etme verimliliğini sınırlayabileceğini unutmayın.</li>
</ol>
2. Kültür Hazırlama
<ol>
	<li>Uygun bir E. coli suşu, amber bastırma sistemini kodlayan bir plazmit (pDULE-p Bpa; bkz. referans 4) ve ilgilenilen proteini bir amber mutasyonu ile kodlayan uyumlu bir plazmid ile dönüştürmek için elektroporasyon kullanın.</li>
	<li>Uygun antibiyotikler içeren LB agar üzerindeki plaka hücreleri (pDULE-p Bpa'yı seçmek için 5 μg/ml tetrasiklin kullanın). Plakaları O/N 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, %0.2 gliserol, metiyonin ve sistein hariç tüm L-amino asitler (40 μg/ml) ve antibiyotik içeren 3-5 ml M9 besiyerinde14 tek kolonilerden O/N kültürlerine başlayın. 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, O / N kültürlerini 2.500 x g'da RT'de 5 dakika boyunca pelet hücrelerine santrifüjleyin. Hücreleri 5 ml taze M9 ortamında yeniden süspanse edin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. 
	NOT: Bu yıkama adımı, ampisilin direncini kodlayan plazmitleri korumak için kritik öneme sahiptir, çünkü O/N kültürlerinden ortamda bulunan az miktarda b laktamaz, önemli hücre büyümesi meydana gelmeden önce taze eklenen ampisilin'i bozar.</li>
	<li>Hücreleri 2 ml taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücre konsantrasyonunu bir spektrofotometrede (OD550) ölçün.</li>
	<li>OD 550=0.03'te 50 ml M9 ortamı ve antibiyotik içeren250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesine hücreler ekleyin. Kültürleri 37 ° C'de çalkalanan bir su banyosunda inkübe edin.</li>
</ol>
3. BPA Kuruluşu ve Fotoçapraz Bağlama için Hazırlık
NOT: Aşağıda açıklanan protokol, üç zaman noktası (0, 1 ve 5 dakika) olan bir örnek zaman kursu içindir. Farklı sayıda zaman noktası isteniyorsa ses seviyelerini buna göre ayarlayın. Prosedürün bir taslağı Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol>
	<li>Kültürler büyürken, 1 M NaOH'de (100 μl 1 M NaOH'de 27 mg Bpa) taze 1 M (1.000x) Bpa çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi karanlıkta tutmak için koyu duvarlı bir tüp kullanın.</li>
	<li>Kültürler erken ila orta log fazına ulaştığında (OD550 = 0.2), her kültüre 50 μl 1 M Bpa ekleyin. Yağışı önlemek için şişeyi döndürürken her seferinde bir damla Bpa ekleyin. Ardından, kehribar mutantının ekspresyonunu sağlamak için gereken herhangi bir indükleyiciyi ekleyin. Kültürleri 37 °C'de 30 dakika daha inkübe etmeye devam edin.</li>
	<li>30 dakikalık indüksiyon periyodu sırasında, altı adet tek kullanımlık 15 ml'lik santrifüj tüpünü zaman noktası (0 dk, 1 dk, 5 dk) ve "+ UV" veya "- UV" ile etiketleyin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>İkinci bir buz kovasını buzla doldurun ve buzun üzerine 6 oyuklu bir doku kültürü plakası yerleştirin.</li>
	<li>Nabız etiketlemesi için yüksek spesifik aktiviteyi (1.000 mCi / mmol), 35S-metiyonin ve 35S-sisteini (veya iki bileşiğin önceden hazırlanmış bir karışımını) çözün ve bir radyoaktif olmayan L-sistein ve L-metiyonin çözeltisi hazırlayın (veya çözün) (her biri 100 mM) kovalama için.</li>
	<li>Radiolabeling'den beş dakika önce UV lambasını açın. 
	NOT: Lamba, çok kuyulu plakadaki numunelerden ~ 3-4 cm uzağa yerleştirilebilecek şekilde ayarlanabilir olmalıdır.</li>
	<li>"- UV" etiketli her tüpe ve çok kuyulu plakadaki iki kuyucuğa buz (~ 2 ml) ekleyin. 
	NOT: Buz, 5 dakikalık zaman noktasından hemen önce üçüncü bir kuyuya eklenmelidir. Hücre içi reaksiyonları her zaman noktasında hemen durdurmak ve böylece belirli bir biyokimyasal yolun doğru "anlık görüntülerini" elde etmek için buzun doğrudan tüplere ve kuyulara yerleştirilmesi önemlidir.</li>
	<li>30 dakikalık indüksiyon süresinin sonunda, 25 ml kültürü önceden ısıtılmış 125 ml tek kullanımlık bir Erlenmeyer şişesine aktarın. Matarayı 37 °C çalkalama suyu banyosuna yerleştirin.</li>
</ol>
4. Nabız Takibi Etiketleme ve UV Işınlaması
NOT: Nabız takip etiketleme ve UV ışınlama protokolü, zamanında gerçekleştirilmesi gereken ve önemli ölçüde organizasyon ve önceden hazırlık gerektiren birçok adıma sahiptir. Tüm reaktifler ve tüpler kolayca erişilebilir olmalıdır. 0, 1 ve 5 dakikalık zaman noktalarına sahip bir deney için bir protokol aşağıda sunulmuştur.
<ol>
	<li>Saat 0:00'da (dk:sn) 25 ml kültürü 125 ml'lik şişeye aktarın.</li>
	<li>Saat 0:30'da 30 μCi / ml radyoaktif amino asit ekleyin; karıştırmak için hızlıca döndürün. Matarayı 37 °C çalkalamalı su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Saat 1:00'de 100 mM metiyonin-sistein çözeltisinden 250 μl ekleyin; karıştırmak için hızlıca döndürün.
	<ol>
		<li>Hemen 4 ml kültürden oluşan buz içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın oyuklarından birine pipetleyin. "0 dk - UV" etiketli 15 ml'lik tüpe ikinci bir 4 ml'lik alikot pipetleyin. Şişeyi su banyosuna geri koyun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Saat 2:00'de, 4 ml kültürü buz içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın ikinci kuyucuğuna pipetleyin. "1 dk - UV" etiketli 15 ml'lik tüpe 4 ml daha alikot pipetleyin. Şişeyi su banyosuna geri koyun.</li>
	<li>Saat 6:00'da, 4 ml kültürü buz içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın üçüncü kuyucuğuna pipetleyin. "5 dk - UV" etiketli 15 ml'lik tüpe 4 ml daha alikot pipetleyin.</li>
	<li>Çok kuyulu plakalı buz kovasını önceden ısıtılmış UV lambasının altına yerleştirin ve her numuneyi 4 dk. boyunca ayrı ayrı ışınlayın
	NOT: Zaman noktalarının en az 4 dakika aralıklarla yerleştirildiği deneylerde, her numune çok kuyulu plakaya pipetlendiği anda ışınlanmalıdır.</li>
	<li>Hücreleri "0 dk +UV", 1 dk +UV" vb. etiketli soğutulmuş 15 ml'lik tüplere aktarın.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Her numuneyi 300 μl M9 ortamında veya PBS'de yeniden süspanse edin ve proteinleri çökeltmek için 33 μl %100 soğuk trikloroasetik asit (TCA) ekleyin. TCA çökeltilerini bir mikrofüje içinde 10 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Bu noktada numuneler - 20 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>
5. İmmünopresipitasyon ve Çapraz Bağlama Ürün Tespiti
<ol>
	<li>Her numuneye 50 μl çözündürme tamponu (%15 gliserol, 200 mM Trisbase, 15 mM EDTA, %4 SDS, 2 mM PMSF) ekleyin ve çökeltilmiş proteini çözündürmek için 95 ° C'de 5 dakika çalkalama ile ısıtın.</li>
	<li>1 ml radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, %1.0 Igepal CA-630, %0.5 deoksikolat, %0.1 SDS) ekleyin ve her numunenin beşte biri ila yarısını kullanarak standart immünopresipitasyonlar15 gerçekleştirin. 
	NOT: Artık ticari olarak mevcut olmayan NP-40 yerine Igepal CA-630 (oktilfenil-polietilen glikol) kullanılmaktadır. İki bileşik kimyasal olarak ayırt edilemez.</li>
	<li>İmmünopresipite proteinleri SDS-PAGE ile çözün. Lekeleyin, lekeleyin ve kurutun.</li>
	<li>Jelleri bir fosfor ekranı O/N'ye maruz bırakın ve bir fosfor görüntüleyici ile radyoaktif proteinleri (çapraz bağlama ürünleri dahil) tespit edin.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile canlı bir hücrenin diğer bileşenleri arasındaki etkileşimlerin dinamiklerini incelemek için bölgeye özgü foto çapraz bağlamayı nabız takip etiketlemesi ile birleştiren bir yöntemi açıklamaktadır. Yöntem, proteinin diğer faktörlerle sırayla etkileşime girdiği çok adımlı süreçleri incelemek için özellikle yararlıdır. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yaklaşımlarından farklı olarak, bölgeye özgü foto çapraz bağlama, ilgilenilen bir proteinin bireysel segmentlerinin ve hatta bireysel k...

İlgilenilen bir protein ile diğer hücresel bileşenler arasındaki etkileşimleri tanımlamak ve karakterize etmek, biyolojik bir yoldaki rolünü tanımlamak, montajını anlamak veya etki mekanizmasını aydınlatmak genellikle gereklidir. Protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak çok çeşitli yaklaşımlar kullanılır, ancak hepsinin sınırlamaları vardır. İlgilenilen bir proteine bağlanan proteinleri tanımlamanın en basit tarafsız yöntemi, kosaflaştırmadır (veya koimmünopresipitasyondur), ancak bu yaklaşım, saflaştırma prosedürü sırasında bir protein kompleksinin bozulmadan kalmasını gerektirir. Zayıf veya geçici protein etkileşimleri, kimyasal çapraz bağlama yoluyla stabilize edilebilir, ancak bu yöntem tipik olarak, protein dizisinde geniş çapta dağılmış olan birincil aminler yoluyla proteinleri bağlayan bileşiklerin kullanılmasını gerektirir. Yorumlanması zor olan karmaşık çapraz bağlama modelleri, özellikle ilgilenilen proteinler multiprotein komplekslerinin bileşenleri olduğunda üretilebilir. Ayrıca, kimyasal çapraz bağlayıcıların ara kollarının uzunluğu genellikle 10 Å'yi aştığından, ilgilenilen proteine yakın bulunan ancak doğrudan etkileşime girmeyen proteinlerle kovalent bağlar oluşturulabilir. Afinite kromatografisi ve iki hibrit ekranlar gibi yöntemler de protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için sıklıkla yararlıdır. Bununla birlikte, eski yaklaşım, fizyolojik olarak önemli etkileşimleri teşvik eden ve zayıf etkileşimleri tespit etmek için kullanılamayan koşulların yeniden üretilmesini gerektirir. İkinci yaklaşım, bağlanma etkileşimlerinin konakçı organizmada tekrarlanabilmesini ve ilgilenilen bir protein ve onun bağlanma ortakları bir füzyon proteini bağlamına yerleştirildiğinde sürdürülmesini gerektirir. İki hibrit yöntem ayrıca yanlış pozitif sonuçlar üretme eğilimindedir2. Bir protein-protein etkileşimi kurulduktan sonra, etkileşim bölgesini haritalamak için genellikle önemli bir çalışma gerekir. Geleneksel yaklaşımların belki de en önemli dezavantajı, moleküller arası etkileşimlerin zamansal sırası veya bağlanma kinetiği hakkında herhangi bir bilgi sağlamamalarıdır.
Bu makale, protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılan diğer yaklaşımların bazı sınırlamalarının üstesinden gelen basit bir yöntemi açıklamaktadır. Başlangıçta, ilgilenilen bir proteini kodlayan gene tek bir kehribar mutasyonu eklenir. Kehribar mutantı daha sonra bir kehribar baskılayıcı tRNA ve Methanococcus jannaschii'den türetilen ve fotoaktive edilebilir amino asit analogu p-benzoilfenilalanini (Bpa) yalnızca kehribar kodonları3'te içerecek şekilde tasarlanmış bir amino asil-tRNA sentetaz ile birlikte eksprese edilir. Hücrelerin uzun dalga boylu ultraviyole (UV) ışıkla (~365 nm) ışınlanması, daha sonra Bpa ile ~3-8 Å4,5 içindeki proteinler arasında kovalent bir bağ oluşumunu kolaylaştırır. Bazı deneysel bağlamlarda, aktive edilmiş Bpa ile lipitler ve nükleik asitler gibi hücrelerin protein olmayan bileşenleri arasında çapraz bağlar da oluşturulabilir6. Kehribar kodonunda sonlanan moleküller genellikle SDS-PAGE üzerindeki tam uzunluktaki proteinden kolayca ayırt edilebilir olmalıdır ve diğer proteinlere çapraz bağlanamaz. Hücreleri, çapraz bağlamadan önce nabız kovalamaca radyo-etiketlemeye tabi tutarak ve daha sonra çapraz bağlama ürünlerini immünopresipitasyon veya afinite saflaştırarak, protein-protein etkileşimlerinin sırası ve süresi belirlenebilir. Moleküller arası etkileşimler hakkında zamansal bilgi üretme yeteneği, ilgilenilen bir proteinin herhangi bir sıralı çok adımlı montaj, trafik veya sinyal yolu boyunca ilerlemesini incelemek ve yol ara ürünlerini tanımlamak için özellikle değerlidir. Kimyasal çapraz bağlama gibi, bölgeye özgü çapraz bağlama, fizyolojik koşullar altında meydana gelen protein-protein etkileşimlerini tespit eder, ancak tek bir konumda bir çapraz bağlayıcının eklenmesi, bir proteinin bireysel segmentleri ile diğer faktörler arasındaki etkileşimlerin analizini kolaylaştırır. Siteye özgü çapraz bağlamanın bu benzersiz özelliği, ilgilenilen proteinin farklı bağlanma ortaklarıyla etkileşime girme potansiyeline sahip birden fazla segmente veya alana sahip olması durumunda özellikle avantajlıdır. Ayrıca, bölgeye özgü çapraz bağlama, protein-protein etkileşimlerine aracılık eden kalıntıları hassas bir şekilde haritalamak için kütle spektrometresi gibi yöntemlerle birlikte kullanılabilir. Bu yöntem E. coli'de kullanım için optimize edilmiş olsa da, Mycobacterium, maya ve memeli hücreleri7-11'de kehribar baskılama yoluyla fotaktive edilebilir amino asit analoglarının proteinlere dahil edildiği bildirilmiştir. Bu nedenle, prensip olarak yöntemimiz diğer sistemlerde de kullanılabilir.
Bu yöntemi, bir E. coli O157:H7 virülans faktörü olan EspP'nin biyogenezini kolaylaştıran moleküller arası etkileşimleri tanımlamak için yaygın olarak kullandık. EspP, silindirik bir b fıçı yapısına katlanan ve proteini dış zara (OM) bağlayan büyük bir N-terminal hücre dışı alan ("yolcu alanı") ve aC-terminal alanı ("b alanı") içeren "ototaşıyıcılar" olarak bilinen bir protein süper ailesinin bir üyesidir.12. Yolcu alanının OM boyunca yer değiştirdiği mekanizma uzun süredir devam eden bir gizem olmuştur. Tüm bakteri hücre yüzey proteinleri gibi, EspP de iç zar boyunca taşınmalı, periplazma (iç ve dış zarlar arasındaki boşluk) boyunca mekik dövülmeli ve bir dizi sıralı olayda OM'ye hedeflenmelidir. OM boyunca yer değiştirmesini takiben, EspP yolcu alanı da proteolitik bir bölünme ile b alanından ayrılır ve hücre yüzeyinden serbest bırakılır. Bölgeye özgü çapraz bağlamayı nabız takip radyoetiketleme ile birleştirerek, proteinin her iki alanının da başlangıçta periplazma6'daki moleküler şaperon Skp ile etkileşime girdiğini gösterdik. Daha sonra, b alanının ayrı segmentleri, bilinmeyen bir mekanizma ile b fıçı proteinlerinin bakteriyel OM'ye entegrasyonunu katalize eden Bam kompleksi adı verilen bir heterooligomerin bileşenleri ile stereospesifik bir şekilde etkileşime girer. Belki de en ilginç olanı, yolcu alanının OM13'ü geçerken Bam karmaşık alt birimlerinden (BamA) biri ile temas halinde olduğunu bulduk. Sonuçlarımız, otomobil taşıyıcı montajı14 için ayrıntılı bir model oluşturmamızı sağladı ve Bam kompleksini, yolcu alanının OM boyunca taşınmasında dahil etti.

<table><tbody><tr><td>QuikChange II Siteye Yönelik Mutajenez Kiti</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (HP-Bz-Phe-OH)</td> <td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, Metabolik Etiketleme Reaktifi (35SL-metiyonin ve 35SL-sistein, >1.000 Ci/mmol)</td><td>MP Biyomedikal</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spektroline SB-100P Süper Yüksek Yoğunluklu UV Lambası, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Spektrolin Yedek Ampul 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Doku Kültürü Plakası, 6 kuyulu</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık 125 ml Erlenmeyer şişesi</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 çalkalamalı su banyosu</td><td>Yeni Brunswick Bilimsel</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

bölgeye Özgü Çapraz bağlama kullanarak salgılanan bir bakteriyel virülans faktörünün montajının İzlenmesi

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile in vivo olarak diğer faktörler arasındaki dinamik etkileşimleri tespit etmek ve analiz etmek için bir yöntemi açıklar. Yöntemimiz, orijinal olarak Peter Schultz ve meslektaşları1 tarafından geliştirilen kehribar bastırma teknolojisine dayanmaktadır. Bir kehribar mutasyonu ilk olarak, ilgilenilen proteini kodlayan genin spesifik bir kodonunda tanıtılır. Amber mutantı daha sonra E. coli'de bir amber baskılayıcı tRNA ve Methanococcus jannaschii'den türetilen bir amino asil-tRNA sentetazı kodlayan genlerle birlikte eksprese edilir. Bu sistemi kullanarak, foto-aktive edilebilir amino asit analogu p-benzoilfenilalanin (Bpa) amber kodonuna dahil edilir. Hücreler daha sonra Bpa kalıntısını 3-8 şiçinde bulunan proteinlere kovalent olarak bağlamak için ultraviyole ışıkla ışınlanır. Fotoçapraz bağlama, saniyeler ila dakikalar arasında bir zaman ölçeğinde meydana gelen protein-protein etkileşimlerindeki değişiklikleri izlemek için ilgilenilen proteinin nabız kovalama etiketlemesi ve immünopresipitasyonu ile birlikte gerçekleştirilir. İki bağımsız alandan, dış zara entegre edilmiş bir alandan ve hücre dışı boşluğa yer değiştiren bir alandan oluşan bir bakteriyel virülans faktörünün montajını incelemek için prosedürü optimize ettik, ancak yöntem hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde birçok farklı montaj sürecini ve biyolojik yolu incelemek için kullanılabilir. Prensip olarak, etkileşen faktörler ve hatta ilgilenilen bir proteine bağlanan etkileşen faktörlerin spesifik kalıntıları kütle spektrometresi ile tanımlanabilir.

EspP'nin dış membrana (OM) gidiş yolculuğu sırasında etkileşime girdiği proteinleri tanımlamak için bölgeye özgü fotobağlama kullandık. Burada gösterilen deneylerde, 1113 ve 1214 numaralı kalıntılardaki fenilalanin kodonları amber kodonlarla değiştirildi. Her iki konum da OM'ye entegre olan ve membran çapası görevi gören β domaininde yer almaktadır. EspPβ domaininin kristal yapısı16, bu iki kalıntının β varilinin periplazmik tarafında olduğunu ancak yaklaşık 120° ayrı olduklarını göstermektedi...

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yaşayan bir hücre içindeki protein-protein etkileşimlerinin dinamiğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen bir proteinin E. coli'de eksprese edilmesi, benzoyl phenyl alanine amino asit analoğunun proteinin spesifik bir konumuna dahil edilmesi ve senkronize şekilde sentezlenen küçük bir protein molekül popülasyonunu işaretlemek için pulse-chase radyolabeling uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak.Takip (chase) sürecinin farklı zaman noktalarında toplanan hücre alikotları, ilgilenilen protein ile etkileşimde olduğu faktörler arasında kovalent bağların oluşumunu tetiklemek için ışınlanır. Ardından, proteinler spesifik antikorlarla immünopresipite edilir ve etkileşen faktörleri tanımlamak için SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıştırılır; çapraz bağlama ürünlerinin elektroforetik hareketliliğindeki değişimlere dayanarak, ilgilenilen protein ile diğer hücre içi faktörler arasındaki etkileşimlerin zaman içindeki değişimlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, ko-immünopresipitasyon veya kimyasal çapraz bağlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ilgilenilen bir proteindeki spesifik bir kalıntı ile diğer molek

monitoring-assembly-secreted-bacterial-virulence-factor-using-site

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Belirli Bir Bakteriyel Zararlılık Faktörünün Salınımının İzleme Yapılandırması - Bölgeye Özgü Çapraz Bağlanma Kullanılarak

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin dinamiklerini inceleme yöntemini. E. coli kullanarak zamana duyarlı çapraz bağlama ve immünopresipitasyon ile montaj ara ürünlerini belirleyin.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Daha fazla video keşfet