Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı bir hücre içindeki protein protein etkileşimlerinin dinamiklerini incelemektir. Bu, ilk olarak e coli'de ilgilenilen bir proteinin eksprese edilmesi, amino asit analogu benzoil fenil alaninin belirli bir yerde proteine dahil edilmesi ve eşzamanlı olarak sentezlenen protein moleküllerinin küçük bir popülasyonunu etiketlemek için nabız takip radyo etiketlemesi yapılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak.

Takip sırasında çeşitli zaman noktalarında toplanan hücrelerin alikotları, ilgilenilen protein ile etkileşime girdiği herhangi bir faktör arasında kovalent bağların oluşumunu tetiklemek için ışınlanır. Daha sonraki proteinler, spesifik antikorlarla immüno-çökeltilir ve etkileşimli faktörleri tanımlamak için SDS poli akrilamid jel elektroforezi ile çözülür, çapraz bağlama ürünlerinin elektroforetik hareketliliğindeki değişikliklere bağlı olarak zaman içinde ilgilenilen protein ile diğer hücre içi faktörler arasındaki etkileşimlerdeki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, birlikte immünopresipitasyon veya kimyasal çapraz bağlama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ilgilenilen bir proteindeki belirli bir kalıntı ile diğer moleküller arasında meydana gelen etkileşimler hakkında zamansal bilgi üretme yeteneğidir.

Bu tür veriler, bir proteinin çok aşamalı bir montaj yolu boyunca ilerlemesini incelerken ve montaj ara ürünlerini tanımlamak için özellikle değerlidir. Bu yöntem e coli'de kullanım için optimize edilmiş olsa da, diğer bakteri, maya ve memeli hücreleri dahil olmak üzere diğer sistemlerde de kullanılabilir. Kültür hazırlığı ile ilgili detaylar metin protokolünde bulunabilir.

Kısaca beş mililitre M dokuz besiyeri, %0.2 gliserol içeren metiyonin ve sistin dışındaki tüm el amino asitlerini hazırlayın ve antibiyotikler, bir kehribar mutasyonu ile ilgilenilen proteini kodlayan bir plazmit ile dönüştürülmüş e coli ekleyerek gece boyunca kültürlere başlar ve kehribar baskılama sistemini kodlayan plazmid 37 santigrat derecede inkübe eder. Deney gününde, 550 nanometre 0.03'te bir optik yoğunluk elde etmek için 50 mililitre M dokuz ortam ve antibiyotik içeren 250 mililitrelik bir erlenmeyer şişesine gece kültüründen uygun miktarda hücre ekleyin. Kültürleri çalkalayan bir su banyosunda 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültürler erken ila orta log fazına ulaştığında, her kültüre 50 mikrolitre bir molar benzoil fenilalanin veya BPA ekleyin. Yağışı önlemek için şişeyi döndürürken her seferinde bir damla BPA ekleyin. Ardından, kehribar mutantının ekspresyonunu sağlamak için gereken herhangi bir indükleyiciyi ekleyin.

30 dakikalık indüksiyon süresi boyunca kültürleri 37 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe etmeye devam edin. Altı adet tek kullanımlık 15 mililitrelik santrifüj tüpünü zaman noktası ve artı UV veya eksi uv ile etiketleyin. Etiketli tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Buzla doldurulmuş ikinci bir buz kovasının üzerine altı kuyulu bir doku kültürü plakası yerleştirin. Radyo etiketlemesinden beş dakika önce UV lambasını açın. Daha sonra eksi UV etiketli her tüpe ve çok kuyulu plakadaki iki kuyucuğa yaklaşık iki mililitre buz ekleyin.

Her bir zaman noktasında hücre içi reaksiyonları hemen durdurmak ve böylece 30 dakikalık indüksiyon süresinin sonunda biyokimyasal yolun doğru bir anlık görüntüsünü elde etmek için buzun doğrudan tüplere ve kuyulara havalandırılması önemlidir. Kültürün 25 mililitresini önceden ısıtılmış 125 mililitrelik tek kullanımlık erlenmeyer şişesine aktarın. Şişeyi 37 santigrat derece çalkalanan su banyosuna yerleştirin.

Darbe takip etiketleme ve UV ışınlama adımları zamanında gerçekleştirilmelidir ve önemli bir organizasyon ve ileri hazırlık gerektirir. Kültüre mililitre başına 30 mikro küri S 35 etiketli metiyonin ve sistein ekleyin ve zaman içinde karıştırmak için hızla döndürün. Bir dakika sıfır saniye.

250 mikrolitre radyoaktif olmayan 100 milimolar metiyonin sistein çözeltisi ekleyin ve hızlıca döndürün. Hemen karıştırmak için, dört mililitre kültürü buz içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın oyuklarından birine pipetleyin, ikinci bir dört mililitrelik alikotu her seferinde sıfır dakika eksi UV etiketli 15 mililitrelik tüpe pipetleyin. İki dakika sıfır saniye.

Kültürün dört mililitresini, buz içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın ikinci bir kuyusuna pipetleyin. Daha sonra, beş dakikalık zaman noktasından hemen önce bir dakika eksi UV etiketli 15 mililitrelik tüpe, yaklaşık iki mililitre buza, bazen altı dakika sıfır saniye olmak üzere çok kuyulu plakadaki üçüncü bir kuyuya pipetleyin. Kültürün dört mililitresini, buz borusu içeren soğutulmuş çok kuyulu plakanın üçüncü kuyucuğuna pipetleyin.

Beş dakika eksi uv etiketli 15 mililitrelik tüpe dört mililitre daha alikot vardı. Çok kuyulu plakaya sahip buz kovasını önceden ısıtılmış UV lambasının altına yerleştirin ve her numuneyi dört dakika boyunca ayrı ayrı ışınlayın. Hücreleri, sıfır dakika artı uv, bir dakika artı UV vb. etiketli soğutulmuş 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 2.500 kez G'de santrifüjleyin. Proteinleri çökeltmek için her numuneyi 300 mikrolitre M dokuz orta veya PBS ve 33 mikrolitre %100 soğuk trikloroasetik asit veya TCA içinde yeniden süspanse edin, TCA çökeltilerini 10 dakika boyunca en yüksek hızda bir mikro füje içinde santrifüjleyin. Suyu çıkarmadan önce, her numuneye 50 mikrolitre çözündürme tamponu ekleyin ve çökeltilmiş proteini çözündürmek için beş dakika boyunca 95 santigrat derecede çalkalama ile ısıtın.

Bir mililitre radyo immünopresipitasyon tahlili eklendikten sonra, tahlil tamponu, her numunenin beşte biri ila yarısını kullanarak standart immünopresipitasyon gerçekleştirir. İmmün çökeltilmiş proteinleri sodyum ESAL sülfat, poli akrilamid jel elektroforezi veya SDS sayfası ile çözün. Son olarak, lekeli ve kurutulmuş jelleri gece boyunca bir fosfo ekrana maruz bırakın ve bir fosfo görüntüleyici ile çapraz bağlama ürünleri dahil olmak üzere radyoaktif proteinleri tespit etmek için bölgeye özgü foto çapraz bağlama, dış zara olan yolculuğu sırasında ESPP ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için kullanıldı.

Bu deney için, ESPP beta alanının 1113 ve 1214 kalıntılarındaki pH alanin kodonları Amber kodonları ile değiştirildi. ESPP beta alanının kristal yapısı, iki kalıntının her ikisinin de beta fıçısının peri plazmik tarafında olduğunu ve yaklaşık 120 derece ile ayrıldığını gösterir. İki farklı polipeptit, hem ışınlanmış hem de kontrol hücrelerinden C terminal anti ESPP ve serum ile immüno-çökeltildi.

Başlangıçta, kovalent olarak bağlı yolcu ve beta alanlarını içeren proteinin yaklaşık 135 kilodaltonluk bir öncü formu, daha sonraki zaman noktalarında baskın hale geldi. PRO ESPP seviyesi düştü ve yolcu alanı dış zar boyunca trans olarak yerleştirildiği ve beta alanından proteolitik bir bölünme ile ayrıldığı için ücretsiz beta alanı baskın olmaya başladı. Bununla birlikte, UV I yayılan numuneler, kontrol numunelerinde bulunmayan daha yüksek moleküler ağırlık bantlarına sahipti.

Bu bantlar, bu polipeptitlerin hareketliliğine bağlı olarak PRO ESPP'nin etkileşen proteinlere çapraz bağlanmasından kaynaklanır, etkileşen proteinlerin boyutlarının, bilinen dış zar protein montaj faktörlerine karşılık gelip gelmediklerini test etmek için tahmin edildiği tahmin edilmiştir. Varsayılan etkileşimli ortaklara karşı üretilen anti cera kullanılarak ek immünoçökeltiler gerçekleştirildi. BPA, 1113 ve 1214 kalıntılarının her ikisinde de dahil edildiğinde gözlenen yaklaşık 150 kilodaltonluk bir polipeptit, 17 kilodalton peri plazmik şaperon atlamasına karşı bir antiserum ile immüno-çökeltilebilir.

Ayrıca, BPA iki pozisyondan sadece birine dahil edildiğinde gözlenen daha büyük polipeptitlerin, sırasıyla BAM B ve BAM D'ye karşı BAM kompleks alt birimlerine karşı anti cera ile immüno-çökeltilebileceğini bulduk. Bu prosedürü gerçekleştirdikten sonra, çapraz bağlama ürünleri saflaştırılabilir ve ilgilenilen bir protein ile etkileşime giren faktörlerin belirlenmesine yardımcı olmak için kütle spektrometresi dahil olmak üzere diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Video ile izledikten sonra, proteininizin canlı hücre içindeki diğer moleküllerle etkileşim dinamiklerini incelemek için nabız kovalama etiketlemesini bölgeye özgü fotoğraf çapraz bağlama ile nasıl başarılı bir şekilde birleştireceğinizi iyi anlamalısınız.