Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli tarama yöntemleri kullanarak ilgilenilen bir substratı fosforile eden kinazları tanımlamaktır. Bu, ilk önce transferaz veya GST olarak glutatyona FU kinazları eksprese eden plazmitlerle hücrelerin kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir GST kinaz pulldown gerçekleştirmektir.

Daha sonra, numuneler jellere yüklenir, daha sonra çalıştırılır ve kumasi parlak mavi boya ile boyanır. Son adım, jelleri kurutmak ve onları oto radyografi filmine maruz bırakmaktır. Sonuç olarak, elde edilen filmleri geliştirerek ve yorumlayarak, her şerit farklı bir kinaz testini temsil ettiği için kinaz substrat çiftleri tanımlanabilir.

Bilinen bir fosforile substrat için bir kinazı tanımlamak için mevcut yöntemler arasında, substratta bir konsensüs yeri aramak için biyoinformatik yaklaşımların kullanılması, biyokimyasal teknikler ve bir deneme yanılma yaklaşımı kullanılarak kinaz ve substratlar arasındaki komplekslerin tespit edilmesi, bilinen biyolojik işlevleri temelinde sürekli konsensüs substratlarının aranması yer alır. Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır ve her zaman başarı ile karşılaşmaz. Yaklaşımımız, fonksiyonel sonuçlar temelinde kinaz substrat çiftlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına izin verir.

Bu yöntem için fikir ilk aklımıza geldiğinde, in vitro olarak yetersiz özgüllük olacağından endişe duyduk. Görünüşe göre, substrat özgüllüğü mükemmeldir ve genellikle yalnızca aile üyesi kinazların ekrandaki belirli bir substratı fosforile edebildiğini görürüz. Bu, özellikle her ekranda birden fazla substrat kullanarak çoğullama yaptığımızda belirgindir, bu da prosedürün laboratuvarımdan bir teknisyen olan Courtney olacağını gösterir Prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi reaktiflerin, plakaların ve hücrelerin hazırlanmasıyla başlayın.

Kinaz plazmitleri içeren plakalar dondurulmuşsa, oda sıcaklığında çözülür ve kuyucukların dibindeki nemi toplamak için üç dakika boyunca 1900 kez G'de santrifüjleyin. 8.6 mililitre indirgenmiş serum ortamını 312.7 mikrolitre lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve karışımın her bir oyuğa beş dakika oturmasına izin verin. İndirgenmiş serum ortamının 10 mikrolitresinde kinaz plazmitlerini içeren 96 oyuklu plakadan.

Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, daha sonra küçük hacimli bir kaset ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, oyuk başına 10 mikrolitre azaltılmış serum ortamı transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin ve plakanın 20 ila 45 dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, 80 mililitre tam delcos modifiye edilmiş 2 93 milyon hücrede mililitre başına 0.75 milyon hücrede 2 93 T hücresini yeniden askıya alın, boşluk başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonunda ortama veya DMEM'e eşittir. Standart hacimli bir kaset ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre geri göndermeden önce kuyucukları mikroskop altında düzgün hücre dağılımı açısından kontrol edin.

GST kinaz aşağı çekme deneyine başlamak için. 60 mikrolitre 0.2 molar sodyum vanadatı ikinci bir tüpte 540 mikrolitre su ile karıştırarak, 2.7 mikrolitre% 30 peroksit ve 1.4 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS karıştırarak vanadat çözeltisi başına dört milimolar yapın. İki çözeltiyi birlikte ekleyin ve karışımı kullanmadan önce 15 dakika bekletin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, her oyuğa iki mikrolitre 0.25 molar kalsiyum klorür dağıtın, ardından kanıtlanmış hurma çözeltisinden 2.5 mikrolitre dağıtın. Her bir plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından plakaları buz üzerinde tutarak buzun üzerine yerleştirin. Buz gibi soğuk lizis tamponunun kuyusu başına hemen 50 mikrolitrelik bir vakum kullanarak ortamı her bir kuyucuktan çıkarın.

Standart kasetle donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, plakayı bitlenmek için buz üzerinde 30 dakika bekletin. Plakaları dört santigrat derecede üç dakika boyunca 1900 kez G'de döndürdükten sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak hücreleri her bir oyuktan kazıyın ve tüm içeriği uygun şekilde etiketlenmiş vbo'ya aktarın. 96 oyuklu plaka, sıkma sırasında 10 santigrat derecede 10 dakika boyunca 1900 kez G'de döndürür, glutatyon kaplı plakaları buz gibi soğuk lizis tamponu kuyusu başına 100 mikrolitre ile doldurur.

Durulama olarak, plakaları buz üzerinde tutun. Alt plakaların santrifüjlenmesini takiben, lizis tamponunu sallamak ve bir kağıt havlu üzerinde kurulamak için glutatyon plakalarını bir lavabonun üzerinde ters çevirin. Plakayı eğerek ve çok kanallı bir pipet kullanarak, alttaki peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, lizis tamponunu V alt plakalarından glutatyon plakalarına aktarın.

Ardından plakaları örtün ve en az iki saat buz üzerinde bırakın. İki saatlik ciltleme adımının sonuna yakın bir zamanda bağlamak için, radyoaktif çalışma için gerekli güvenlik önlemlerinin alındığından emin olan bir radyoaktivite iş istasyonu hazırlayın. Hibridizasyon fırınını 30 santigrat dereceye ayarlayın.

Lizis tamponunu sallamak için glutatyon plakalarını bir lavabonun üzerinde ters çevirin ve bir kağıt havlu üzerine kurulayın. Kuyuları PMSF içermeyen 100 mikrolitre lizis tamponu ile üç kez durulayın. Kuyuların kuru kalmasına izin vermeyin.

Devam etmeye hazır olana kadar durulamaya devam edin. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi 55 mililitre bir X kinaz tamponu veya bir x kb hazırlayın. Standart hacimli bir kaset ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre bir x kb ekleyin.

Daha sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ilgilenilen substratı ve miyelin bazik proteinini veya MVP'yi içeren bir çözelti yaparak çözelti A'yı hazırlayın. Bir kağıt havlu üzerindeki bir XKB durulama grafiğini çıkarmak için plakaları bir lavabonun üzerinde ters çevirin ve hemen 30 mikrolitre çözelti A. Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanın. Plakaları buz üzerinde tutun.

Daha sonra, çözelti B'yi, metin protokolünde açıklandığı gibi radyoaktivite çalışma alanında, kuyucuk başına 20 mikrolitre B çözeltisinde hazırlayın. Ejeksiyon kuvveti nedeniyle karıştırmaya yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak, plakayı 30 santigrat derece hibridizasyon fırınında 30 dakika boyunca örtün ve inkübe edin. 30 dakika sonra plakaları tekrar buza aktarın.

Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 50 mikrolitre iki x sodyum eccle sülfat veya SDS lizis tamponu ekleyin. Bu bölümdeki tüm çalışmalar, radyo aktivitesi için belirlenmiş bir alanda gerçekleştirilmelidir. Hibridizasyon fırınını açın ve 85 santigrat dereceye ayarlayın.

Fırın sıcaklığa ulaştığında, plakaları fırına aktarın ve numuneleri denatüre etmek için 10 dakika inkübe edin. Sonraki yük. Her reaksiyondan 15 mikrolitre ile 26 iyi prekast jel.

Aynı anda birkaç kuyuyu doldurmak için çok kanallı bir pipet kullanarak, tüm uçların karşılık gelen kuyucuklarla aynı hizada olmasına dikkat edilmelidir. Numuneleri eklemeden önce jeli 150 voltta çalıştırın. Mavi çizginin jelin altından akmasına izin vermeyin, çünkü bu, dahil edilmemiş A TP'yi içerir. Daha sonra jelleri sökün ve filmlerdeki jel maruziyetini koyulaştıracağı için dahil edilmemiş bir TP'yi çıkarın.

Jelleri etiketli kaplara koyun ve 15 dakika boyunca kumasi lekesi ile kaplayın. Ardından, kumasi lekesini çıkarın. Jelleri kısaca suyla durulayın ve deain solüsyonu ekleyin.

Proteinler açıkça görünene kadar jelleri alıkoyun. Her numune için MVP için bir bant ve substrat için bir bant görünür olmalıdır. Jelleri kurutmak için büyük bir filtre kağıdı yaprağı kesin ve kurutucunun üzerine yerleştirin.

Bir selofan tabakasını damıtılmış suda pürüzsüz ve kırışıksız olana kadar ıslatın ve kağıdın üzerine yerleştirin. Jelleri selofan tabakasının üzerine yerleştirin ve jellerin sırasını not edin. İkinci bir selofan tabakasını ıslatın ve jellerin üzerine yerleştirin.

Güzel, homojen bir yüzey için tüm baloncukları açın. Kapağı kapatın, vakumu açın ve jelleri 80 santigrat derecede üç saat boyunca sürün. Jeller kuruduktan sonra, sinyali yoğunlaştırmak için bir ekran kullanarak çift emülsiyonlu oto radyografi filmine maruz bırakın.

Kaseti saran sargı veya plastik bir torba ile sarın ve kaseti gece boyunca eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce donmayı önlemek için bantla kapatın. Ertesi gün kaseti dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. Filmi, üreticinin gösterilen talimatlarına göre bir film işlemcisi kullanarak karanlık bir odada geliştirin.

İşte bir ekrandan elde edilen temsili sonuçlar: 180 kinaz, kreb tarafından düzenlenen transkripsiyonel koaktivatör iki veya C RTC iki'den 268 ila 283 amino asitlere karşılık gelen A GST etiketli peptit substratı ve ayrıca klasik kinaz tahlili substratı miyelin bazik proteini veya MBP sadece iki kullanılarak tarandı. Kinazlar ikiyi işaretler ve yüksek derecede ilişkili kinaz, fosforile edilmiş üçü işaretler. CRTC iki peptit MBP, birçok fosforil ile ilişkilendirilebilir kalıntı içerdiğinden ve jelin dibine doğru 18 kilodaltonda çalıştığından tüm tahlillerde dahili bir kontrol olarak dahil edilir.

Bu, özgüllüğün yorumlanmasına izin verir. Bazı kinazlar, bir substratı ve MVP'yi sağlam bir şekilde fosforile eder. Burada dikkat edilmesi gereken nokta, tek başına GST içeren kuyucukların her zaman bazı endojen kinaz aktivitesini saflaştırdığıdır.

Bu nedenle, tahlilde her zaman arka plan fosforilasyonu vardır. Bu, substratın fosforilasyonunun gerçek olduğunu dışlamasa da, in vitro ortamda kinazın daha az seçici olabileceğini düşündürmektedir. Kinaz substrat özgüllüğü ile ilgili sonuçlar çıkarmak için farklı moleküler ağırlıklara sahip çoklu substratların dahil edilmesi özellikle bilgilendiricidir.

Ekran in vitro olduğundan ve in vivo olarak ek karmaşıklık seviyeleri meydana geldiğinden, hücrelerde bir aday kinaz doğrulanmalıdır. Örneğin, bir aday kinaz, bir substratı in vitro olarak fosforile etme kapasitesine sahip olabilir, substrat ile aynı hücre tipinde veya bir bölmenin aynı alt hücrelerinde eksprese edilemez. Bu tipik olarak adayın RNAi aracılı susturulması kullanılarak yapılır.

Özgüllüğü doğrulamak için substratın fosforil olmayan ilişkilendirilebilir bir mutantını kullanarak ikincil bir ekran gerçekleştirmek de mümkündür.