Name: Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin yüksek verimli tarama yöntemiyle kinaz-substrat çiftlerini nasıl tanımlayacağınızı. GST pulldown ve otoradyografi kullanarak hücre sinyalizasyonunda protein fosforilasyonunu hızla analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NSERC hibe tarafından desteklenmiştir 386634. Biz yararlı tartışmalar için Screaton Lab üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Reaktifler, Tabaklar ve Hücreleri 1. Hazırlık <ol><li> 25 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5 mM EDTA, pH 8.0,% 0.5 Triton X-100, 5 mM p-gliserofosfat,% 5 gliserol, 500 ml lizis tamponu sağlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. Kullanmak 1 mM ditiotreitol (DTT), 1mM fenilmetil sülfonil fluorür (PMSF) ve 1 mM sodyum vanadat eklemek için hemen önce. Bu aşamadan sonra, PMSF bir durulama tamponu içinde gerekli değildir. </li><li> 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-gliserofosfat (FW 216), 2 mM sodyum vanadat: 10x Kinaz Tamponu 20 ml sağlayın. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza. Kullanmak 5 mM DTT eklemek için hemen önce. </li><li> 300 uM adenosin trifosfat (ATP), 66 mM MgCl2, -20 ° C&#39;de 33 mM MnCl 2. 1 ml&#39;lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza: 10x M-ATP tamponu 20 ml sağlayın. </li><li> 2x sodyum dodesil sülfat 100 ml Yap (SDS) lizis tamponu: 1,5 g Tris baz, 20 ml gliserol, 30 ml H2O Eritin ve HCI ile 6.8 pH&#39;a ayarlanır. 40 Ekleml% 10 SDS, 100 ml ses seviyesini ayarlamak. 25 mg bromofenol mavi ekleyin. </li><li> Noktası buna uygun olarak, 96 gözlü levhalar ve etiket plakaları setleri göz başına bir GST-kinaz kodlayan 14 25 ng / | il memeli ekspresyon plazmidi 4 ul. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de dondurularak mühür ve plakalar. </li><li> Transfeksiyondan 1-2 gün önce, CO2 (son% 5) ile desteklenmiş 37 ° C inkübatör içinde bir kültür HEK293T tamamlandı Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) +% 10 cenin sığır serumu (FBS) hücreler ve antibiyotik. Ve tripsin ile Passage stok genişleme sırasında&gt;% 80 konfluent haline izin vermez. 6 x 10 7 hücrelerinin en az ekran (80% birleştiği noktada HEK293T hücrelerinin yaklaşık 3 x 15 cm yemekleri) için gereklidir. </li></ol> 2. Transfeksiyon Not: Tüm protokolün bir akış şeması için Şekil 1&#39;e bakınız. <ol><li> Kinaz plazmidler içeren plakalar donduruldu varsa, oda sıcaklığı a at çözülmend kuyu altındaki nemi toplamak için 3 dakika boyunca 1900 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Lipit bazlı transfeksiyon reaktifi 312,7 ul düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 8,6 ml karıştırın. 5 dakika bekletin. </li><li> Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak her bir kuyucuğa, düşük serum ortamı 10 ul ekle. </li><li> Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak adım 2.2 düşük serum ortamı / transfeksiyon reaktifi karışımı oyuk başına 10 ul ekle. 20 ila 45 dakika bekletin. </li><li> Tam DMEM, 80 ml ​​7.5 x 10 5 hücre / ml&#39;de yeniden süspanse 293T hücreleri. Ve bir standart birim kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak göz başına hücre süspansiyonu (yani, 7.5 x 10 4 hücre), 100 ul ekle. </li><li> Homojen hücre dağılımı için mikroskop altında kuyu kontrol edin ve 24 saat boyunca inkübatör dönmek. </li></ol> 3. GST-kinaz Düşürme <ol><li> F yapresh: H2O 540 ul 0.2 M sodyum vanadat 60 ul karıştırılarak 4 mM pervanadate çözeltisi Bir ikinci tüp karışımı 30% peroksit 2,7 ul PBS içinde 1.4 mi. Birlikte iki çözüm ekleyin ve kullanmadan önce 15 dakika bekletin. </li><li> (Bu oyuk çok fazla türbülans yaratır gibi bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmayın) Aşama 3.1&#39;de elde pervanadate 2.5 ul ve ardından, her bir çukura 0.25 M CaCI2 2 ul dağıtmak çok kanallı pipet kullanarak. 10 dakika boyunca 37 ° C &#39;de, her plaka inkübe ve daha sonra buz üzerine yerleştirin. </li><li> Bölüm 1 (reaktiflerinin preparasvonu) &#39;de gösterildiği gibi DTT, PMSF ve sodyum vanadat eklenerek liziz tamponu 35 ml hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde plakaları tutulması, her bir kuyunun bir vakum aspiratörü kullanarak orta çıkarın. Hemen standart kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 50 ul / oyuk buz soğuğu lizis tamponu ilave edin. Parçalamak için buz üzerinde 30 dk bekletin (opsiyonel: plat sızdırmazlık burada gerekirse durdurabilirsinize ve -80 ° C&#39;de saklama. Buz üzerinde, çözülme plakaları) devam etmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1900 x g&#39;de Spin plakalar. </li><li> Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanılarak hücreler kazıyın ve içeriğini aktarmak uygun V-tabanlı 96 gözlü levhalar etiketli. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1900 x g&#39;de Spin plakalar. </li><li> Spin sırasında, bir durulama maddesi olarak 100 ul / oyuk (PMSF) olmadan, buz sıcaklığında lizis tamponu ile glutatiyon kaplı plakalar (her biri 96-delikli plaka için bir adet) doldurun. Buz üzerinde tabak tutun. </li><li> Santrifüj V-tabanlı plakalar çıkarın. Bir kerede bir, bir kağıt havlu üzerine lizis tamponu ve leke dışarı sallamak için bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Alt pelet rahatsız değil dikkatli olmak, plaka devirme ve çok kanallı pipet kullanarak glutatyon plakalarına V-tabanlı plakalardan lizis tamponu aktarın. Kapak plakaları ve bağlama en az 2 saat süreyle buz üzerinde bırakın. </li><li> 2 saat bağlama aşamasında sonuna yakın, t sağlanması, bir radyoaktivite iş istasyonunu hazırlamakO gerekli güvenlik önlemleri radyoaktif çalışmalar için yerdesiniz. 30 ° C olarak ayarlayın hibridizasyon fırın. </li><li> Bu aşamada gerekli değildir Bölüm 1. PMSF belirtildiği gibi ilave DTT ve sodyum vanadat ile liziz tamponu 200 ml hazırlayın. </li><li> Lizis tamponu silkelemek ve bir kağıt havlu üzerine örtecek bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Durulayın kuyular (PMSF olmadan) 100 ul lizis tamponu ile 3x. Devam etmek için hazır olana kadar durulama saklayın - kuyular kuru oturup izin vermeyin. </li><li> 10x stok seyreltilmesi ve standart bir ses kaseti ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 1x KB 50 ul 1. Durulama plakalar bir kere daha bölümünde belirtildiği gibi DTT ekleyerek 1x kinaz tamponu (KB) içinde 55 ml hazırlayın. Çözelti A hazır olana kadar kuyularda 1x KB bırakın: <ol><li> 15,9 ml kadar 530 ilgi substratın ug, miyelin bazik protein, 500 ug (MBP), 10x 2,65 ml KB, 1 M DTT 13.25 ul, ve H2O için 500 eklenerek çözelti bir hazırlayın. </li></ol></li&gt; <li> Bir kerede bir, 1x KB durulama kaldırmak kağıt havlu üzerine leke ve hemen bir küçük hacimli kaseti ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak Çözüm A 30 ul eklemek için lavabonun üzerinde plakları ters çevirin. Buz üzerinde tabak tutun. </li><li> 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gama 32P ATP, ve H2O ile 10 ml ilave etmek suretiyle radyoaktivite çalışma alanında Çözelti B hazırlayın. <ol><li> Iyi İtme kuvveti nedeniyle karıştırma yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak başına Çözüm B 20 ul ekleyin. Kapak ve 30 dakika boyunca 30 ° C hibridizasyon fırında inkübe edin. </li></ol></li><li> 30 dakika sonra, buz geri plakaları aktarın. Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanarak 2x SDS lizis tamponu 50 ul ekle. Bir sonraki adımda, bu noktada gerçekleştirilebilir, ya da uygun kadar -20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile plakaları sızdırmaz olabilir. </li></ol> 4. Koşu, Boyama ve Kurutma Jeller Not: Tüm çalışmalar bir alan DESIGNA&#39;da yapılmalıdırradyoaktivite ted. <ol><li> Hibridizasyon fırında açın ve 85 ° C&#39;ye ayarlayın. Oda sıcaklığında Plakaları eritin. Bir kez fırın fırın ve 10 dk numune denatüre etmek için inkübe sıcaklık, devir plakaları ulaşmıştır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak her reaksiyonun 15 ul yükleyin 26-iyi prekast jeller aynı anda birden fazla kuyu doldurun. Bakım Bütün ipuçlarını mukabil önce iyice örnekleri ekleyerek uyum dikkat edilmelidir. Bu unincorporated ATP içerdiği izleme boya (mavi çizgi) jel alt kaçıp izin vermeyin, 150 V&#39;de jel çalıştırın. </li><li> Jeller sökün ve bir neşter veya filmleri overexpose gibi cetvel kullanarak tüzel kişiliği olmayan ATP (mavi çizgi) kesti. Etiketli kaplar içinde jeller yerleştirin ve 15 dakika için Coomassie boyası ile kaplayın. </li><li> Kısaca, Coomassie leke çıkarmak suyla durulayın jeller ve çözüm destain ekleyin. Jeller destain proteinler açıkça görünür olana kadar. MBP için bir bant ve alt tabaka için bir grup olmalıdırHer numune için görünür. </li><li> Jeller kurutulması için: <ol><li> Filtre kağıdı büyük kesin, kurutma üzerine yerleştirin. </li><li> Bu pürüzsüz olana kadar damıtılmış su içinde, bir selofan bir plaka ıslatın ve ücretsiz kırışıklık ve kağıdın üstüne yerleştirin. </li><li> Jellerin düzen not ederek, selofan levha üstünde jeller yatırın. İkinci selofan sayfasını ıslatın ve jeller üstüne yerleştirin. </li><li> Güzel bir üniforma yüzey tüm kabarcıklar (bir tabak sızdırmazlık silindir bunun için iyi çalışır) dışarı rulo. , Kapağını kapatın vakum açın ve 80 ° C&#39;de 3 saat boyunca jeller kurulayın. </li></ol></li><li> Jeller kuru olduğunda, sinyal yoğunlaştırmak için bir ekran kullanılarak XAR filmi bunları ortaya çıkarmak. Saran wrap veya plastik torba ile kaseti sarın ve don dışında tutmak için bant ile mühür. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca kaseti saklayın. </li></ol> 5. XAR Filmleri Geliştirme <ol><li> Ertesi gün, dondurucudan kaseti çıkarmak ve oda sıcaklığında çözülme sağlar. Filmi geliştirinkaranlık oda üreticinin talimatlarına göre bir film işlemcisi kullanılarak. Not: kinaz substrat çiftlerinin kanıt filmleri inceleyin. İkinci uzun pozlama da zayıf fosforilasyon olaylarını tespit etmek için yararlı olabilir. </li></ol>

<ol><li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser%2FThr-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li>
<li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+CT+%22Posttranslation+Modification+of+Proteins%3A+Expanding+Nature%27s+Inventory%22">Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory</a>. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li>
<li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li>
<li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomics%3A+methods+for+deciphering+the+kinome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li>
<li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li>
<li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKIS%3A+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinform%22%5BJournal%5D)">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247(2013).</li>
<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li>
<li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li>
<li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways%3A+control+of+CRTC2%2FTORC2+by+the+AMPK+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li>
<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yaklaşımı 14,15 tanımlayan özgün yayınlar bu yana, 180 GST-kinazlar orijinal kütüphanesi insan proteini kinome 420 üye, ya da ~% 80 genişletilmiştir. Genişletilmiş kütüphanesi ile, açıklanan protokol (gerekli görüldüğünde gibi) fosforlu ve dijital sinyal iyileştirme kullanılarak kısaltılmış olabilir, hangi filmleri geliştirmek için 4-5 gün sonra 1-4 gün sürer. Dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adımlar (protokol bakış için Bkz: Şekil 1) vardır. İlk olarak, hücre için stoklar sağlığı (mikop...

Protein post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) hücre içi iletişim için gereklidir. Belki de en iyi incelenen PTMS hücre altı konumlanması, konformasyon ve kararlılık, biyokimyasal aktivitesi de dahil olmak üzere protein fonksiyonları, bir sayısız düzenleyen protein kinazlar tarafından katalize fosforilasyon vardır. Hedef proteinler üzerinde fosforilasyon tanımlanması triptik fosfopeptıt haritalaması ile fosforile peptidler 1,2 zenginleştirilmiş örnekler kullanılarak artık standart proteomik tekniklerle gerçekleştirilebilir. Ifade proteomun dörtte üçü 3 fosforile olması beklenen ve 1.000.000 6 kadar tahminleri ile 200,000 fosforilasyon siteleri 5 tespit edilir olsa da, bunların çoğu bir yol ya da protein kinazı sinyal, herhangi bir verilen biyoloji sahiptir. Fosforile sitelerin tespiti nispeten büyük bir meydan okuma olduğunu, görece kolay olmasına karşınAlt tabaka çiftleri: bu siteleri hedefliyor soydaş kinaz (ler), biz haritalama kinaz olarak adlandırdığımız bir süreci tanımlamak. Alt tabaka çiftleri tarif edilmiştir, ya ilgi kinaz ile başlayan ve yüzeylerde arıyor veya ilgi bir alt tabaka ile başlayan ve bir modifiye kinaz deneysel 7-11 veya hesaplama 12 bulmaya çalışırken: kinaz tanımlamak için çeşitli yaklaşımlar. Bilinen bir fosforile edilmiş substrat için kinazlar tespit etmek için, alt-tabaka biyoinformatik ile çökeltilebilir kompleks oluşturmak kinazlar fosforilatlanmış bir tortu (konsensüs sitesi) yan, hem de tespit amino asitlerin kısa korunmuş dizisini içeren proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, zaman alıcı ve genellikle başarı ile uymayan. Biz hızla belirli bir alt tabaka 13 fosforile edebilir kinazlar belirlemek için sistematik bir işlevsel yaklaşım geliştirdi. Ekran tahlil mükemmel spesifik üretirPotansiyel soydaş kinazlar için çok net bir seçim ile Sığ. Biyolojik sinyalleşme fosforilasyon merkezi konumu göz önüne alındığında, ekran hemen hemen tüm hücre sinyal yollarının 14-16&#39;da keşfi için yararlıdır. Ekran, insan protein kinazlann bir kütüphane ile geniş çaplı bir kinaz tahlili yerine getirilmesini kapsamaktadır. Kinazlar bakteriyel glutation S-transferaz (GST) proteini ile etiketlenmiş ve rekombinant enzimlerin, yani memeli hücre özütlerinden saflaştırıldı - bakterilerden hazırlanmış olan farklı - genellikle için gerekli yukarı akış protein kinazların varlığında oluşturulur Rekombinant enzimlerin in vitro aktiviteye sahip oldukları. Serin, treonin ve tirosin kinaz aktivitesi alt kinaz aktivasyonu için gereken Nitekim, maya 10 içinde mevcut olan, maya genomu 500 gen üzerinde 17 memeli kinome, için önemli ölçüde daha karmaşık hale gelmiştir belirten 122 protein kinazlan kodlar regulayüksek mertebeden organizmalara özgü süreçleri te. Ayrıca, hücre biyolojisi ve (örneğin, vb küçük moleküller, büyüme faktörleri, hormonlar, gibi), insan hastalığı ile ilgili çeşitli farklı uyarıcı etkisi, uygun bir çerçevede 14,15 modüle kinaz aktivitesi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Lizis tamponu</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Protokol adımına bakın 1.1</td></tr><tr><td>10x kinaz tamponu</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Protokol adımına bakın 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Protokol adımına bakın 1.3</td></tr><tr><td>İnsan kinaz plazmitleri</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST etiketli</td></tr><tr><td>evde 96 kuyulu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>takviyesi 100&nbsp; U/ml penisilin, 100&nbsp; &#956; g/ml streptomisin, %10 fetal buzağı serumu.</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm hücre kültürü kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Azaltılmış serum ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik sıvı dağıtıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Küçük kaset eklentisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standart kaset eklentisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadat</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Protokol adım 3.1'e bakın</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (1-10 &#956; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-tabanlı 6 oyuklu plakalar</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon kaplı 96 oyuklu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST etiketli substrat</td><td>Evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>Miyelin Temel Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Tekrarlayıcı pipet (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gama-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lizis tamponu (100&nbsp; ml)</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Protokol adım 1.4'e bakın</td></tr><tr><td>26 oyuklu prekast TGX jeller</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gerekli jel yüzdesi, ilgilenilen substratın moleküler ağırlığına bağlıdır</td></tr><tr><td>Coomassie boyası</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>%0.1 Coomassie R250, %10 asetik asit, %40 metanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>%10 asetik asit, %20 metanol</td></tr><tr><td>Etiketli jel kaplar</td><td>Evde</td><td></td> üretilmiştir <td>Boş uç kutularından kullanılmış plastik kapaklar, sadece bir jel içerecek kadar büyük</td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Selofan levhalar (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Jel kurutucu</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Çift emülsiyonlu otoradyografi filmi</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film kaseti</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunlaştırıcı ekran</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plaka sızdırmazlık kauçuk rulo</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verimli tarama kullanma kinaz-substrat Çiftlerinin kimlik

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Bu yeni sinyal transdüksiyon yollar aydınlatmak için kullanılabilir fosforile edilmiş alt tabakalar için özel bir insan protein kinazlar tespit için bir tarama platformu geliştirdik. Yaklaşımımız saflaştınldı GST-etiketli insan protein kinazların bir kütüphane ve ilgi konusu bir rekombinant protein alt-tabakanın kullanımı ile ilgilidir. Biz, CREB Düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici 2 (CRTC2) bir glükoz ayarlı bir site için kinaz MAP / mikrotübül afinite düzenleyici kinaz 2 (MARK2) tanımlamak için bir beta hücre çoğalması için gerekli olan bir proteini, hem de bu teknolojiyi kullanmıştır tirozin Axl ailesi adaptör protein ELMO fosforilasyonu, hücre metastazı düzenleyicileri olarak kinazlar. Biz bu teknolojiyi tanımlamak ve hücrelerin çevresel uyaranlara tepki nasıl kapsamlı bir haritasını oluşturmak için nasıl yardımcı olabileceğini tartışmak.

Bir ekranda Örnek sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. 180 kinazlar CRTC2 gibi klasik kinaz deneyi alt-tabaka miyelin bazik proteini (MBP) ile ilgili aa 268-283 tekabül eden bir GST-etiketli peptid alt-tabakası kullanılarak taranmıştır. Sadece iki kinazlar MARK2 ve yüksek ölçüde ilişkili kinaz MARK3 CRTC2 peptidi fosforile. Birçok fosforlaştınlabilen kalıntısı içerir ve jelin alt kısmına doğru, 18 kDa&#39;da çalışan olarak MBP, tüm deneylerde bir iç kontrol olarak dahil edilir. Bu ...

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kapasiteli tarama yöntemlerini kullanarak ilgilenilen bir substratı fosforile eden kinazları belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kinazları glutatyon S-transferaz veya GST olarak ifade eden plazmidlerle hücrelerin transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir GST kinaz pulldown işlemi yapmaktır.Ardından, örnekler jellere yüklenir, ardından bu jeller yürütülür ve kumasi brilliant blue boyası ile boyanır. Son adım, jellerin kurutulması ve otoradyografi filmine maruz bırakılmasıdır. Nihayetinde, elde edilen filmlerin banyo edilmesi ve yorumlanmasıyla, her bir kuyucuk farklı bir kinaz analizini temsil ettiğinden, kinaz substrat çiftleri tanımlanabilir.Bilinen bir fosforile substrat için bir kinazı belirlemeye yönelik mevcut yöntemler arasında; substrattaki bir konsensüs bölgeyi aramak için biyoinformatik yaklaşımların kullanılması, biyokimyasal teknikler ve deneme-yanılma yöntemiyle kinaz ve substratlar arasındaki komplekslerin tespit edilmesi ve bilinen biyolojik işlevlerine dayanarak konsensüs substratların aranması yer almaktadır. Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır ve her zaman başarıyla sonuçlanmazlar. Bizim yaklaşımımız, fonksiyonel sonuçlara dayanarak kinaz-substrat çiftlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır.Bu yöntem için ilk fikri geliştirdiğimizde, in vitro spesifisitenin yetersiz olacağından endişe duyuyorduk. Ancak görüldüğü üzere, substrat spesifitesi mükemmeldir ve taramalarda genellikle yalnızca aile üyesi kinazların belirli bir substratı fosforile edebildiğini görmekteyiz. Bu durum, her taramada birden fazla substrat kullanarak yaptığımız multipleks çalışmalarda özellikle belirgindir ve prosedürün etkinliğini kanıtlamaktadır. Laboratuvarımdan teknisyen Courtney, prosedüre metin protokolünde açıklandığı şekilde reaktiflerin, plakaların ve hücrelerin hazırlanmasıyla başlayacaktır.Kinaz plazmitleri içeren plakalar dondurulmuşsa, oda sıcaklığında çözdürün ve kuyucukların dibindeki nemi toplamak için 1900 ×g'de üç dakika santrifüjleyin. 8,6 mL indirgenmiş serumlu besiyerini 312,7 µL lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve karışımın her bir kuyucuk için beş dakika bekletilmesine izin verin. Kinaz plazmitlerini içeren 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL indirgenmiş serumlu besiyeri ekleyin.Küçük hacimli bir kaset takılı otomatik sıvı dağıtıcı kullanarak, kuyuk başına 10 µL indirgenmiş serumlu ortam transfeksiyon reaktifi karışımı ekleyin ve plakanın 20 ila 45 dakika boyunca beklemesine izin verin. Ardından, 2 93 T hücrelerini 80 mL tam delcos modifiye equals ortamı veya DMEM içinde mililitre başına 0,75 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve kuyuk başına 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Standart hacimli bir kaset takılı otomatik sıvı dağıtıcı kullanarak, plakayı 24 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre geri yerleştirmeden önce kuyuklardaki hücre dağılımının homojen olduğunu mikroskop altında kontrol edin.GST kinaz çöktürme (pull down) deneyine başlamak için, 60 µL 0.2 M sodyum vanadat ile 540 µL suyu karıştırarak 4 mM vanadat çözeltisi hazırlayın. İkinci bir tüpte, 2.7 µL %30 peroksit ile 1.4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) karıştırın. İki çözeltiyi birbirine ekleyin ve kullanmadan önce karışımı 15 dakika boyunca bekletin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyucuğa iki mikrolitre 0,25 molar kalsiyum klorür ve ardından 2,5 mikrolitre kanıtlanmış tarih çözeltisi ekleyin. Her plakayı 37 santigrat derece sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin ve ardından buz üzerine yerleştirerek plakaları buzda tutun. Her kuyucuktaki medyumu vakumla uzaklaştırın ve hemen ardından kuyucuk başına 50 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.Standart kasetle donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, hücrelerin parçalanması için plakayı buz üzerinde 30 dakika bekletin. Plakaları 4 °C'de, üç dakika boyunca 1900 ×g'de santrifüjledikten sonra, hücreleri çok kanallı bir pipet yardımıyla her kuyucuktan sıyırın ve tüm içeriği uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın. 96 kuyucuklu plakaları 4 °C'de, 10 dakika boyunca 1900 ×g'de santrifüjleyin; santrifüj işlemi sırasında, glutatyon kaplı plakaların her kuyucuğuna 100 µL buz gibi soğuk lizis tamponu doldurun.Durulama işlemi sırasında plakaları buz üzerinde tutun. Alt plakaların santrifüj edilmesinin ardından, lizis tamponunu boşaltmak için glutatyon plakalarını bir lavabonun üzerinde ters çevirip sallayın ve kağıt havluyla kurulayın. Plakayı eğerek ve çok kanallı pipet kullanarak, dipteki peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek lizis tamponunu V tabanlı plakalardan glutatyon plakalarına aktarın.Ardından plakların üzerini kapatın ve minimum iki saat boyunca buz üzerinde bekletin. İki saatlik bağlama adımının sonuna doğru bağlama işlemini gerçekleştirmek için, radyoaktif çalışmalar için gerekli güvenlik önlemlerinin alındığından emin olarak bir radyoaktivite iş istasyonu hazırlayın. Hibridizasyon fırınını 30 °C'ye ayarlayın.Glutasyon plakalarını, lizis tamponunu boşaltmak için bir lavabonun üzerinde ters çevirerek sallayın ve kağıt havluyla kurulayın. Kuyucukları, PMSF içermeyen 100 µL lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Kuyucukların kurumasına izin vermeyin.Devam etmeye hazır olana kadar durulama çözeltisinde bekletin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde 55 mililitre 1X kinaz tamponu veya 1X KB hazırlayın. Standart hacim kaseti takılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak plakadaki her kuyucuğa 50 mikrolitre 1X KB ekleyin.Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, ilgili substratı ve miyelin temel proteinini veya MVP'yi içeren çözelti A'yı sırasıyla hazırlayın. 1XKB durulama çözeltisini uzaklaştırmak için plakaları bir lavabonun üzerinde ters çevirip kağıt havluya boşaltın ve hemen küçük hacimli kasetle donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak 30 µL çözelti A ekleyin. Plakaları buz üzerinde tutun.Ardından, kuyuk başına 20 µL çözelti B olacak şekilde, metin protokolünde açıklandığı üzere radyoaktivite çalışma alanında çözelti B'yi hazırlayın. Atım kuvveti sayesinde karıştırmaya yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak plağı kapatın ve 30 °C'lik bir hibridizasyon fırınında 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra plakları tekrar buz üzerine aktarın.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 50 µL iki x sodyum dodesil sülfat veya SDS lizis tamponu ekleyin. Bu bölümdeki tüm çalışmalar radyoaktivite için belirlenmiş bir alanda yürütülmelidir. Hibridizasyon fırınını açın ve 85 °C'ye ayarlayın.Fırın istenen sıcaklığa ulaştığında, plakaları fırına aktarın ve örnekleri denatüre etmek için 10 dakika inkübe edin. Ardından, her reaksiyondan 15 microliters olacak şekilde 26 kuyucuklu hazır jellere yükleyin.Birden fazla kuyucuğu aynı anda doldurmak için çok kanallı pipet kullanırken, tüm uçların karşılık gelen kuyucuklarla hizalandığına dikkat edilmelidir. Örnekleri eklemeden önce jeli 150 volt değerinde çalıştırın. Birleşmemiş ATP'yi içerdiği için mavi hattın jelin altından dışarı çıkmasına izin vermeyin. Ardından, filmlerdeki jel pozlamasını koyulaştıracağı için jelleri sökün ve birleşmemiş ATP'yi uzaklaştırın.Jelleri etiketli kaplara yerleştirin ve 15 dakika boyunca kumasi boyası ile örtün. Ardından, kumasi boyasını uzaklaştırın. Jelleri kısa bir süre suyla durulayın ve detein çözeltisi ekleyin.Proteinler net bir şekilde görünene kadar jelleri bekletin. Her örnek için bir MVP bandı ve bir substrat bandı görülmelidir. Jelleri kurutmak için büyük bir filtre kağıdı parçası kesin ve kurutucunun üzerine yerleştirin.Bir selofan tabakasını, pürüzsüz ve kırışıklıklar giderilene kadar distile su ile ıslatın ve kağıdın üzerine yerleştirin. Jelleri, sıralarını not ederek selofan tabakasının üzerine dizin. İkinci bir selofan tabakasını ıslatın ve jellerin üzerine yerleştirin.Düzgün ve üniform bir yüzey elde etmek için tüm kabarcıkları dışarı itin. Kapağı kapatın, vakumu açın ve jelleri 80 °C'de üç saat boyunca kurutun. Jeller kuruduktan sonra, sinyali güçlendirmek için bir ekran kullanarak onları çift emülsiyonlu otoradyografi filmine maruz bırakın.Kaseti, dondurucuda gece boyunca -80 °C'de saklamadan önce kırağı oluşumunu önlemek için streç film veya plastik bir torba ile sarın ve bantla mühürleyin. Ertesi gün, kaseti dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözünmesini bekleyin. Filmi, gösterilen üretici talimatlarına uygun olarak bir film işlemcisi kullanarak karanlık odada geliştirin.Burada, 180 kinazın tarandığı bir çalışmadan elde edilen temsili sonuçlar yer almaktadır. Tarama işleminde, kreb düzenlemeli transkripsiyonel koaktivatör iki veya CRTC2'nin 268 ile 283 arasındaki amino asitlerine karşılık gelen GST etiketli bir peptid substrat ile klasik kinaz assay substratı olan myelin basic protein veya MBP kullanılmıştır. Yalnızca mark iki ve onunla yüksek derecede ilişkili olan kinaz mark üç, CRTC2 peptidini fosforile etmiştir. MBP, birçok fosforile edilebilir kalıntı içermesi ve jel tabanına doğru 18 kilodaltonda ilerlemesi nedeniyle tüm assaylerde dahili kontrol olarak eklenmiştir.Bu durum, özgüllüğün yorumlanmasına olanak tanır. Bazı kinazlar, bir substratı ve MVP'yi güçlü bir şekilde fosforile edecektir. Burada dikkat edilmesi gereken husus, yalnızca GST içeren kuyucukların her zaman bir miktar endojen kinaz aktivitesini saflaştırmasıdır.Bu nedenle, analizde her zaman bir arka plan fosforilasyonu mevcuttur. Bu durum, substratın fosforilasyonunun gerçek olduğu ihtimalini dışlamasa da, in vitro ortamda kinazın daha az seçici olabileceğini göstermektedir. Kinaz substrat özgüllüğüne ilişkin sonuçlar çıkarmak için farklı moleküler ağırlıklara sahip birden fazla substrat eklemek özellikle bilgilendiricidir.Tarama in vitro olduğu ve in vivo ortamda ek karmaşıklık düzeyleri ortaya çıktığı için, aday bir kinazın hücrelerde doğrulanması gerekir. Örneğin, aday bir kinaz in vitro ortamda bir substratı fosforile etme kapasitesine sahip olabilir ancak substratla aynı hücre tipinde veya bir kompartıman içindeki aynı alt hücrelerde eksprese edilmeyebilir. Bu işlem tipik olarak, adayın RNAi aracılı susturulması kullanılarak gerçekleştirilir.Özgüllüğü doğrulamak için substratın fosforilasyonla ilişkili olmayan bir mutantı kullanılarak ikincil bir tarama yapmak da mümkündür.

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Bu videoda, kendiliğinden reaktif CD4+CD8+ çift pozitif immatür timositlerin apoptozunu modüle eden küçük moleküllü kinaz inhibitörlerini tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Apoptoz, çift pozitif timositlerde, anti-CD3- ve anti-CD28 kaplı manyetik boncuklarla aktive edilerek indüklenir; Bunu, inhibitörlerin apoptotik belirteç ekspresyonunu modüle edip etmediğini tespit etmek için küçük moleküllü bir inhibitör tedavisi ve akış sitometrisi analizi takip eder.

Güçlü TCR Sinyallerine Timosit Yanıtını Modüle Eden Kinaz İnhibitörlerinin Belirlenmesi

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Öğrenin yüksek verimli tarama yöntemiyle kinaz-substrat çiftlerini nasıl tanımlayacağınızı. GST pulldown ve otoradyografi kullanarak hücre sinyalizasyonunda protein fosforilasyonunu hızla analiz edin.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Daha fazla video keşfet