Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kapasiteli tarama yöntemlerini kullanarak ilgilenilen bir substratı fosforile eden kinazları belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kinazları glutatyon S-transferaz veya GST olarak ifade eden plazmidlerle hücrelerin transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir GST kinaz pulldown işlemi yapmaktır.

Ardından, örnekler jellere yüklenir, ardından bu jeller yürütülür ve kumasi brilliant blue boyası ile boyanır. Son adım, jellerin kurutulması ve otoradyografi filmine maruz bırakılmasıdır. Nihayetinde, elde edilen filmlerin banyo edilmesi ve yorumlanmasıyla, her bir kuyucuk farklı bir kinaz analizini temsil ettiğinden, kinaz substrat çiftleri tanımlanabilir.

Bilinen bir fosforile substrat için bir kinazı belirlemeye yönelik mevcut yöntemler arasında; substrattaki bir konsensüs bölgeyi aramak için biyoinformatik yaklaşımların kullanılması, biyokimyasal teknikler ve deneme-yanılma yöntemiyle kinaz ve substratlar arasındaki komplekslerin tespit edilmesi ve bilinen biyolojik işlevlerine dayanarak konsensüs substratların aranması yer almaktadır. Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır ve her zaman başarıyla sonuçlanmazlar. Bizim yaklaşımımız, fonksiyonel sonuçlara dayanarak kinaz-substrat çiftlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır.

Bu yöntem için ilk fikri geliştirdiğimizde, in vitro spesifisitenin yetersiz olacağından endişe duyuyorduk. Ancak görüldüğü üzere, substrat spesifitesi mükemmeldir ve taramalarda genellikle yalnızca aile üyesi kinazların belirli bir substratı fosforile edebildiğini görmekteyiz. Bu durum, her taramada birden fazla substrat kullanarak yaptığımız multipleks çalışmalarda özellikle belirgindir ve prosedürün etkinliğini kanıtlamaktadır. Laboratuvarımdan teknisyen Courtney, prosedüre metin protokolünde açıklandığı şekilde reaktiflerin, plakaların ve hücrelerin hazırlanmasıyla başlayacaktır.

Kinaz plazmitleri içeren plakalar dondurulmuşsa, oda sıcaklığında çözdürün ve kuyucukların dibindeki nemi toplamak için 1900 ×g'de üç dakika santrifüjleyin. 8,6 mL indirgenmiş serumlu besiyerini 312,7 µL lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve karışımın her bir kuyucuk için beş dakika bekletilmesine izin verin. Kinaz plazmitlerini içeren 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL indirgenmiş serumlu besiyeri ekleyin.

Küçük hacimli bir kaset takılı otomatik sıvı dağıtıcı kullanarak, kuyuk başına 10 µL indirgenmiş serumlu ortam transfeksiyon reaktifi karışımı ekleyin ve plakanın 20 ila 45 dakika boyunca beklemesine izin verin. Ardından, 2 93 T hücrelerini 80 mL tam delcos modifiye equals ortamı veya DMEM içinde mililitre başına 0,75 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve kuyuk başına 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Standart hacimli bir kaset takılı otomatik sıvı dağıtıcı kullanarak, plakayı 24 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre geri yerleştirmeden önce kuyuklardaki hücre dağılımının homojen olduğunu mikroskop altında kontrol edin.

GST kinaz çöktürme (pull down) deneyine başlamak için, 60 µL 0.2 M sodyum vanadat ile 540 µL suyu karıştırarak 4 mM vanadat çözeltisi hazırlayın. İkinci bir tüpte, 2.7 µL %30 peroksit ile 1.4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) karıştırın. İki çözeltiyi birbirine ekleyin ve kullanmadan önce karışımı 15 dakika boyunca bekletin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyucuğa iki mikrolitre 0,25 molar kalsiyum klorür ve ardından 2,5 mikrolitre kanıtlanmış tarih çözeltisi ekleyin. Her plakayı 37 santigrat derece sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin ve ardından buz üzerine yerleştirerek plakaları buzda tutun. Her kuyucuktaki medyumu vakumla uzaklaştırın ve hemen ardından kuyucuk başına 50 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.

Standart kasetle donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak, hücrelerin parçalanması için plakayı buz üzerinde 30 dakika bekletin. Plakaları 4 °C'de, üç dakika boyunca 1900 ×g'de santrifüjledikten sonra, hücreleri çok kanallı bir pipet yardımıyla her kuyucuktan sıyırın ve tüm içeriği uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın. 96 kuyucuklu plakaları 4 °C'de, 10 dakika boyunca 1900 ×g'de santrifüjleyin; santrifüj işlemi sırasında, glutatyon kaplı plakaların her kuyucuğuna 100 µL buz gibi soğuk lizis tamponu doldurun.

Durulama işlemi sırasında plakaları buz üzerinde tutun. Alt plakaların santrifüj edilmesinin ardından, lizis tamponunu boşaltmak için glutatyon plakalarını bir lavabonun üzerinde ters çevirip sallayın ve kağıt havluyla kurulayın. Plakayı eğerek ve çok kanallı pipet kullanarak, dipteki peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek lizis tamponunu V tabanlı plakalardan glutatyon plakalarına aktarın.

Ardından plakların üzerini kapatın ve minimum iki saat boyunca buz üzerinde bekletin. İki saatlik bağlama adımının sonuna doğru bağlama işlemini gerçekleştirmek için, radyoaktif çalışmalar için gerekli güvenlik önlemlerinin alındığından emin olarak bir radyoaktivite iş istasyonu hazırlayın. Hibridizasyon fırınını 30 °C'ye ayarlayın.

Glutasyon plakalarını, lizis tamponunu boşaltmak için bir lavabonun üzerinde ters çevirerek sallayın ve kağıt havluyla kurulayın. Kuyucukları, PMSF içermeyen 100 µL lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Kuyucukların kurumasına izin vermeyin.

Devam etmeye hazır olana kadar durulama çözeltisinde bekletin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde 55 mililitre 1X kinaz tamponu veya 1X KB hazırlayın. Standart hacim kaseti takılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak plakadaki her kuyucuğa 50 mikrolitre 1X KB ekleyin.

Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, ilgili substratı ve miyelin temel proteinini veya MVP'yi içeren çözelti A'yı sırasıyla hazırlayın. 1XKB durulama çözeltisini uzaklaştırmak için plakaları bir lavabonun üzerinde ters çevirip kağıt havluya boşaltın ve hemen küçük hacimli kasetle donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak 30 µL çözelti A ekleyin. Plakaları buz üzerinde tutun.

Ardından, kuyuk başına 20 µL çözelti B olacak şekilde, metin protokolünde açıklandığı üzere radyoaktivite çalışma alanında çözelti B'yi hazırlayın. Atım kuvveti sayesinde karıştırmaya yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak plağı kapatın ve 30 °C'lik bir hibridizasyon fırınında 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra plakları tekrar buz üzerine aktarın.

Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 50 µL iki x sodyum dodesil sülfat veya SDS lizis tamponu ekleyin. Bu bölümdeki tüm çalışmalar radyoaktivite için belirlenmiş bir alanda yürütülmelidir. Hibridizasyon fırınını açın ve 85 °C'ye ayarlayın.

Fırın istenen sıcaklığa ulaştığında, plakaları fırına aktarın ve örnekleri denatüre etmek için 10 dakika inkübe edin. Ardından, her reaksiyondan 15 microliters olacak şekilde 26 kuyucuklu hazır jellere yükleyin.

Birden fazla kuyucuğu aynı anda doldurmak için çok kanallı pipet kullanırken, tüm uçların karşılık gelen kuyucuklarla hizalandığına dikkat edilmelidir. Örnekleri eklemeden önce jeli 150 volt değerinde çalıştırın. Birleşmemiş ATP'yi içerdiği için mavi hattın jelin altından dışarı çıkmasına izin vermeyin. Ardından, filmlerdeki jel pozlamasını koyulaştıracağı için jelleri sökün ve birleşmemiş ATP'yi uzaklaştırın.

Jelleri etiketli kaplara yerleştirin ve 15 dakika boyunca kumasi boyası ile örtün. Ardından, kumasi boyasını uzaklaştırın. Jelleri kısa bir süre suyla durulayın ve detein çözeltisi ekleyin.

Proteinler net bir şekilde görünene kadar jelleri bekletin. Her örnek için bir MVP bandı ve bir substrat bandı görülmelidir. Jelleri kurutmak için büyük bir filtre kağıdı parçası kesin ve kurutucunun üzerine yerleştirin.

Bir selofan tabakasını, pürüzsüz ve kırışıklıklar giderilene kadar distile su ile ıslatın ve kağıdın üzerine yerleştirin. Jelleri, sıralarını not ederek selofan tabakasının üzerine dizin. İkinci bir selofan tabakasını ıslatın ve jellerin üzerine yerleştirin.

Düzgün ve üniform bir yüzey elde etmek için tüm kabarcıkları dışarı itin. Kapağı kapatın, vakumu açın ve jelleri 80 °C'de üç saat boyunca kurutun. Jeller kuruduktan sonra, sinyali güçlendirmek için bir ekran kullanarak onları çift emülsiyonlu otoradyografi filmine maruz bırakın.

Kaseti, dondurucuda gece boyunca -80 °C'de saklamadan önce kırağı oluşumunu önlemek için streç film veya plastik bir torba ile sarın ve bantla mühürleyin. Ertesi gün, kaseti dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözünmesini bekleyin. Filmi, gösterilen üretici talimatlarına uygun olarak bir film işlemcisi kullanarak karanlık odada geliştirin.

Burada, 180 kinazın tarandığı bir çalışmadan elde edilen temsili sonuçlar yer almaktadır. Tarama işleminde, kreb düzenlemeli transkripsiyonel koaktivatör iki veya CRTC2'nin 268 ile 283 arasındaki amino asitlerine karşılık gelen GST etiketli bir peptid substrat ile klasik kinaz assay substratı olan myelin basic protein veya MBP kullanılmıştır. Yalnızca mark iki ve onunla yüksek derecede ilişkili olan kinaz mark üç, CRTC2 peptidini fosforile etmiştir. MBP, birçok fosforile edilebilir kalıntı içermesi ve jel tabanına doğru 18 kilodaltonda ilerlemesi nedeniyle tüm assaylerde dahili kontrol olarak eklenmiştir.

Bu durum, özgüllüğün yorumlanmasına olanak tanır. Bazı kinazlar, bir substratı ve MVP'yi güçlü bir şekilde fosforile edecektir. Burada dikkat edilmesi gereken husus, yalnızca GST içeren kuyucukların her zaman bir miktar endojen kinaz aktivitesini saflaştırmasıdır.

Bu nedenle, analizde her zaman bir arka plan fosforilasyonu mevcuttur. Bu durum, substratın fosforilasyonunun gerçek olduğu ihtimalini dışlamasa da, in vitro ortamda kinazın daha az seçici olabileceğini göstermektedir. Kinaz substrat özgüllüğüne ilişkin sonuçlar çıkarmak için farklı moleküler ağırlıklara sahip birden fazla substrat eklemek özellikle bilgilendiricidir.

Tarama in vitro olduğu ve in vivo ortamda ek karmaşıklık düzeyleri ortaya çıktığı için, aday bir kinazın hücrelerde doğrulanması gerekir. Örneğin, aday bir kinaz in vitro ortamda bir substratı fosforile etme kapasitesine sahip olabilir ancak substratla aynı hücre tipinde veya bir kompartıman içindeki aynı alt hücrelerde eksprese edilmeyebilir. Bu işlem tipik olarak, adayın RNAi aracılı susturulması kullanılarak gerçekleştirilir.

Özgüllüğü doğrulamak için substratın fosforilasyonla ilişkili olmayan bir mutantı kullanılarak ikincil bir tarama yapmak da mümkündür.