Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Bu prosedürün genel amacı, dikkatli bir şekilde kontrol edilen nükleotid yükleme koşulları altında Row Ailesi GT P ACE'ler için protein bağlama ortaklarının nispi afinitelerini karşılaştırmaktır. Bu, ilk olarak, her biri aynı etiketle, örneğin yeşil floresan proteini veya GFP ile etiketlenmiş varsayılan rekabetçi bağlayıcı ortakların saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgilenilen GTPA'yı arındırmaktır.

Örneğin, RAC bir ve istenen GTPA sinyal durumunu elde etmek için uygun nükleotid ile yükleyin. Daha sonra, nükleotid yüklü gtpa, bir titrasyon bağlanma eğrisi elde etmek için sabit miktarda bir bağlayıcı rakip ve artan miktarlarda diğer bağlayıcı rakip ile inkübe edilir. Son adım, western blot ile hareketsiz hale getirilmiş GT pasına bağlı proteinleri çözmek ve iki bağlanma ortağı arasında paylaşılan GFP etiketi için zarı araştırmaktır.

Sonuç olarak, Western blot, her bir GFP etiketli bağlanma ortağının benzer miktarlarının GTPase tarafından yakalandığı nispi konsantrasyonları tanımlamak için kullanılır. Bu tekniğin eş çökeltme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gtpa'nın protein bağlama özelliklerinin hücredeki bağlı nükleotid tarafından belirlenmesidir. Bağlı nükleotid kararsızdır ve protein bağlanma verilerinin yorumlanmasını zorlaştırır.

Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi GST etiketli G tpa'nın saflaştırılması ve gtpa bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu ile başlayın. RIN, transfekte edilmiş hücrelerin şişelerini fosfat, tampon, salin veya PBS içinde depolar ve şişeyi beş dakika boyunca boşaltır. Serbest sıvıyı aspire edin, daha sonra hücreleri 500 mikrolitre lizis tamponunda bir mikro füj tüpüne kazıyın, hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede ters çevirerek parçalamak için karıştırın.

Lizis sırasında, iki lot 40 mikrolitre GFP tuzak boncuğunu üç kez taze lizis tampon tortusu ile yıkayın. Boncuklar, yıkamalar arasında iki dakika boyunca 2.700 kez G'de. Lizizi takiben, lizatları 10 dakika boyunca 21.000 kez G'de santrifüjleme ile berraklaştırın.

Rakip proteinlerin her birinin arıtılmış lizatını ayrı yıkanmış GFP tuzak boncuklarına aktarın. GFP füzyon proteinlerinin iki saat boyunca bağlanmasına izin verin, dört santigrat derecede ters çevirerek karıştırın. Yüklenen GFP tuzak boncuklarını lizis tamponunda iki kez ve yarışmada iki kez yıkayın.

Yıkama arasında iki dakika boyunca 2, 700 kez G'de çökeltme boncuklarının bağlanması tamponu. 40 mikrolitre 0.2 molar glisin ekleyerek ve 30 saniye boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek GFP füzyon proteinlerini elute edin, boncukları hemen 60 saniye boyunca 21.000 kez G'de çökeltin ve sıvıyı dört mikrolitre bir molar tris HCL içeren yeni bir füge tüpüne aktarın, saflaştırılmış proteine verilen zararı sınırlamak için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Her saflaştırılmış proteinin bir mikrolitresini western blot ile analiz edin ve üreticinin protokolüne göre kantitatif bir lekeleme sistemi kullanarak nispi verimi belirlemek için bir anti GFP antikoru ile araştırın.

Rekabet bağlayıcı tampon ilavesiyle molar protein konsantrasyonunu eşitleyin. 90 mikrolitre hazırlanmış GST rafına bir boncuk alın ve her adımda boncukları çökeltmek için manyetik bir parçacık sıralayıcı kullanarak nükleotid yükleme tamponu ile üç kez yıkayın. Tamponu boncuklardan aspire edin ve G-D-P-G-T-P veya nükleotid yüklemesi gerekip gerekmediğine bağlı olarak 100 mikrolitre nükleotid yükleme tamponu ekleyin.

Yarışma deneyi için, nükleotid yükleme kontrolleri için 60 mikrolitre GST raf bir boncuğa 12 mikrolitre 100 milimolar GDP, 12 mikrolitre 10 milimolar GTP gama S ekleyin veya nükleotid ekleyin. Kalan boncukları üç adet 10 mikrolitrelik kuata bölün ve her tüpe iki mikrolitre 100 milimolar GDP, iki mikrolitre 10 milimolar GTP gama S ekleyin veya nükleotid ekleyin. Boncuk karışımlarını 30 santigrat derecede 30 dakika boyunca çalkalama ile inkübe edin.

Deneysel karışıma ve kontrol karışımlarına bir molar magnezyum klorür ekleyerek nükleotid bağlı rafı stabilize edin Yarışma bağlamasını gerçekleştirmek için. Altı mikro füj tüpü kurun. Her biri 200 mikrolitre rekabet bağlayıcı tampon içerir.

Her tüp ayrıca 10 mikrolitre nükleotid yüklü raf, bir boncuk ve beş mikrolitre raf içermelidir. Her tüpe sabit bir bağlanma proteini olarak bir bağlayıcı protein A, değişken bağlayıcı protein olarak 0, 1, 2, 0.55, 10 veya 20 mikrolitre raf bir bağlayıcı protein B ekleyin. Bu hacimler, sabit ve değişken bağlayıcı proteinlerin yaklaşık olarak eşit stok konsantrasyonlarını varsayar ve ayarlanması gerekebilir.

Rekabet bağlayıcı tamponun eklenmesiyle bağlayıcı karışımın toplam hacmini 235 mikrolitreye çıkarın. Ardından, 200 mikrolitre rekabet tamponu içeren bir mikro füge tüpü kurun. 10 mikrolitre deneysel nükleotid yüklü raf, bir boncuk ve 10 mikrolitre raf bir bağlayıcı protein A. Ardından G-D-P-G-T-P gama S'yi ayarlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi nükleotid kontrol tüpleri yok.

Tüpleri iki saat inkübe edin, inkübasyonu takiben dört santigrat derecede ters çevirerek karıştırın. Boncukları yarışma bağlayıcı tampon ile üç kez yıkayın. Son olarak, bağlı proteinleri 20 mikrolitre indirgeyici numune tamponunda elüte edin.

Saflaştırılmış GFP RCC iki ve GFP Corona'nın bir C.Propeller alanındaki GFP etiketinin kantitatif western lekelenmesi, üst banttaki proteinin, GFP RCC iki'nin alt banttan 1.4 kat daha bol olduğunu ve rekabet deneyi için bire bir molar oran elde etmek için seyreltilmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Bir kontrol deneyi, birinci rafın nükleotid yükleme durumunun, bir C pervane alanında sabit bir eşmolar GFP Korona hacmine karşı artan GFP RCC iki hacimlerini titre ederek bağlanma özgüllüğünü ve lekelenmeyi belirlediğini göstermektedir. Birinci rafa bağlanan proteinler, bağlı proteinde nispi bir değişikliğin görselleştirilmesine izin verir, her iki rakip için GFP bant yoğunluklarını aynı grafikte çizer ve çizgilerin kesiştiği noktayı belirler, dengedeki değişken bağlayıcı proteinin hacminin tanımlanmasına izin verir.

Bununla birlikte, rakipler arasındaki etkileşim veya aşırı yem gtpa gibi sorunların deneyi tehlikeye atmamasını sağlamak için özen gösterilmelidir. Burada gösterildiği gibi bir rakipte diğerini kaybetmeden artış, bu prosedürü denerken bir sorun olduğunu gösterir. Rekabet eden bağlayıcı ortakların bolluğu arasında karşılıklı bir ilişki olup olmadığını kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Sonuçları bozabilecek ve/veya verileri inceleyerek tanımlandıkları sürece çözülebilecek bir dizi sorun vardır.