Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Bu prosedürün genel amacı, dikkatle kontrol edilen nükleotid yükleme koşulları altında, Row ailesi GTPazlar için protein bağlanma partnerlerinin bağıl afinitelerini karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle her biri aynı etiketle (örneğin, yeşil floresan protein veya GFP) işaretlenmiş olan olası kompetitif bağlanma partnerlerinin saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise ilgili GTPazın saflaştırılmasıdır.

Örneğin, RAC'ı aktif hale getirin ve istenen GTPaz sinyal durumunu elde etmek için uygun nükleotid ile yükleyin. Ardından, nükleotid yüklü GTPaz, bir bağlanma yarışmacısının sabit miktarı ve diğer bağlanma yarışmacısının artan miktarları ile inkübe edilerek bir titrasyon bağlanma eğrisi elde edilir. Son adım, immobilize edilmiş GTPaz'a bağlı proteinlerin western blot ile ayrıştırılması ve membranın, iki bağlanma partneri arasında ortak olan GFP etiketi için sorgulanmasıdır.

Nihayetinde, Western blot yöntemi, GTPaz tarafından yakalanan her bir GFP etiketli bağlanma ortağının benzer miktarlarındaki göreceli konsantrasyonların belirlenmesi için kullanılır. Bu tekniğin ko-presipitasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, GTPaz'ın protein bağlanma özelliklerinin hücredeki bağlı nükleotid tarafından belirlenmesidir. Bağlı nükleotid labil olduğundan, protein bağlanma verilerinin yorumlanması zordur.

Bu prosedüre, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere GST etiketli G tpa saflaştırılması ve gtpa bağlayan proteinlerin ekspresyonu ile başlayın. Transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu flaskları fosfat tamponlu salin veya PBS ile durulayın ve flaskı beş dakika boyunca süzülmeye bırakın. Serbest sıvıyı aspire edin, ardından hücreleri 500 µL lizis tamponu içinde bir mikro santrifüj tüpüne sıyırarak toplayın; hücreleri liz etmek için 4 °C'de 30 dakika boyunca tersyüz ederek karıştırın.

Lizis yıkama sırasında, iki adet 40 µL'lik GFP tuzak boncuğu grubunu taze lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkamalar arasında boncukları 2,700 ×g'de iki dakika boyunca çöktürün. Lizis işleminin ardından, lizatları 21,000 ×g'de 10 dakika santrifüj ederek berraklaştırın.

Her bir rakip proteinin berraklaştırılmış lizatını, ayrı ayrı yıkanmış GFP tuzak boncuklarına aktarın. GFP füzyon proteinlerinin bağlanması için, dört santigrat derecede ters çevirerek karıştırarak iki saat bekleyin. Yüklenen GFP tuzak boncuklarını iki kez lizis tamponuyla ve iki kez yarışma tamponuyla yıkayın.

Yıkama işlemleri arasında boncukları 2.700 ×g'de iki dakika boyunca bağlama tamponu ile çöktürün. 40 µL 0,2 M glisin ekleyip 30 saniye boyunca pipetle çekip bırakarak GFP füzyon proteinlerini elüye edin; ardından boncukları hemen 21.000 ×g'de 60 saniye boyunca çöktürün ve sıvıyı 4 µL 1 M tris HCl içeren yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Saflaştırılmış proteinin zarar görmesini sınırlamak için bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Saflaştırılmış her proteinden 1 µL'yi western blot ile analiz edin ve üreticinin protokolüne uygun bir kantitatif blotting sistemi kullanarak göreceli verimi belirlemek için anti-GFP antikoru ile problayın.

Kompetisyon bağlanma tamponu ekleyerek molar protein konsantrasyonunu eşitleyin. Hazırlanmış GST rack one boncuklarından 90 µL alın ve her adımda boncukları çöktürmek için bir manyetik partikül ayırıcı kullanarak nükleotid yükleme tamponu ile üç kez yıkayın. Tamponu boncuklardan aspire edin ve GDP, GTP veya nükleotid yüklemesi gerekip gerekmediğine bağlı olarak 100 µL nükleotid yükleme tamponu ekleyin.

Yarışma deneyi için, nükleotid yükleme kontrolleri amacıyla 60 µL GST rack one boncuklarına 12 µL 100 mM GDP, 12 µL 10 mM GTP gamma S ekleyin veya nükleotid eklemeyin. Kalan boncukları üç adet 10 µL'lik gruba ayırın ve her bir tüpe 2 µL 100 mM GDP, 2 µL 10 mM GTP gamma S ekleyin veya nükleotid eklemeyin. Boncuk karışımlarını 30 °C'de, ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.

Kompetisyon bağlanmasını gerçekleştirmek için, deneysel karışıma ve kontrol karışımlarına bir molar magnezyum klorür ekleyerek nükleotit bağlı rafı stabilize edin. Her biri 200 mikrolitre kompetisyon bağlanma tamponu içeren altı mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.

Her tüp ayrıca 10 µL nükleotid yüklü raf, bir boncuk ve 5 µL raf içermelidir. Her tüpe sabit bağlayıcı protein olarak 0, 1, 2, 0,55, 10 veya 20 µL Protein A bağlayıcı raf ve değişken bağlayıcı protein olarak Protein B bağlayıcı raf ekleyin. Bu hacimler, sabit ve değişken bağlayıcı proteinlerin stok konsantrasyonlarının yaklaşık olarak eşit olduğunu varsayar ve ayarlanması gerekebilir.

Kompetisyon bağlanma tamponu ekleyerek bağlanma karışımının toplam hacmini 235 microliters'e tamamlayın. Ardından, 200 microliters kompetisyon tamponu içeren bir mikro santrifüj tüpü hazırlayın. 10 microliters deneysel nükleotid yüklü rack, one beads ve 10 microliters rack one bağlanma protein A ekleyin. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı şekilde G-D-P-G-T-P gamma S ve nükleotidsiz kontrol tüplerini hazırlayın.

Tüpleri iki saat boyunca inkübe edin ve inkübasyonun ardından dört derece Celsius'ta ters çevirerek karıştırın. Boncukları kompetisyon bağlama tamponu ile üç kez yıkayın. Son olarak, bağlanan proteinleri 20 microliters redükleyici örnek tamponu ile elüe edin.

Saflaştırılmış GFP RCC two ve GFP Corona in one C.Propeller domain'in GFP etiketinin kantitatif western blotting analizi, üst banttaki protein olan GFP RCC two'nun alt banttakinden 1,4 kat daha fazla olduğunu ve yarışma deneyi için bir bire bir molar oran elde etmek amacıyla seyreltilmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Bir kontrol deneyi, sabit bir hacimdeki ekimolar GFP Corona in one C propeller domain'e karşı artan hacimlerde GFP RCC two titrasyonu ve blotting işlemiyle, rack one'ın nükleotid yükleme durumunun bağlanma özgüllüğünü belirlediğini kanıtlamaktadır. Rack one'a bağlanan proteinler, bağlı proteindeki göreceli değişimin görselleştirilmesini sağlar; her iki yarışmacı için GFP bant yoğunluklarının aynı grafiğe çizilmesi ve çizgilerin kesiştiği noktanın belirlenmesi, dengedeki değişken bağlayıcı protein hacminin tespit edilmesini sağlar.

Ancak, rakipler arasındaki etkileşim veya aşırı yem gtpa gibi sorunların deneyi tehlikeye atmadığından emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Burada gösterildiği gibi, diğerinde kayıp olmadan bir rakipteki artış, bu prosedür uygulanmaya çalışılırken bir sorun olduğunu gösterir. Yarışan bağlanma ortaklarının bolluğu arasında karşılıklı bir ilişki olduğunun kontrol edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Veriler incelendiğinde tespit edilebildiği sürece, sonuçları bozabilecek veya çözülebilecek bir dizi sorun bulunmaktadır.