Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

Küçük Rho GTPase çeşitli hücresel işlevi olan bir süper ailenin proteinidir. Örneğin, bu proteinler hücre kaderinin düzenlenmesinde, strese hücresel tepki, hücresel hareketlilik ve hücre döngüsünde rol oynarlar. Küçük bir Rho GTPase proteininin aktivitesi post-translational modifikasyon ile düzenlenir.

Bu değişiklikler faaliyetlerinin sıkı düzenlenmesinde rol oynar. Örnek olarak, protein prenilasyon ve GTP bağı bu proteinlerin en önemli çeviri sonrası modifikasyonuvardır. Laboratuvarım yakın zamanda bu süper familya proteinlerinin çeviri sonrası modifikasyonlarını araştırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Bu amaçla 251 glioblastoma hücre hattı kullandık ve simvastatin ile hedefaldık ve bu proteinlerin çeviri sonrası modifikasyonu ölçtük. Yöntem bu protein superfamily alt hücresel fraksiyonasyon ve GTP bağlı protein içerir. Bu amaçla, RhoA'nın lokalizasyonunu ve RhoA'ya bağlı GTP'yi kullanarak bu proteinin çeviri sonrası modifikasyonunu ölçtük.

Hücreleri 37 derecelik inkübatörden çıkarın. Birleştiğimi doğrulamak için mikroskop altındaki hücrelere bakın. Hücreler yüzde 70-80 oranında etkili olmalıdır.

Hücreleri bir kez soğuk PBS ile yıkayın. Beş mililitre EDTA ekleyin ve hücreleri 5 dakika lığına 37 derecelik kuvöze geri yerleştirin. Kuluçka beş dakika sonra, 15 mil tüp içine hücreleri ile EDTA toplamak.

Tüpü bir buz kutusuna yerleştirin ve santrifüje doğru ilerleyin. Santrifüjü dört derecede 1500g'ye ayarlayın ve hücreleri beş dakika döndürün. Spin'i takiben, supernate'i çıkarın ve bir mililitre soğuk PBS ekleyin.

Hücreleri iyi triturate. Hücre karışımını 1,5 mililitrelik yeni etiketli bir tüpe aktarın. Aktarımdan sonra santrifüje doğru ilerleyin.

Santrifüjü dört derecede 1500g'ye ayarlayın ve hücreleri beş dakika döndürün. Pelet boyutunu kontrol edin. Örnekleri buza yerleştirin.

Peletrahatsız olmadan, tamamen supernate atın. Arabellek Bir'i ekleyin. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.

Sonication devam edin. Sonicator'u beş döngü, beş saniye için ayarlayın ve üç kez tekrarlayın. Sonication buz üzerinde devam etmelidir, ancak açıklayıcı amaçlar için, video gösterilmez.

Ultracentrifuge'a doğru ilerleyin. Sitoplazmik ve membran fraksiyonları içine hücre homojenates ayırmak için bir ultracentrifuge kullanın. Santrifüjü 100,000g'ye ayarlayın.

Pelet boyutunu kontrol edin. Süperi birbirinden ayırın. Tamamen supernate toplamak, pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak.

Süpernate sitosolik fraksiyonudur. Supernate'i yeni etiketlenmiş bir tüpe yerleştirin. Arabellek 2'yi pelete ekleyin.

Bu membran fraksiyonu. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. Protein tayini ve Batı leke örnek hazırlama devam edin.

%15 jel kullanarak örnekleri Bir SDS-PAGE'e yükleyin. Moleküler ağırlık belirteci görselleştirerek veya Ponceau lekesi kullanarak protein transferini onaylayın. İmmünoblot analizi için primer antikorlar ekleyin.

Biz Rac1/2/3, Cdc42 ve RhoA kullanın. Kültür plakalarını kuvözden çıkar. Birleştiğimi doğrulamak için mikroskop altındaki hücrelere bakın.

Hücreler %70-80'i enakıcı olmalıdır. Kültür plakasını buza yerleştirin. Ortam aspire ve 7.2 buz gibi PBS pH'd ile hücreleri yıkayın.

PBS'yi aspire edin. PBS'nin tüm kalıntılarını temizlemek için plakaları buzüzerinde bir dakika daha yatırın. Artık PBS bu tetkiki olumsuz etkiler.

Proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren uygun miktarda ki buz soğuk lisis tampon hücreleri lyse. Hasat hücre kazıyıcı ile lysate. Bu teknik için kültür plakası eğim.

Lysate etiketli, buz gibi kriyo tüp içine aktarın ve buz üzerinde tutun. Bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Bir protein tsay için lysate 10 mikrolitre tutun.

Snap sıvı azot içinde kalan hücre lysate dondurmak. Snap dondurulmuş kriyotüpleri eksi 80 dondurucuya aktarın. Bu örnekleri saklayın.

Unutmayın, örnekler 14 günden uzun süre saklanmamalıdır. Diğer kültür tabakalarından hücre lisatları birer birer sekize kadar tekrarlayarak hazırlayın. Hızlı çalışın ve numuneleri asla 10 dakikadan uzun süre buzda bırakmayın.

Asla tüm kültür plakalarını aynı anda işlemeyin. Protein konsantrasyonu ölçün. Numuneler arasındaki protein konsantrasyonu normalleştirmek için lysis tampon hacmini hesaplayın.

Not: mililitre başına bir miligram genellikle en iyi, ancak, mililitre başına 0,3 ila iki miligram tespit edilebilir. Bir mikrotüpe 60 mikrolitre lysis tamponu ve 60 mikrolitre bağlama tamponu ekleyerek boş bir kontrol hazırlayın. Rho kontrol proteini 12 mikrolitre, lysis tampon 48 mikrolitre ve bağlayıcı tampon 60 mikrolitre ekleyerek pozitif kontrol hazırlayın.

Rho yakınlık plakasını çantasından çıkarıp buza yerleştirin. 100 mikrolitre buz gibi distile su ile kuyularda toz eritin. Tabağı buzda tut.

25 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda snap dondurulmuş hücre lysates çözültün. Protein konsantrasyonu normalleştirmek için her örnek için buz soğuk lysis tampon hesaplanan hacmi ekleyin. Normalleştirilmiş buz gibi buz dansı örneklerinin 60 mikrolitresini mikrotüplere aktarın ve 60 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin.

Iyice karıştırın ve buz üzerinde tutun. Tamamen güçlü flicking tarafından mikroplaka su kaldırmak, bir laboratuvar paspas üzerinde beş ila yedi sert musluklar takip. Normalleştirilmiş örneklerin 50 mikrolitresini, boş bir denetimi ve yinelenen kuyulara pozitif bir denetim ekleyin.

Plakayı yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin. Not:çalkalayıcının hızı 300 rpm olarak ayarlanmalıdır. Plakadan numuneleri hareket ettirerek temizleyin ve 200 mikrolitre oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Her yıkamadan sonra çamaşır tamponu, dokunarak ve oda sıcaklığında tezgahta saklayın. Her kuyuya 200 mikrolitre oda sıcaklığında antijen sunan tampon ekleyin ve iki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatın. Kuyulardan çözeltiyi dışarı atın ve 200 mikrolitre oda sıcaklığında yıkama tamponu yla üç kez yıkayın.

Her kuyuya yeni hazırlanmış 50 mikrolitre ila 250 anti-RhoA primer antikor ekleyin. Plakayı 300 rpm'de 45 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin, 25 santigrat dereceye ayarlayın. Kuyulardan çözeltiyi dışarı atın ve oda sıcaklığında 200 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Her kuyuya yeni hazırlanmış 50 mikrolitre ila 250 anti-RhoA ikincil antikor ekleyin. Plakayı 45 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcının üzerine, 300 rpm'de, 25 santigrat dereceye ayarlayın. Eşit hacimlerde Reaktif A ve Reaktif B.Flick çözeltisini her kuyudan karıştırarak HRP algılama reaktifini hazırlayın ve 200 mikrolitre oda sıcaklığında yıkama tamponuyla üç kez yıkayın.

Her kuyuya 50 mikrolitre taze hazırlanmış HRP algılama reaktifi ekleyin. Maksimum sinyal elde etmek için 3-5 dakika içinde Parlaklık sinyalini okuyun. Sonuçları uygun bir yazılım paketini kullanarak analiz edin.

Sonuçlarımız simvastatin membran fraksiyonu RhoA lokalizasyonu azaldı göstermektedir. Ne arttı sitosolik fraksiyonda birikimi. İlginçtir, simvastatin RhoA bağlı GTP arttı.Neden?

Simvastatin'in bu aktiviteyi azaltmasını bekliyoruz. Bu proteinin hem alt hücresel lokalizasyonunu ölçmeleri hem de küçük Rho GTPases aktivitesinin son değerlendirmesini yapmak için bu proteine gtp bağlanmasını ölçmeleri çok önemlidir.