Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, adenovirüs ile enfekte olmuş hücrelerde oluşan replikasyon bölmeleri ile zenginleştirilmiş, bileşimlerinin, ultra yapılarının ve ilgili aktivitelerinin ayrıntılı olarak incelenmesi için nükleer olmayan bir fraksiyon elde etmektir. Bu yöntem, DNA virolojisi alanında, viral genom replikasyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaların ve virüsün konak hücre etkileşimlerinin düzenlenmesi için replikasyon bölmelerine bağlı olan ekspresyonun incelenmesi gibi temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nükleer replikasyon yapan DNA virüslerinin enfekte hücreyi kontrol altına almasına izin veren mekanizmaların incelenmesine uygun hücresiz bir sistem kurmak için hız gradyanına dayalı basit bir prosedür olmasıdır.

Bu testi gerçekleştirmek için, ilk olarak, bir mililitre 85 ve DMM'yi 100 milimetre doku kültürü kaplarında enfekte etmeye başlamak için ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi adenovirüs tip beş veya D beş ve insan sünnet derisi fibroblastlarını veya HFF'yi hazırlayın, hücre başına 30 odak oluşturan birim veya FFU'luk bir MOI'de hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe iki saat inkübe edin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte. Virüs aşısının hücreler üzerinde homojen dağılımını sağlamak için bulaşıkları her 15 dakikada bir dikkatlice sallayın. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve taze dmem ekleyin.

% 10 FBS ile takviye edilmiş, daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri 16, 24 veya 36 saat inkübe edin. Enfeksiyondan sonra enfekte olmuş ve kontrol hücrelerini nazikçe toplayın ve hücre süspansiyonunu buz üzerindeki steril santrifüj tüplerinde toplayın. Hücreleri bir nötraur odası kullanarak sayın ve ardından hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 220 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, hücre peletini beş mililitre buz gibi soğuk PBS santrifüjünde yeniden süspanse edin ve hücreleri bitlemek için yıkama süpernatanlarını atarak hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de üç kez yıkayın. Resus, hücre peletini proteaz inhibitörleri ile 700 mikrolitre buz gibi soğuk hipotonik tamponda askıya alır ve hücrelerin üç saat boyunca buz üzerinde şişmesine izin verir. A tipi bir Teflon havaneli kullanarak, hücreleri 10 ila 20 aşağı vuruşla homojenize edin.

Hücre lizizini izlemek için lizatı her 20 vuruşta bir mikroskop altında periyodik olarak kontrol edin. Tüm hücreler başarıyla yırtılana kadar işlemi yaklaşık 80 vuruş boyunca tekrarlayın. Daha sonra homojenatı 300 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı eksi 20 santigrat derecede bir tüpte sitoplazmik fraksiyon olarak saklayın ve çekirdek reus'tan hücresel kalıntıları çıkarın. Peleti 750 mikrolitre 0.25 molar sükroz çözeltisi, bir pipet, 750 mikrolitre 0.35 molar sükroz çözeltisi iki, bir santrifüj tüpünde askıya alın ve yeniden süspanse edilmiş homojenatı ikinci çözeltinin üzerine dikkatlice katmanlayın. Sükroz yastığını beş dakika boyunca dört santigrat derecede 1400 kez G'de döndürün ve ardından süpernatanı atın.

Peletleri 750 mikrolitre çözelti ikide bitlere yeniden süspanse edin. Çekirdekler, nükleer süspansiyonu ultrasonik bir banyoda sonikleştirir, iki beş dakikalık darbelerde dört santigrat derece veya altında tutulur. Darbeler arasında parlak bir alan mikroskobu altında nükleer lizisi kontrol edin ve çekirdekler tamamen yalan söyleyene kadar daha fazla sonikasyon yapın.

Daha sonra, 750 mikrolitre 0.88 molar sükroz pipeti Bir santrifüj tüpünde üçüncü çözelti, nükleer lizat çözeltisini üçüncü çözeltinin üzerine katmanlayın. Lizatı 3000 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Adı geçen 1.5 mililitre S, eksi 70 santigrat derecede depolanan nükleo plazmik fraksiyondur.

Daha sonra peleti 700 mikrolitre ikinci çözelti içinde yeniden süspanse edin. Bu, aynı zamanda eksi 70 santigrat derecede depolanan konakçı çekirdeğin 85 replikasyon bölmesi fraksiyonu veya RCF'sidir. İmmünofloresan analizine başlamak için, tuzlu su kaplı bir cam slayta beş mikrolitrelik bir RCF damlası ekleyin.

Damla havasını oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Ardından, noktanın yanındaki bir damlaya 500 mikrolitre PBS ekleyin ve PBS'yi noktanın üzerine akıtmak için slaytı eğin. PBS'yi slayttan boşaltın.

Daha sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca% 5 sığır serum albümini içeren 500 mikrolitre PBS ile numune noktasını bloke edin. Fazla blokaj solüsyonunu çıkarmak için, doğrudan numunenin üzerine pipetleme yapmadan, slayt üzerinde lekelenen numuneye 500 mikrolitre PBS'yi nazikçe ekleyin. Yıkamayı üç kez gerçekleştirin.

Daha sonra, numune noktasına viral E iki A DNA bağlayıcı proteine karşı 20 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için slaytı örtün ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada iki saat inkübe edin. Şimdi, numuneyi %0,02 ara 20 içeren PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Bu yıkamalardan sonra doğrudan numune üzerine pipetleme yapmaktan kaçının. Doğrudan numunenin üzerine 20 mikrolitre floro dört bağlı fare ikincil antikoru ekleyin, bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Nemlendirilmiş bir odada, slaytlara %0,02 Tween 20 ile 500 mikrolitre PBS ekleyin, böylece doğrudan numune üzerine pipetleme yapmaktan kaçının.

Ardından iki mikrolitre montaj solüsyonu ekleyin ve numunenin üzerine bir kapak kızağını ters çevirin. Kapak fişlerinin kenarlarını oje ile kapatın. Slaytı, kullanılan floro dördü için istenen dalga boyunda 63 x objektifli bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin, adenoviral E iki A DNA bağlayıcı proteinin veya DBP'nin immünofloresansından bir sonuç burada gösterilmektedir.

DBP içeren yapılar alt nükleer viral rc'dir, E iki A DBP'nin RC içinde lokalize olduğunu ve yeşil renkte göründüğünü unutmayın. Ek olarak, RCF'deki viral DNA'nın zenginleşmesi, enfeksiyondan 24 ve 36 saat sonra RCF ve nükleo plazmik fraksiyon veya NPL'yi karşılaştıran PCR ile doğrulandı. Viral GNA, NPL konsültasyonunda değil, RCF'de seçici olarak bulundu.

RCF'de adenoviral MNA'nın ek kanıtı için eşlik eden metin: Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, enfekte olmuş hücrelerin hasat edildiği andan uygun şekilde gerçekleştirilirse RCF'nin izolasyonuna kadar altı ayda yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numuneleri her zaman buz üzerinde tutmayı ve homojenizasyon çekirdeğini, izolasyonu, sonikasyonu ve alt nükleer fraksiyon izolasyon adımlarını parlak alan mikroskobu ile izlemeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben.

R-T-P-C-R ve transmisyon elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler, viral replikasyon bölmeleri ve bu parçacıkların ultra yapısı ile ilişkili viral gen ekspresyonunun düzenlenmesini incelemek için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, DNA tümör virolojisi alanındaki araştırmacıların, hücre döngüsü düzenlemesini değiştiren ve insan hücrelerinde viral replikasyonu teşvik eden moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açma potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, virüsün neden olduğu bu yapıların morfolojik, fonksiyonel ve bileşimsel çalışmalarını gerçekleştirmek için viral replikasyon bölmelerinin enfekte hücre çekirdeklerinden nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

SAN göstergesi ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kulak ağzı takmak gibi darbelerin alınması gerektiğini unutmayın.