Name: Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin, adenovirüsle enfekte insan hücrelerinden viral çoğaltma bölmelerini izole etme yöntemini. Bu teknik, viral genom replikasyonu ve konakçı etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını incelemek için basit bir hücre dışı sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma CONACyT-SEP tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir (SEEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) ve R.A.G. için Promep-SEP; P.H., CONACyT'den (447442) burs aldı.

1. HFF Hücre Kültürü ve Ad-enfeksiyon <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi, 8 HFF hücreleri üzerinde floresan oluşturucu birim (FFU) halinde HEK-293 hücrelerinden ve titre mono tabakaları Ad5 WT virüsü yayar. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde DMEM /% 10 fetal sığır 37 ° C&#39;de steril kültür 100 mm&#39;lik tabaklar içerisinde serum (FBS) ve% 5 CO2, 10 ml insan alın derisi fibroblastları (HFF) büyütün. Dört 16 kare setleri hücreleri sayılarak bir Neubauer odasına kullanarak hücre sayısını belirler. Ml başına hücre sayısı dört 16-kare setleri hücrelerin ortalama sayısını hesaplamak ve 10 4 ile bu sayı çarpımı ile elde edilir. Adımda 1.3 dahil her zaman sonrası enfeksiyon için, 1 x 10 7 HFF hücreleri kullanın. </li><li> Mock-enfekte oluşturucu birim 30 odak MOl&#39;de tabak başına DMEM Ad5 1 ml ile 100 mm doku kültürü çanakları içinde adenovirüs tip 5 (Ad5) vahşi-tipi (WT) (H5pg4100 8) ile HFF hücreleri enfekte veya FFU veya hücre başına. Ah 2 saat süreyle inkübe edindikkatle yemeklere her 15 dakikada bir sallanan umidified 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatörü% 5 CO2, hücreleri üzerinde virüs aşı maddesi homojen bir dağılım sağlamak için. Bu süre sonunda, ortam çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş taze DMEM ve CO2 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 16, 24 ya da 36 saat süreyle inkübe edilir ve% 5. 2.1 adıma geçin. </li></ol> Adenovirüs RC ile zenginleştirilmiştir Alt nükleer Kesirler 2. Hazırlık <ol><li> Hasat Ad5-enfekte veya hücre kavgacı ile sahte enfekte HFF hücreleri ve steril santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. Adım 1.2 olarak hücre sayısını belirler. Adım 1.3 &#39;de belirtilen her zaman sonrası enfeksiyon için 1 x 10 7 hücre kullanın. </li><li> 220 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj hücreleri. </li><li> Buz soğukluğunda PBS hücre pelletini (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4 ve 1,8 mM KH 2 PO 4). Yıkama Hücre peletis, yıkama başına buz soğukluğunda 5 ml PBS ile 3 kez. Bu amaçla, santrifüj 220 x g&#39;de 5 dakika, tortusundan 4 ° C&#39;de hücreleri ve yüzer (SN) atmak ve nazik pipetleme hücre pelletini. </li><li> Plazma membranını bozmak için, 700 hücre topağı buz soğukluğunda hipotonik tampon maddesi (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.5 mM DTT, 20 μ ug / ml fenilmetilsülfonil florid (PMSF) u tekrar süspansiyon , 10 μ / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L dahil olmak üzere sistein, serin, treonin ve aspartil proteaz inhibitörlerinin bir karışımı, -argininal) ve hücreler 3 saat boyunca buz üzerinde şişmesi sağlar. </li><li> Lyse bir gevşek A tipi teflon havan ile homojenleştirici kullanılarak hücreler. Vuruşları ve parlak alan mikroskobu ile her 20 vuruş tüm hücreleri parçalanmış edilmiş olmasını sağlamak için monitör örneklerinin Dounce 80 gerçekleştirin, ancak çekirdekler n varhasarlı veya kopmuş ot. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de, hücre homojenatı santrifüjleyin. Bir santrifüj tüpüne -20 ºC &#39;de sitoplazmik fraksiyon olarak SN saklayın. </li><li> Çözelti 1 (S1) 750 μ l (tekrar süspansiyon, çekirdeklerden pelet, selüler artığın ayrılması için 0.25 M sukroz, 10 mM MgC 10 de dahil olmak üzere 2 ila 20 μ / ml PMSF, sistein, serin, bir treonin ve kanşım aspartil proteaz inhibitörleri μ ug / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L-argininal) ve çözelti, 2 eşit bir hacmi boyunca tabaka (S2) (0.35 M sukroz, 0.5 mM MgCI2, 20 μ / ml PMSF, sistein, serin, 10 μ / ml sığır pankreatik tripsin inhibitörü, 10 μ ug / ml pepstatin A ve 10 μ içeren treonin ve aspartil proteaz inhibitörlerinin bir karışımı, ug / ml N-asetil-L-leusil-L-leusil-L-argininal). Centr1400 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de ifuge. </li><li> Bir mikropipet kullanarak SN atın. Pelet rahatsız etmemek. </li><li> S2 750 μ l izole çekirdek içeren pelletini. </li><li> Adenovirüs RC (RCF) ile zenginleştirilmiş çekirdek içi fraksiyonları izole edilmesi için, iki adet 5 dakikalık darbeleri kullanılarak, ultrasonik bir banyoda çekirdekler yeniden süspansiyon haline ses dalgalarına maruz veya parlak alan mikroskopisi ile gözlendiği haliyle, tüm çekirdek lize kadar devam eder. C ya da 4 ° altında örnekleri tutmak için gerektiğinde ultrasonik banyoda buz kullanın. </li><li> Çözelti 3 (S3) 3000 xg&#39;de (0.88 M sukroz, 0.5 mM MgCl2) ve santrifüj, 10 dakika boyunca 4 ° C eşit hacimde üzerinde sonike çekirdekleri katman. -70 ºC nucleoplasmic fraksiyonu (Npl) olarak 1.5 ml süpernatant saklayın. -70 ºC RCF olarak S2 700 μ l pelet ve mağaza tekrar. </li></ol> RCF 3. Western Blot Analizleri Not: TGA ve RCF fraksiyonlar s Western Blot analizi içinet kenara 640 Npl için l ve adım 2.11 elde edilen toplam hacim gelen RCF 300 μ l u. <ol><li> 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 15 μ Laemmli tamponu 2x, her çekirdek içi fraksiyonun l (% 4 SDS,% 20 gliserol,% 10 2-merkaptoetanol,% 0.004 bromofenol mavisi, 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8) ve kaynatın karıştırın. Bir% 10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 20 miliamperlik (mA), 1.5 saat için jel ve ayrı proteinleri denatüre örnekleri yükleyin. </li><li> Poliviniliden diflorür (PVDF) membran üzerinde 400 mA&#39;da 1.5 saat elektro proteinleri aktarın. </li><li> RT PBS içinde% 3 yağsız kuru süt ile 2 saat boyunca zarın bloke eder. </li><li> PBS /% 0.3 yağsız kuru süt 500 seyreltme: 1 viral E2A DNA-bağlama proteini (B6-8 9) karşı birincil antikor ile 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> 3 kez PBS ile yıkayın membran /% 0.1 Tween 10 dakika boyunca 20. </li><li> Fare anti IgG sekonder AN membran inkübeoda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde 10.000 seyreltme: tibody Bir 1 at turpu peroksidaz (HRP) bağlanmış. </li><li> PBS ile membrana 3 kez yıkayın /% 0.1 Tween 20 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Gelişmiş kemilüminesans ve X-ışını filmleri kullanılarak membran geliştirin. </li></ol> RCF 4. Viral DNA tespiti NOT: Her iki TGA ve RCF fraksiyonlardan, DNA izolasyonu için aşama 2,11 &#39;de elde edilen toplam hacminin RCF için Npl 210 μ l ve 100 μ l kullanın. <ol><li> Proteinaz K, 1 mg / ml ve% 0.5 Tween 20 ile 55 ° C &#39;de 1 saat süre ile çekirdek altı fraksiyonlar inkübe edin. </li><li> 95 ° C &#39;de 10 dakika boyunca inkübe edilerek örnekleri proteinaz K inaktive. </li><li> 2 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. </li><li> SN toplayın. 4 ° C &#39;de 3M sodyum asetatın 1/10 hacmi ve bir izopropanol hacminin, O / N-DNA çökeleği. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. </li><li> SN u atınmikropipet şarkı. 20.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. </li><li> 10 mM, 10 μ l DNA yeniden süspanse Tris-HCI pH 7.4 </li><li> 260 nm&#39;de optik yoğunluğu (OD) ölçmek suretiyle bir spektrofotometre kullanılarak DNA ölçmek. </li><li> Viral DNA&#39;yı büyütmek için, nükleotid 7273 ile ilgili, Geç Temel transkripsiyon birimi içindeki bir bölgenin yükseltilmesine olanak sağlayacak primerler ile reaksiyon hacmi 25 μ l, Taq DNA polimeraz kullanılarak, standart bir PCR reaksiyonunda, her çekirdek içi fraksiyondan DNA 100 ng kullanmak için Nükleotid 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). 95 ° C &#39;de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon, 20 amplifikasyon (95 ° C, 72 ° C&#39; de 30 saniye boyunca 62 ° C &#39;de 1 dakika boyunca tavlama ve uzatma 1 dakika) devirlik bir son uzatma adımı ile takip aşağıdaki döngü koşulları kullanarak 72 ºC&#39;de 3 dak. </li><li> Etidyum 90 V. Stain de,% 2 agaroz jelleri içinde PCR ürünü başlat0.5 μ ug / ml son konsantrasyonda bromür ve RCF viral DNA zenginleştirme doğrulamak için DNA görselleştirmek. Bu bileşik güçlü bir mutajen olduğu gibi, eldiven giymek emin olun her zaman çok dikkatli etidyum bromür Kulp ve. Kurumsal kurallarına göre etidyum bromür atınız. </li></ol> RCF 5. Geç Viral mRNA Algılama NOT: Her iki Npl ve RCF fraksiyonlardan RNA izolasyonu için, adım 2.11 &#39;de elde edilen toplam hacim gelen RCF için Npl için 640 μ l ve 300 μ l kullanın. <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Trizol kullanarak subnuclear fraksiyonlardan RNA izole. DEPC (diethilpyrocarbonate) enjekte edilmiş su 50 μ l RNA süspanse edin. </li><li> 260 nm&#39;de OD ölçümü için bir spektrofotometre kullanılarak RNA niceliğini (yaklaşık 3 μ g elde edilir). 50 ng RNA Mağaza / -70 ºC sıcaklıkta l alikotları u. </li><li> Saflaştırılmış RNA kontrol5 ng toplam RNA ve aşama 4,9 tarif edilen döngü koşulları kullanılarak, ters transkriptaz (RT) yokluğunda bir kontrol PCR reaksiyonunun gerçekleştirilmesi ile DNA kontaminasyonu yokluğu. <ol><li> DNA kontaminasyonu yok ise herhangi bir amplikon üretilmelidir. DNA kontaminasyonu mevcut ise, 10 U RNaz inhibitör 10 U DNase I, 0.1 M Tris-HCI pH 8.3, 0.5 M KCl ve 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca 15 mM MgCl2 ile örnekleri inkübe edin. Adım 5.1 olarak RNA yeniden izole etmek için devam edin. </li></ol></li><li> RCF ilişkili viral mRNA analiz etmek için, farklı gen ailesine (Tablo 1), adenoviral Geç mRNA tespit etmek için tasarlanmış primerler kullanılarak, RT-PCR ile, her çekirdek içi fraksiyondan RNA 100 ng yükseltmek. <ol><li> Ters transkripsiyon (RT) için, 42 ° C &#39;de 1 saat boyunca karıştırılır ve 70 ° C&#39; de 10 dakika boyunca, reaksiyon hacmi 20 μ l M-MuLV RT enzim kullanılarak, standart RT reaksiyonunda, her çekirdek içi fraksiyondan, RNA 100 ng kullanımı. </li><li> Yükseltilmesi için, 1 kullanınAşama 4.9 PCR reaksiyonları, cDNA μ l. Amplifikasyon 25 döngü izledi 95 ° C &#39;de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon (95 ° C&#39;de 1 dakika, tavlama 72 ° C&#39;de 30 saniye için Tablo 1 ve uzatma belirtilen sıcaklıkta 1 dakika süre ile) ve aşağıdaki döngü koşulları kullanarak 72 ° C &#39;de 3 dakika boyunca son bir uzatmadan oluşmuştur. </li></ol></li><li> 0.5 μ ug / ml son konsantrasyonda etidyum bromür ile 90 V Leke jeller% 2 agaroz jelleri RT-PCR ürünleri, çalıştırmak ve RCF viral mRNA geç ilişki doğrulayacak görselleştirmek. Adımda 4.10 belirtildiği gibi etidyum bromür tutun. </li></ol> RCF 6. İmmünofloresan Görselleştirme NOT: Carry-out bu yordamı bir laminer akış kabini altında herhangi bir toz parçacıkları ile numunelerin kontaminasyonu önlemek ve kullanmadan önce tüm çözümleri filtre. <ol><li> Nokta 5 adımda korkunç 2.10 elde edilen RCF kısmının l uctly silan kaplı slayt. </li><li> Oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca nokta kurumasını bekleyin. </li><li> Yeniden hidrat yavaş ve dolaylı RCF nokta yanında bir damla PBS 500 μ l pipetle ve slayt eğerek akış sağlayarak. Taraftan aşırı PBS boşaltın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süre ile PBS /% 5 bovin serum albümini 500 μ l (BSA) ile örnek kaplayarak Blok. </li><li> Nazikçe ve dolaylı olarak numune üzerine PBS 500 μ l pipetle slayt 3 kez yıkayın. Aşırı PBS tahliye etmek slayt eğin. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde 500 seyreltme bir 1: viral E2A DNA-bağlama proteini (B6-8 9) karşı birincil antikor ile numuneyi inkübe edin. Antikor çözeltisi 20 μ l tespit örnek örtün ve kurumasını önlemek için nemli bir oda içinde inkübe edilir. </li><li> Yumuşak ve dolaylı numune üzerine 500 ul PBS μ l pipetleme PBS /% 0.02 Tween 20 ile numune 3 kez yıkayın. Eski kapalı drenaj slayt yatırıncess yıkama çözeltisi. </li><li> 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile, PBS içinde 2000 seyreltme: 1 ile 488 nm&#39;de uyarıldı bir flüorofora bağlı fare anti IgG sekonder antikor ile inkübe edin. Antikor çözeltisi 20 μ l tespit örnek örtün ve kurumasını önlemek için nemli bir oda içinde inkübe edilir. </li><li> Yumuşak ve dolaylı numune üzerine 500 ul PBS μ l pipetleme PBS /% 0.02 Tween 20 ile numune 3 kez yıkayın. Fazla yıkama solüsyonu boşaltmak için slayt eğin. </li><li> Orta montaj olarak 2 μ PBS /% 10 gliserol kullanılarak bir lamel ile slayt üzerine tespit örnek örtün. Net oje ve mağaza el -20 ºC ile mühür. </li><li> 63x objektif ve 488 nm&#39;lik bir dalga boyunda bir 1,4 Sayısal açıklık (NA) ile, bir floresans mikroskobu kullanılarak örnekleri analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li>
<li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+viral+replication+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li>
<li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li>
<li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, Suppl 9. 150-163 (1963).</li>
<li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li>
<li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li>
<li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li>
<li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li>
<li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li>
<li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2%2F3+during+Adenovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Virology%22%5BJournal%5D)">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14(2014).</li>
<li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li>
<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Viral enfeksiyon ile hücresel aktivitelerin düzenlenmesini yöneten moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, RC ile ilişkili bileşimi ve aktiviteleri anlamak faydalı olacaktır. Bu nedenle, RC'nin ayrıntılı bir analizini yapmak için, sakaroz yastıkları ile hız gradyanlarına dayanan basit bir prosedür kullanarak RC ile zenginleştirilmiş subnükleer fraksiyonları izole etmek için bu virüs kaynaklı yapıların boyutundan ve biyokimyasal bileşiminden yararlanan hücresiz bir sistem kurduk. Kullanılan hücre tipine bağlı olarak sta...

Adenovirüsler, enfekte hücre çekirdeğinde replike olan bir çift sarmallı DNA genomunu içerir. Viral DNA çekirdeği girdiğinde, PML nükleer organları 1 bitişik lokalize. Viral erken gen ifadesinin ardından, nükleer mimarisi dramatik olarak adlandırılan viral mikroçevrelerde oluşumunu uyaran, yeniden düzenlenir viral çoğaltma Bölmeler (RC) 2. Adenovirüs (Ad) RC viral genomun replikasyonu ve viral geç genlerinin sentezlenmesi gerçekleşecek siteleri olduğundan, bu süreçlere katılmak için gerekli tüm viral ve hücresel faktörlerin alımı için bir ortam sağlar. İlginç bir şekilde, örneğin DNA hasar cevap olarak hücresel antiviral yanıt sorumlu olan hücresel proteinlerin, çeşitli doğal immün cevabı ve tümör bastırma yandaşlaştırılmıştır bu viral sitelerinin 2 için vardır. Eş zamanlı olarak düzenlenmesi sırasında etkin viral replikasyon teşvik Dolayısıyla, Reklam RC kabul edilebilir düzenleyici hubBu yapıların virüs konak hücre etkileşimleri anlamak için anahtar olduğunu belirten hücresel antiviral yanıt. Bununla birlikte, RC oluşumunun moleküler mekanizmalar, bunların kompozisyonu ve ilgili faaliyetler tam olarak anlaşılamamıştır. Çekirdeğin içinde replike diğer DNA virüslerinden adenoviral RC, hem de RC sitoplazmik RC 3 aksine, membranlara ilişkili değildir. Ayrıca, bu virüs kaynaklı yapıların protein ve nükleik asitlerin bütünüyle oluşan olması muhtemeldir. RNA virüsleri ile enfekte edilmiş hücrelerde oluşan RC, ayrıntılı morfolojik ve fonksiyonel ve biyokimyasal karakterizasyonu 4 kolaylaştırmıştır sitoplazmik lokalizasyonu ve membrana bağlı durum, yararlanarak, izole edilmiştir (genellikle viral fabrikaları olarak da adlandırılır). Bildiğimiz kadarıyla, nükleer viral RC belki de intranükleer m nükleer mimarisi ve yokluğu karmaşıklığı, izole edilmemişOnların izolasyon kolaylaştıracak embranes. Onların çalışma yerine mikroskobik, FISH ve transmisyon elektron mikroskobu güvendi. Ancak, subnuclear yapıların izole doğasında komplikasyonları rağmen, bu tür nukleoli ve Cajal Organları gibi diğer nükleer etki 5,6 öncesinde izole edilmiştir. Çekirdekçikler ve RC her iki protein ve nükleik asitten oluşan ve 0.5 arasında bir çapa sahip olması nedeniyle - 5 um, RC de izolasyon için uygun olmalıdır varsayıldı. Bu nedenle, daha kesin olarak RC ilişkili moleküler bileşim ve fonksiyonlarını karakterize etmek amacıyla biz RC ile zenginleştirilmiş çekirdek içi kısımlar izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuştur. Bu amaçla, nükleollü 7 ya da diğer nükleer etki 6 izole etmek için kullanılan prosedürlerin benzer hız gradyanları ve sükroz yastıkları kullanılarak çekirdek altı fraksiyonlar hazırlandı ve moleküler bileşimin çalışma ve ilişkili aktiviteleri sağlayan bir hücre içermeyen bir sistem kurulmuşturRC. Bu teknik, bu nedenle virüs konak hücre etkileşimleri anlayışı ilerletmek ve aynı zamanda çekirdeğinde çoğaltmak diğer virüslerden RC ayrıntılı analizini kolaylaştırmak ve adenovirüs- oluşan benzer boyutlardaki çoğaltma bölmelerinin oluşumuna neden gereken güçlü bir araç temsil etmelidir örneğin, herpes, papilloma ya polyomavirusları olarak enfekte olmuş hücreleri.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>37 &'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz, Ultra Saf</td><td>Araştırma Organikleri</td><td>0928S</td><td>2,55 M'lik bir stok solüsyonu hazırlayın ve 4 &gtm'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Ultrasonik Banyo</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>: Kullanmadan 15 dakika önce açın.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG1 İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21121</td> PBS Silan-Prep <td>Slaytlarında 1: 2.000 seyreltmede kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Laminer akış kabininde açık</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirüs ile enfekte normal İnsan hücreleri viral Çoğaltma bölme zenginleştirilmiş alt nükleer kesirler izolasyonu

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

İnsan hücrelerinin adenovirüs (Ad) tarafından enfekte edilmesi sırasında, konak hücre çekirdeği dramatik bir şekilde yeniden düzenlenir ve viral ve hücresel proteinlerin viral genom tarafından işgal edilen bölgelere alınması yoluyla nükleer mikro ortamların oluşumuna yol açar. Replikasyon kompartmanları (RC) olarak adlandırılan bu bölgeler, viral genomun lokalize olduğu ve replikasyon, transkripsiyon ve transkripsiyon sonrası işlemeye katılan viral ve hücresel proteinlerin işe alındığı viral kaynaklı nükleer alanlar olarak kabul edilebilir. Ayrıca, tümör baskılayıcı proteinler, DNA hasar yanıtı (DDR) bileşenleri ve doğuştan gelen immün yanıt faktörleri gibi antiviral yanıtta yer alan hücresel proteinler de RC ile birlikte seçilir. RC, verimli ve üretken bir çoğaltma döngüsünü teşvik etmek için çok önemli bir rol oynuyor gibi görünse de, bileşimlerinin ve ilişkili etkinliklerinin ayrıntılı bir analizi yapılmamıştır. Adenoviral RC'nin ve potansiyel olarak hücre çekirdeğinde çoğalan diğer DNA virüslerinin çalışmasını kolaylaştırmak için, Ad RC'yi izole etmek için hız gradyanlarına dayalı basit bir prosedür benimsedik ve bu virüsün neden olduğu subnükleer yapıların morfolojik, fonksiyonel ve bileşimsel çalışmalarını yürütmek ve bunların konakçı-hücre etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için uygun hücresiz bir sistem kurduk.

Viral replikasyon bölme (RC), protein ve diğer nükleer etki benzer nükleik asitten oluşan çekirdek içi virüslerin neden olduğu yapılar olduğu için, bu biyokimyasal özelliklerine göre hız gradyanları ile izolasyon için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Fraksiyonlara protokol Kritik adımlar örnekleri farklı alt-hücresel fraksiyonların bütünlüğünü sağlamak için parlak bir alan mikroskobu ile izlenmesi gereken adım her birinde Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hücreler şişen Örneğin, hipotonik tampon maddesi içinde...

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Bu prosedürün genel amacı, adenovirüs enfekte hücrelerde oluşan replikasyon kompartmanları bakımından zenginleştirilmiş, nükleer olmayan bir fraksiyon elde ederek bunların kompozisyonunu, ultrastrüktürünü ve ilişkili aktivitelerini ayrıntılı olarak incelemektir. Bu yöntem, viral genom replikasyonu ve ekspresyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaların çalışılması gibi ve dolaylı olarak virüs-konak hücre etkileşimlerinin düzenlenmesi için replikasyon kompartmanlarına bağımlı olan DNA virolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nükleer replike olan DNA virüslerinin enfekte hücrenin kontrolünü ele almasını sağlayan mekanizmaların incelenmesine uygun, hücre dışı bir sistem kurmak için hız gradyanına dayalı basit bir prosedür olmasıdır.Bu deneyi gerçekleştirmek için öncelikle, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde adenovirüs tip 5 veya Ad5 ile insan sünnet derisi fibroblastlarını veya HFF'yi hazırlayın; ardından, 100 mm'lik doku kültürü kaplarında, kap başına 1 ml DMEM kullanarak 10⁷ HFF'yi hücre başına 30 odak oluşturucu birim veya FFU'luk bir MOI ile enfekte edin. Hücreleri, 37 °C ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. Virüs inokülümünün hücreler üzerinde homojen dağılımını sağlamak için kapları her 15 dakikada bir dikkatlice sallayın. İnkübasyonun ardından, besiyerini uzaklaştırın ve taze DMEM ekleyin.%10 FBS ile destekleyin ve ardından hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak 16, 24 veya 36 saat boyunca inkübe edin. Enfeksiyon sonrası enfekte ve kontrol hücrelerini nazikçe hasat edin ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde steril santrifüj tüplerinde toplayın. Hücreleri bir neubauer kamarası kullanarak sayın ve ardından hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 220 ×g'de santrifüjleyin.Ardından, hücre peletini beş mililitre buz soğukluğundaki PBS içinde yeniden süspande edin; hücreleri liz etmek amacıyla, hücreleri beş mililitre buz soğukluğundaki PBS ile üç kez santrifüjleyin ve yıkayın, yıkama süpernatantlarını dökün. Hücre peletini, proteaz inhibitörleri içeren 700 µL buz soğukluğundaki hipotonik tampon içinde yeniden süspande edin ve hücrelerin buz üzerinde üç saat boyunca şişmesini bekleyin. A tipi bir Teflon pestle kullanarak, hücreleri 10 ila 20 aşağı doğru darbeyle homojenize edin.Hücre lizini izlemek için lizatı mikroskop altında her 20 strokta bir periyodik olarak kontrol edin. Tüm hücreler başarıyla parçalanana kadar işlemi yaklaşık 80 strok boyunca tekrarlayın. Ardından, homojenatı 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin.Hücresel kalıntıları çekirdek kalıntılarından uzaklaştırmak için süpernatantı sitoplazmik fraksiyon olarak bir tüpte -20 °C'de saklayın. Peleti 750 µL 0.25 M sükroz çözeltisi bir içerisinde süspanse edin; bir santrifüj tüpüne 750 µL 0.35 M sükroz çözeltisi iki ekleyin ve yeniden süspanse edilen homojenatı dikkatlice çözelti ikinin üzerine katmanlayın. Sükroz yastığını 4 °C'de 1400 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı atın.Pelleti, liz yapmak için 750 µL çözelti iki içerisinde yeniden süspande edin. Çekirdek süspansiyonunu, 4 °C veya altında tutulan bir ultrasonik banyoda, beşer dakikalık iki pulse şeklinde sonikasyona tabi tutun. Pulse'lar arasında çekirdek lizini aydınlık alan mikroskobu altında kontrol edin ve çekirdekler tamamen liz olana kadar sonikasyona devam edin.Ardından, bir santrifüj tüpüne 750 µL 0,88 M sakkaroz Çözelti üç pipetleyin ve nükleer lizat çözeltisini Çözelti üç'ün üzerine tabaka halinde ekleyin. Lizatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin. Üstte kalan 1,5 mL'lik kısım nükleoplazmik fraksiyondur ve -70 °C'de saklanır.Ardından peleti 700 µL çözelti iki içerisinde yeniden süspande edin. Bu, aynı zamanda -70 °C'de saklanan konak çekirdeğin %85 replikasyon kompartıman fraksiyonu veya RCF'dir. İmmünofloresan analize başlamak için, salin kaplı bir cam lama 5 µL RCF damlatın.Damlanın oda sıcaklığında hava ile kurumasına izin verin. Ardından, lekenin yanına bir damla halinde 500 µL PBS ekleyin ve PBS'nin leke üzerinden akması için lamı eğin. PBS'yi lamdan süzün.Ardından, örnek noktasını %5 sığır serum albümini içeren 500 µL PBS ile oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke edin. Fazla bloklama çözeltisini uzaklaştırmak için, örneğin üzerine doğrudan pipetlemeden, lama noktalanmış örneğe 500 µL PBS'yi nazikçe ekleyin. Yıkama işlemini üç kez gerçekleştirin.Ardından, örnek noktasının üzerine viral E two A DNA bağlayıcı proteine karşı seyreltilmiş birincil antikordan 20 microliters ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için lamı kapatın ve oda sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir bölmede iki saat boyunca inkübe edin. Şimdi, örneği %0,02 tween 20 içeren PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.Bu yıkama işlemlerinin ardından numunenin üzerine doğrudan pipetleme yapmaktan kaçının. Numunenin üzerine doğrudan 20 µL fluoro four eşli fare sekonder antikoru ekleyin ve 4 °C'de bir saat inkübe edin. Nemlendirilmiş bir bölmede, yine numunenin üzerine doğrudan pipetleme yapmamaya dikkat ederek, lamlara 0,02% Tween 20 içeren 500 µL PBS ekleyin.Ardından iki µL montaj çözeltisi ekleyin ve örneğin üzerine bir lamelle kapatın. Lamellerin kenarlarını oje ile mühürleyin. Slaytı, kullanılan fluoro four için spesifik olan istenen dalga boyunda, 63 x objektifli bir floresan mikroskobu altında inceleyin; adenoviral E2A DNA bağlanma proteini veya DBP'nin immünofloresan sonucundan elde edilen görüntü burada gösterilmiştir.DBP içeren yapılar nükleer alt viral rc'lerdir; E iki A DBP'nin RC içinde yer aldığına ve yeşil renkte göründüğüne dikkat edin. Ek olarak, viral DNA'nın RCF'deki zenginleşmesi, enfeksiyondan 24 ve 36 saat sonra RCF ile nükleoplazmik fraksiyonun veya NPL'nin PCR ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Viral GNA seçici olarak RCF'de bulunmuş, NPL'de ise bulunmamıştır.RCF'deki adenoviral MNA'nın ek kanıtları için beraberindeki metin; bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde enfekte hücrelerin hasat edilmesinden RCF izolasyonuna kadar geçen süre altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, numunelerin her zaman buz üzerinde tutulması ve homogenizasyon çekirdeği, izolasyon, sonikasyon ve alt nükleer fraksiyon izolasyon adımlarının aydınlık alan mikroskobu ile izlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takip edin.Viral replikasyon kompartmanlarıyla ilişkili viral gen ekspresyonunun düzenlenmesini ve bu partiküllerin ultrastrüktürünü incelemek amacıyla R-T-P-C-R ve transmisyon elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, DNA tümör virolojisi alanındaki araştırmacıların, hücre döngüsü düzenlemesini değiştiren ve insan hücrelerinde viral replikasyonu teşvik eden moleküler mekanizmaları keşfetmelerine öncülük etme potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, virüsle indüklenen bu yapıların morfolojik, fonksiyonel ve kompozisyonel çalışmalarını gerçekleştirmek üzere, viral replikasyon kompartmanlarının enfekte hücre çekirdeklerinden nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.SAN indikatörü ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken kulak koruyucu takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-viral-replication-compartment-enriched-sub-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 1012 viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

İn Vivo Uygulamalar için İodiksanol Yoğunluk Gradyan Santrifüjü ile Adeno İlişkili Virüsün Süspansiyon Kültürü Üretimi ve Saflaştırılması

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Öğrenin, adenovirüsle enfekte insan hücrelerinden viral çoğaltma bölmelerini izole etme yöntemini. Bu teknik, viral genom replikasyonu ve konakçı etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını incelemek için basit bir hücre dışı sistem sunar.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Daha fazla video keşfet