Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, adenovirüs enfekte hücrelerde oluşan replikasyon kompartmanları bakımından zenginleştirilmiş, nükleer olmayan bir fraksiyon elde ederek bunların kompozisyonunu, ultrastrüktürünü ve ilişkili aktivitelerini ayrıntılı olarak incelemektir. Bu yöntem, viral genom replikasyonu ve ekspresyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaların çalışılması gibi ve dolaylı olarak virüs-konak hücre etkileşimlerinin düzenlenmesi için replikasyon kompartmanlarına bağımlı olan DNA virolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nükleer replike olan DNA virüslerinin enfekte hücrenin kontrolünü ele almasını sağlayan mekanizmaların incelenmesine uygun, hücre dışı bir sistem kurmak için hız gradyanına dayalı basit bir prosedür olmasıdır.

Bu deneyi gerçekleştirmek için öncelikle, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde adenovirüs tip 5 veya Ad5 ile insan sünnet derisi fibroblastlarını veya HFF'yi hazırlayın; ardından, 100 mm'lik doku kültürü kaplarında, kap başına 1 ml DMEM kullanarak 10⁷ HFF'yi hücre başına 30 odak oluşturucu birim veya FFU'luk bir MOI ile enfekte edin. Hücreleri, 37 °C ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. Virüs inokülümünün hücreler üzerinde homojen dağılımını sağlamak için kapları her 15 dakikada bir dikkatlice sallayın. İnkübasyonun ardından, besiyerini uzaklaştırın ve taze DMEM ekleyin.

%10 FBS ile destekleyin ve ardından hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak 16, 24 veya 36 saat boyunca inkübe edin. Enfeksiyon sonrası enfekte ve kontrol hücrelerini nazikçe hasat edin ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde steril santrifüj tüplerinde toplayın. Hücreleri bir neubauer kamarası kullanarak sayın ve ardından hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 220 ×g'de santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletini beş mililitre buz soğukluğundaki PBS içinde yeniden süspande edin; hücreleri liz etmek amacıyla, hücreleri beş mililitre buz soğukluğundaki PBS ile üç kez santrifüjleyin ve yıkayın, yıkama süpernatantlarını dökün. Hücre peletini, proteaz inhibitörleri içeren 700 µL buz soğukluğundaki hipotonik tampon içinde yeniden süspande edin ve hücrelerin buz üzerinde üç saat boyunca şişmesini bekleyin. A tipi bir Teflon pestle kullanarak, hücreleri 10 ila 20 aşağı doğru darbeyle homojenize edin.

Hücre lizini izlemek için lizatı mikroskop altında her 20 strokta bir periyodik olarak kontrol edin. Tüm hücreler başarıyla parçalanana kadar işlemi yaklaşık 80 strok boyunca tekrarlayın. Ardından, homojenatı 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin.

Hücresel kalıntıları çekirdek kalıntılarından uzaklaştırmak için süpernatantı sitoplazmik fraksiyon olarak bir tüpte -20 °C'de saklayın. Peleti 750 µL 0.25 M sükroz çözeltisi bir içerisinde süspanse edin; bir santrifüj tüpüne 750 µL 0.35 M sükroz çözeltisi iki ekleyin ve yeniden süspanse edilen homojenatı dikkatlice çözelti ikinin üzerine katmanlayın. Sükroz yastığını 4 °C'de 1400 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı atın.

Pelleti, liz yapmak için 750 µL çözelti iki içerisinde yeniden süspande edin. Çekirdek süspansiyonunu, 4 °C veya altında tutulan bir ultrasonik banyoda, beşer dakikalık iki pulse şeklinde sonikasyona tabi tutun. Pulse'lar arasında çekirdek lizini aydınlık alan mikroskobu altında kontrol edin ve çekirdekler tamamen liz olana kadar sonikasyona devam edin.

Ardından, bir santrifüj tüpüne 750 µL 0,88 M sakkaroz Çözelti üç pipetleyin ve nükleer lizat çözeltisini Çözelti üç'ün üzerine tabaka halinde ekleyin. Lizatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin. Üstte kalan 1,5 mL'lik kısım nükleoplazmik fraksiyondur ve -70 °C'de saklanır.

Ardından peleti 700 µL çözelti iki içerisinde yeniden süspande edin. Bu, aynı zamanda -70 °C'de saklanan konak çekirdeğin %85 replikasyon kompartıman fraksiyonu veya RCF'dir. İmmünofloresan analize başlamak için, salin kaplı bir cam lama 5 µL RCF damlatın.

Damlanın oda sıcaklığında hava ile kurumasına izin verin. Ardından, lekenin yanına bir damla halinde 500 µL PBS ekleyin ve PBS'nin leke üzerinden akması için lamı eğin. PBS'yi lamdan süzün.

Ardından, örnek noktasını %5 sığır serum albümini içeren 500 µL PBS ile oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke edin. Fazla bloklama çözeltisini uzaklaştırmak için, örneğin üzerine doğrudan pipetlemeden, lama noktalanmış örneğe 500 µL PBS'yi nazikçe ekleyin. Yıkama işlemini üç kez gerçekleştirin.

Ardından, örnek noktasının üzerine viral E two A DNA bağlayıcı proteine karşı seyreltilmiş birincil antikordan 20 microliters ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için lamı kapatın ve oda sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir bölmede iki saat boyunca inkübe edin. Şimdi, örneği %0,02 tween 20 içeren PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Bu yıkama işlemlerinin ardından numunenin üzerine doğrudan pipetleme yapmaktan kaçının. Numunenin üzerine doğrudan 20 µL fluoro four eşli fare sekonder antikoru ekleyin ve 4 °C'de bir saat inkübe edin. Nemlendirilmiş bir bölmede, yine numunenin üzerine doğrudan pipetleme yapmamaya dikkat ederek, lamlara 0,02% Tween 20 içeren 500 µL PBS ekleyin.

Ardından iki µL montaj çözeltisi ekleyin ve örneğin üzerine bir lamelle kapatın. Lamellerin kenarlarını oje ile mühürleyin. Slaytı, kullanılan fluoro four için spesifik olan istenen dalga boyunda, 63 x objektifli bir floresan mikroskobu altında inceleyin; adenoviral E2A DNA bağlanma proteini veya DBP'nin immünofloresan sonucundan elde edilen görüntü burada gösterilmiştir.

DBP içeren yapılar nükleer alt viral rc'lerdir; E iki A DBP'nin RC içinde yer aldığına ve yeşil renkte göründüğüne dikkat edin. Ek olarak, viral DNA'nın RCF'deki zenginleşmesi, enfeksiyondan 24 ve 36 saat sonra RCF ile nükleoplazmik fraksiyonun veya NPL'nin PCR ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Viral GNA seçici olarak RCF'de bulunmuş, NPL'de ise bulunmamıştır.

RCF'deki adenoviral MNA'nın ek kanıtları için beraberindeki metin; bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde enfekte hücrelerin hasat edilmesinden RCF izolasyonuna kadar geçen süre altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, numunelerin her zaman buz üzerinde tutulması ve homogenizasyon çekirdeği, izolasyon, sonikasyon ve alt nükleer fraksiyon izolasyon adımlarının aydınlık alan mikroskobu ile izlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takip edin.

Viral replikasyon kompartmanlarıyla ilişkili viral gen ekspresyonunun düzenlenmesini ve bu partiküllerin ultrastrüktürünü incelemek amacıyla R-T-P-C-R ve transmisyon elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, DNA tümör virolojisi alanındaki araştırmacıların, hücre döngüsü düzenlemesini değiştiren ve insan hücrelerinde viral replikasyonu teşvik eden moleküler mekanizmaları keşfetmelerine öncülük etme potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, virüsle indüklenen bu yapıların morfolojik, fonksiyonel ve kompozisyonel çalışmalarını gerçekleştirmek üzere, viral replikasyon kompartmanlarının enfekte hücre çekirdeklerinden nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

SAN indikatörü ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken kulak koruyucu takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.