İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Bu prosedür, gripten herhangi bir kalıntıyı çıkararak başlar. Santrifüjleme ile bir virüs çözeltisi. Viral membran daha sonra deterjanla bozulur ve VR nps'ye salınım bir gliserol gradyanı üzerinde ayrılır.

Gradyandan santrifüjleme fraksiyonları toplanır ve her fraksiyonun bir alikotu çalıştırılır. Bir SDS sayfasında, V NPS içeren V nps fraksiyonlarını içeren tepe fraksiyonlarını belirlemek için kumasi mavisi ile boyanan jeller daha sonra santrifüjleme ile konsantre edilir ve saflaştırılmış VRP'ler, daha sonra transmisyon elektron mikroskobu ile VRP'lerin görselleştirilmesi için negatif olarak boyanan bir bakır TEM numune ızgarasına uygulanır. Merhaba, ben WinCo Wu, British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'nde Dr.Nellie Pane'in laboratuvarındayım.

Ben Lindsay Weaver, daha önce Pane Lab'den. Bugün size viral bir kaburga nükleo protein kompleksleri olan influenza'nın saflaştırılması için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, doku kültürü hücrelerinde A virüsü olan influenza'nın nükleer ithalatını incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Deneye 750 mikrolitre MNT tamponunda başlamak için, 11 milimetreye 34 milimetrelik bir Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra, mililitre influenza çözeltisi başına iki miligramdan 500 mikrolitre ekleyin, virüsü MNT tamponu ile karıştırmak için tüp pipetine birkaç kez yukarı ve aşağı

Karıştırdıktan sonra, tüpü A TLA bir 20.2 rotora yerleştirin ve dört santigrat derecede 109.000 kez G'de 10 dakika boyunca bir Beckman Optima max E santrifüjünde santrifüjleyin. Sıkma işlemi tamamlandığında, süpernatanı çıkarın, ardından yeniden başlatın, peleti 500 mikrolitre bozulma tamponu girdabında askıya alın. Yeniden süspanse edilen pelet kuvvetlice ve ardından bir einor termo karıştırıcıda 20 dakika boyunca 31 santigrat derecede çalkalayın.

Çalkalama bittiğinde, gliserol gradyan tortu hızı santrifüjlemesi ile devam edin. Gliserol gradyanını hazırlamak için, aşağıdaki gliserolü bir Beckman UltraClear 13 milimetre x 51 milimetre santrifüj tüpüne, bir mililitre hacimce %70 hacimce GLYCEROL 0.75 mililitre %50 gliserol 0.375 mililitre, %40 gliserol ve 1.8 mililitre, %33 gliserol içine yerleştirin. Bu gliserol çözeltileri, saf gliserolün NM tamponu ile karıştırılmasıyla yapılır.

Ayrıca hem gliserol hem de tampon içeren bir denge tüpü hazırlayın. Daha sonra bozulmuş viral numuneyi tekrar vorteksleyin ve gliserol gradyanına yükleyin. Tüpü bir Beckman MLS 50 sallanan kova rotoruna yerleştirin ve gradyanı dört santigrat derecede 217.000 kez G'de üç saat 45 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, tüpün tepesinden başlayarak gradyanın 250 mikrolitrelik alikotunu manuel olarak toplayın. Fraksiyonları buz üzerinde veya dört santigrat derecede tutun. Fraksiyonlar toplandıktan sonra, bunları SDS poli akrilamid jel elektroforezi kullanarak analiz etmeye hazırız.

SDS sayfa analizine başlamak için, her fraksiyondan 20 mikrolitreyi yeni bir tüpe çıkarın. Daha sonra beş kez SDS sayfası numune tamponundan beş mikrolitre ekleyin ve numuneyi beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın Isıttıktan sonra, numuneleri kısa bir süre döndürün ve bunları kuyucuklardan birinde moleküler ağırlık belirteçleri içeren %10'luk bir Poli akrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra, brom fenol mavisi yükleme boyası jelin dibine yakın bir yere ulaşana kadar numuneleri jelin içinden geçirin.

Jeli SDS sayfa aparatından çıkarın ve jeli kumasi mavisi ile boyayın. Boyama sonuçlarına dayanarak, esas olarak influenza içeren fraksiyonları tanımlayın. Bir nükleo proteini.

İnfluenza A NP yaklaşık 56 kilodalton büyüklüğündedir ve viral ribonükleoprotein komplekslerinde bulunan ana proteindir. Bu nedenle NP bandı genellikle VRN ps'yi içeren fraksiyonlardaki en güçlü banttır. Bir sonraki bölümde, bu VRNP fraksiyonlarını yoğunlaştıracağız.

Esas olarak NP içeren gliserol fraksiyonlarını birleştirin ve bunları iki Beckman 11 milimetre x 34 milimetre polikarbonat santrifüj tüpüne dağıtın, her tüpü etil piro karbonat veya DEPC ile muamele edilmiş ultra saf su ile doldurun. Ardından karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpleri bir Beckman TLA one 20.2 rotoruna yerleştirin ve dört santigrat derecede 157.000 kez G'de dört buçuk saat santrifüjleyin.

Sıkma tamamlandığında, süpernatanı çıkarın ve peleti yeniden askıya alın. 50 mikrolitre DEPC arıtılmış su alikotunda, arıtılmış V NPS bir alikotu bir kenara koyar ve diğerlerini eksi 80 santigrat derecede saklar. Artık VRP'lerin negatif lekelenmesine devam etmeye hazırız.

Bir mikrolitre saflaştırılmış VRNP'yi dokuz mikrolitre taze yapılmış ve iki kez filtrelenmiş PBS tampon kızdırma deşarjına seyreltin, bir bakır TEM numune ızgarasını 30 saniye boyunca boşaltın. Bu ızgara daha önce bir Parlow Dion ve karbon film ile kaplanmıştı. Yeni kızdırma deşarjı numune ızgarasını tutmak için cımbız kullanarak, numune ızgarasına beş mikrolitrelik bir damla seyreltilmiş VRNP uygulayın.

Beklerken damlanın sekiz dakika boyunca ızgaraya emilmesine izin verin. Bir tepsiye küçük bir parfüm şeridi yerleştirin, ardından her biri 10 mikrolitre PBS tamponu içeren iki damla ve ayrıca %1 amonyum meli hurmadan oluşan 80 mikrolitrelik taze yapılmış boyama solüsyonundan 80 mikrolitrelik bir damla parfuma dağıtın. Şimdi numune ızgarasını, toplam bir dakika boyunca iki damla PBS'ye dikkatlice indirerek yıkayın.

Ardından, numune ızgarasının kurumasına izin vermeden numune çözeltisinin bir kısmını numune ızgarasından fitillemek için bir parça filtre kağıdı kullanın. Numune ızgarasından son tampon damlasını emdikten hemen sonra, numune ızgarasını leke damlacığının içine tamamen batırın. Ve bir dakika bekle.

Bir dakika sonra, leke solüsyonunu numune ızgarasından tamamen çıkarmak için yeni bir filtre kağıdı parçası kullanın. Gözlemden önce numune ızgarasının birkaç dakika kurumasını bekleyin. Bir transmisyon elektron mikroskobu altında, negatif lekeli V nps'nin temsili transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri bulunmaktadır.

Burada görebileceğiniz gibi, V NPS, uzunluğu yaklaşık 30 nanometre ila 120 nanometre olan değişken uzunlukta çubuk şeklindeki parçacıklara benzer. Oligomerik NP, çift sarmal bir tekrar yapısına daha fazla katlanan bir NP molekülleri zinciri olarak düzenlenir. Bu nedenle, bu çubuk şeklindeki parçacıkların her iki ucundaki halkalar bazen görülebilir.

Size az önce influenzayı nasıl saflaştıracağınızı ve görselleştireceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken viral bir kaburga nükleoprotein kompleksleri. Negatif boyama için pisuar asetat kullanıyorsanız, VR mps'yi seyreltirken PBS kullanmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.