Name: İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin, gliserol gradyanı santrifüjasyonu ve negatif boyama ile İnfluenza A viral ribonükleoprotein komplekslerinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi. Bu yöntem viroloji araştırmalarında viral yapıları incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüsü, Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe ile desteklendi.

Bölüm 1: Grip bozulması bir virion <ol><li> Beckman Optima kullanmak için TLA-120,2 rotor içine sığacak şekilde tasarlanmış bir Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne (11 mm x 34 mm) içine MNT tampon 750 ul (20 mM (MES), 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5) Max-E ultrasantrifüjdeki. </li><li> Bu tüpe, influenza A virüsünün (2 mg / ml &#39;H3N2 X-31 A/AICHI/68 suşu) 500 ul ekleyin. MNT tamponu ile birkaç kez aşağı yukarı pipetleme virüs karıştırın. </li><li> TLA-120,2 rotor kullanarak Beckman Optima Max-E santrifüj, 109.000 xg, 4 ° C 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve 500 ul bozulması tampon pelet (100 mM KCl, 5 mM MgCl 2,% 5 (w / v) gliserol, 50 mM octylglucoside, 10 mg / ml lysolecithin, 1.5 mM dithiothreitol, 100 mM MES, tekrar süspansiyon pH 5.5). </li><li> Vorteks şiddetle ve sonra sallanarak 31 ° C&#39;de 20 dakikada bir Eppendorf Thermomixer. </li></ol> Bölüm 2: Gliserol Gradient Tortu Hız Santrifüj <ol><li> Gliserol degrade aşağıdaki miktarda gliserol 1 ml% 70 (v / v) gliserol, 0.75 ml% 50 gliserol, 0.375 ml% 40 gliserol ve 1.8 Beckman ultraclear santrifüj tüpüne (13 mm x 51 mm) içine koyarak hazırlayın ml% 33 gliserol. Gliserol çözümleri saf gliserol NM tampon (150 mM NaCl, 50 mM (MES), pH 5.5) ile karıştırılarak yapılır. Ayrıca, gliserol ve tampon her ikisini de içeren bir denge tüp hazırlayın. </li><li> Vorteksleyin tekrar viral örnek bozulur ve gliserol degrade üzerine yükleyin. </li><li> Beckman MLS-50 sallanan kovalı rotor, 217.000 xg, 4 ° C 3,75 saat degrade santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, tüpün üst başlayarak degrade 250 ul alikotları elle toplamak. ° C buz veya 4 kesirleri tutun </li></ol> Bölüm 3: SDS Poliakrilamid Jel Elektroforez Gliserol Gradient Kesirler Analizi <ol><li> Her bir fraksiyon taze bir tüp 20 ul çıkarın. </li><li> 5x SDS-PAGE örnek tampon 5 ul ekleyin. </li><li> Isı 95 ° C&#39;de 5 dakika. </li><li> Kısaca numuneler Spin ve% 10 poliakrilamid jel üzerine yük ve kuyulardan birinde molekül ağırlığı işaretleri içerir. </li><li> Bromphenol mavi yükleme boya jel altına yakın ulaşıncaya kadar jel örnekleri çalıştırın. </li><li> Coomassie mavi jel Leke. </li></ol> Bölüm 4: vRNP Kesirler Konsantrasyon <ol><li> Esas NP içeren gliserol kesirler seçin, bunları birleştirmek ve iki Beckman polikarbonat santrifüj tüpleri (11 mm x 34 mm) içine dağıtmak. </li><li> Dietil pyrocarbonate (DEPC) ile tedavi edilen Ultra Saf su, ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı karıştırmak için birkaç kez her tüp doldurun. </li><li> Beckman TLA-120,2 rotor 157.000 xg, 4 ° C, 4,5 saat boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve DEPC arıtılmış su 50 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Eğer istenirse, konsantre vRNPs A 280 ölçülebilir. NP toplanmış fraksiyonları önemli bileşeni mevcut olduğu gibi, NP molarite bir tahmini 55.350 sönüm katsayısı M -1 cm -1 (ProtParam 3 ile belirlenir) kullanılarak hesaplanabilir. </li><li> Kısım saflaştırılmış vRNPs ve bunları daha sonra kullanmak üzere ° C -80 dondurulmuş saklamak. </li></ol> Bölüm 5: vRNPs Negatif Boyama <ol><li> 9 ul saflaştırılmış vRNP 1 ul sulandırınız taze ve süzülmüş iki kez MNT tamponu (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5). Diğer tamponlar da vRNPs sulandırmak için örnek ızgara (adım 5.5) yıkamak için OK, ama eğer PBS uranil asetat negatif boyanması için kullanılır kullanmayın. </li><li> Kızdırma deşarj daha önce 30 saniye boyunca bir parlodion ve karbon film ile kaplı bir örnek (bakır TEM) grid. </li><li> Cımbız ile taze parlayan taburcu bir örnek ızgara tutun ve numune ızgara üzerine seyreltilmiş vRNP 5-ul damla uygulayın. </li><li> 8 dakika ızgara üzerinde numunenin damla bırakın. </li><li> Parafilm bir bankta beklerken, küçük bir şerit yerleştirin içeren 10 ul her MNT tampon (ızgara yıkamak için), ve taze yapılmış boyama çözüm 80-ul damla (% 1 amonyum molibdat veya 1 2 damla dağıtmak Parafilm üzerine% uranil asetat). </li><li> Adsorpsiyon 8 dakika sonra, filtre kağıdı bir parça numune ızgara (üçgen şeklinde kesilmiş) örnek çözüm parçası fitil. Örnek ızgara kurumasına izin vermeyin. </li><li> 1 dakika olmak üzere toplam süre 10 ul MNT tampon içeren 2 damla örnek ızgara yıkayın. Bu örnek ızgara düşürücü dikkatle açılan ve daha sonra filtre kağıdı bir parça numune ızgara (örnek ızgara kuru izin vermeden) örnek çözüm parçası esneklik yapılır. </li><li> Hemen örnek ızgara tampon son damlasına esneklik sonra, tamly batığın numune leke damlacık içinde ızgara ve 1 dakika bekleyin. </li><li> Tamamen bir parça filtre kağıdı ile örnek ızgara leke çözüm fitil. </li><li> Transmisyon elektron mikroskop altında gözlem önce birkaç dakika kurumasını örnek ızgara izin verin. </li></ol> Bölüm 6: Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="Şekil 2" width="600" height="215" /> Şekil 1 Influenza A NP (~ 56 kDa) gibi viral ribonükleoprotein kompleksleri bulunan başlıca protein, NP bant genellikle vRNPs (Şekil 1) içeren kesirleri güçlü grubudur. NP ek olarak, her grip vRNP trimerik RNA polimeraz (82, 86 ve 86.5 kDa molekül ağırlıkları) karmaşık bir kopyasını içerir. Bu olabilir veya kendi bolluk NP ile karşılaştırıldığında düşük olması nedeniyle Coomassie mavi boyama görünür olmayabilir. Polimerazları, ancak, bir Commassie mavi leke yerine, eğer, bir gümüş jel yapılır leke tespit edilebilir. İnfluenza matriks protein M1 (~ 28 kDa) NP protein zirve kesirler kesirler minimal olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="Şekil 3" width="600" height="360" /> Şekil 2 Olarak olumsuz bir transmisyon elektron mikroskobu altında görüntülendi lekeli vRNPs uzunluğu 120 nm (Şekil 2a), yaklaşık 30 nm değişken uzunlukta çubuk şeklindeki parçacıkların benzer vRNPs verim gerekir. Oligomerik NP NP moleküllerin bir zincir, bir çift sarmal tekrar yapısı daha içine katlanmış olarak düzenlenen, bu nedenle bu çubuk şeklindeki parçacıkların iki ucunda döngüler bazen görülebilmektedir (Şekil 2b).

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

VRNPs Arındırma Kemler ve ark (1994) tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. 1. Biz ve diğerleri de kendi nükleer ithalat çalışma vRNPs izole etmek için bu protokolü kullanılır. 2,4,5 RNA viral genomun oluşur çünkü RNaz ücretsiz ipuçları ve tüpler vRNPs manipüle kullanmanızı tavsiye ederiz ve bu nedenle RNA varlığı kolayca düşürür. Buna ek olarak, tüm tamponlar RNaz ücretsiz su yapılmalıdır. Burada açıklanan protokol asidik bir ekstraksiyon (örneğin bozul...

<table><tbody><tr><td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Oktilglukozid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>Lizolesitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>dietil pirokarbonat (DEPC) işlemli su</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Asetat</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Molibdat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-E Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 Rotor Paketi, Salınımlı Kova</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Rotor Düzeneneği, Sabit Açılı, Titanyum</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

İnfluenza a viral ribonükleoprotein kompleksleri saflaştırılması ve görselleştirme

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Influenza A viral genomun viral ribonulceoprotein parçacıklar (vRNPs) içine İnfluenza A nükleoprotein (NP) birden fazla kopyası ile ayrı ayrı paketlenmiş sekiz negatif anlamda, tek sarmallı RNA molekülleri oluşur. Influenza vRNPs viral zarf içine. Hücreye girişi sırasında konak nükleer taşıma makine erişmek, ancak, bu vRNP kompleksleri, sitoplazma içine salınır. , Grip vRNPs ve grip genomunun çoğaltma nükleer ithalat incelemek üzere, bu virüsün diğer bileşenler bu süreçlerin karışmaz böylece izole vRNPs çalışmak için yararlıdır. Burada, influenza A virüsünün bu vRNPs arındırmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Prosedür zarflı virion vRNP kompleksleri serbest bırakmak amacıyla grip deterjanlarla virion bozulma ile başlar. VRNPs sonra grip hız sedimantasyon% 33-70 süreksiz gliserol degrade virion diğer bileşenler ayrılır. Gliserol gradiyenti elde kesirler sonra Coomassie mavi ile boyandıktan sonra SDS-PAGE ile analiz edilir. NP içeren pik fraksiyonları daha sonra bir araya toplanmış ve santrifüj yoluyla yoğunlaşmıştır. Konsantrasyon sonra, vRNPs bütünlüğünü negatif boyandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu ile vRNPs görselleştirme tarafından doğrulanmadı. Gliserol degrade arıtma Kemler o bir değişiklik<em&gt; Ve ark.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt; Ve negatif boyama Wu tarafından yapılan olmuştur<em&gt; Ve ark.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

İnfluenza A viral genomu; her biri influenza A'nın çok sayıda kopyasıyla tek tek paketlenmiş, sekiz adet negatif anlamlı, tek sarmallı RNA molekülünden oluşur...

Bu prosedür, santrifüjleme yoluyla influenza virüs solüsyonundaki kalıntıların temizlenmesiyle başlar. Ardından, viral membran deterjan ile parçalanır ve serbest kalan vRNP'ler gliserol gradyanı üzerinde ayrıştırılır.Gradyandan gelen santrifügasyon fraksiyonları toplanır ve her fraksiyondan bir alikot yürütülür. V NP'leri içeren pik fraksiyonları belirlemek için SDS sayfasındaki jeller Coomassie Blue ile boyanır; ardından V NP'leri içeren fraksiyonlar santrifügasyonla konsantre edilir ve saflaştırılmış VRP'ler, iletim elektron mikroskobu ile VRP'lerin görselleştirilmesi için negatif boyama yapılan bir bakır TEM örnek ızgarasına uygulanır. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'nde Dr. Nellie Pane'in laboratuvarından WinCo Wu.Ben Lindsay Weaver, daha önce Pane Laboratuvarı'nda görev yaptım. Bugün size bir viral ribonükleoprotein kompleksleri olan influenza saflaştırma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, doku kültürü hücrelerinde influenza A virüsünün nükleer importunu çalışmak için kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Deneye, bir adet 11 mm x 34 mm Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne 750 µL MNT tamponu ekleyerek başlayın. Ardından, tüpe 2 mg/mL k

purification-visualization-influenza-viral-ribonucleoprotein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Bu ko-immünopresipitasyon protokolü, influenza A virüsü nükleoproteini ile insan hücrelerindeki antiviral Mx1 proteini arasındaki etkileşimi incelemeye izin verir. Protokol, Mx1 ve influenza A virüsü nükleoproteininin başarılı bir şekilde birlikte immünopresipitasyonu için N-etilmaleimidin önemini vurgulamaktadır.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Bir anyon reçine tabanlı yöntemi bioaerosol sıkışma tabanlı örnekleme virüslerin gösterdi sıvı için uyarlanmış değişimi. Aşağı akım moleküler algılama ile birleştiğinde, yöntem bioaerosols virüslerden facile ve hassas algılanması için izin verir.

Anyon Exchange reçine kullanma Bioaerosols--dan virüs tespiti

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Bu makale, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak görüntülenen influenza virüslerinin veri işlemesi ve ardından hemaglutinin glikoproteininin subtomogram ortalaması için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, görüntü ön işlemeden son model iyileştirmeye kadar adım adım veri işlemeyi kapsar.

İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

Öğrenin, gliserol gradyanı santrifüjasyonu ve negatif boyama ile İnfluenza A viral ribonükleoprotein komplekslerinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi. Bu yöntem viroloji araştırmalarında viral yapıları incelemek için kullanılır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Daha fazla video keşfet