İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Bu prosedür, santrifüjleme yoluyla influenza virüs çözeltisindeki kalıntıların temizlenmesiyle başlar. Ardından viral membran deterjanla parçalanır ve açığa çıkan vRNP'ler bir gliserol gradyanı üzerinde ayrıştırılır.

Gradyentten gelen santrifügasyon fraksiyonları toplanır ve her fraksiyondan bir alikvot koşturulur. V NP'leri içeren pik fraksiyonları belirlemek için jeller Coomassie blue ile boyanır; ardından V NP'leri içeren fraksiyonlar santrifügasyon ile konsantre edilir ve saflaştırılmış VRP'ler, transmisyon elektron mikroskobu ile görüntüleme için negatif boyama yapılacak olan bakır TEM örnek ızgarasına uygulanır. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'nde Dr. Nellie Pane'nin laboratuvarından WinCo Wu.

Ben, eski Pane Lab üyesi Lindsay Weaver. Bugün size, viral ribonükleoprotein kompleksleri olan influenza saflaştırma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, doku kültürü hücrelerinde influenza A virüsünün nükleer importunu incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Deneye, 11 mm x 34 mm'lik bir Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne 750 µL MNT tamponu ekleyerek başlayın. Ardından, tüpe 2 mg/mL konsantrasyonunda influenza A virüsünden 500 µL ekleyin; virüsü MNT tamponu ile karıştırmak için pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekin.

Karıştırma işleminden sonra, tüpü bir TLA one 20.2 rotoruna yerleştirin ve Beckman Optima max E santrifüjünde, 4 °C'de, 109.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında süpernatantı uzaklaştırın, ardından peleti 500 µL lizis tamponunda yeniden süspande edin ve vorteksleyin. Yeniden süspande edilen peleti kuvvetlice karıştırın ve ardından bir einor thermo mixer cihazında 31 °C'de 20 dakika boyunca çalkalayın.

Karıştırma işlemi tamamlandığında, gliserol gradyan sediment hızı santrifüjasyonuna geçiniz. Gliserol gradyanını hazırlamak için, bir Beckman UltraClear 13 milimetre x 51 milimetre santrifüj tüpüne sırasıyla şu miktarlarda gliserol ekleyin: 1 mililitre %70 hacim/hacim GLYCEROL, 0,75 mililitre %50 gliserol, 0,375 mililitre %40 gliserol ve 1,8 mililitre %33 gliserol. Bu gliserol solüsyonları, saf gliserolün NM tamponu ile karıştırılmasıyla hazırlanır.

Ayrıca gliserol ve tampon içeren bir dengeleme tüpü hazırlayın. Ardından, parçalanmış viral örneği tekrar vorteksleyin ve gliserol gradyanına yükleyin. Tüpü bir Beckman MLS 50 salınımlı kova rotoruna yerleştirin ve gradyanı dört santigrat derecede, 217.000 ×g hızında üç saat 45 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, tüpün üst kısmından başlayarak gradyentten 250 µL'lik alikotları manuel olarak toplayın. Fraksiyonları buz üzerinde veya 4 °C'de muhafaza edin. Fraksiyonlar toplandıktan sonra, SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz etmeye hazır hale geliriz.

SDS page analizine başlamak için, her fraksiyondan 20 µL alarak yeni bir tüpe aktarın. Ardından beş mikrolitre 5X SDS page örnek tamponu ekleyin ve örneği 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Isıtma işleminden sonra, örnekleri kısa süreliğine santrifüjleyin ve %10 poliakrilamit jeline yükleyin; kuyucuklardan birine moleküler ağırlık markerları ekleyin. Daha sonra, bromofenol mavisi yükleme boyası jelin altına yaklaşana kadar örnekleri jelde yürütün.

Jeli SDS sayfa düzeneğinden çıkarın ve jeli kumasi blue ile boyayın. Boyama sonuçlarına dayanarak, temel olarak influenza nükleoproteinini içeren fraksiyonları belirleyin.

İnfluenza A NP yaklaşık 56 kilodalton boyutundadır ve viral ribonükleoprotein komplekslerinde bulunan ana proteindir. Bu nedenle NP bandı, genellikle vRNP'leri içeren fraksiyonlardaki en güçlü banttır. Bir sonraki bölümde, bu vRNP fraksiyonlarını konsantre edeceğiz.

Ağırlıklı olarak NP içeren gliserol fraksiyonlarını birleştirin ve bunları iki adet Beckman 11 milimetre x 34 milimetre polikarbonat santrifüj tüpüne paylaştırın; her tüpü etil pirokarbonat veya DEPC ile işlem görmüş ultrapure su ile doldurun. Ardından, karıştırmak için pipetle birkaç kez çekip boşaltın. Tüpleri bir Beckman TLA 120.2 rotoruna yerleştirin ve 4 °C'de, 157.000 ×g'de dört buçuk saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin. Saflaştırılmış V NPS'yi 50 µL'lik DEPC işleminden geçirilmiş su alikotlarına bölün; bir alikotu ayırın ve diğerlerini -80 °C'de saklayın. Artık VRP'lerin negatif boyama işlemine geçmeye hazırız.

Bir mikrolitre saflaştırılmış VRNP'yi, taze hazırlanmış ve iki kez filtrelenmiş PBS tamponuna dokuz mikrolitre olacak şekilde seyreltin; bir bakır TEM numune ızgarasını 30 saniye boyunca glow discharge işlemine tabi tutun. Bu ızgara daha önceden Parlow Dion ve karbon film ile kaplanmıştır. Taze glow discharge yapılmış numune ızgarasını tutmak için cımbız kullanarak, seyreltilmiş VRNP'den beş mikrolitrelik bir damlayı numune ızgarasının üzerine uygulayın.

Bekleme süresince damlanın ızgara tarafından emilmesini sekiz dakika boyunca bekleyin. Bir tepsiye küçük bir parfüm şeridi yerleştirin, ardından parfümün üzerine her biri 10 µL PBS tamponu içeren iki damla ve %1 amonyum melidattan oluşan, yeni hazırlanmış boyama çözeltisinden 80 µL'lik bir damla damlatın. Şimdi numune ızgarasını, toplam bir dakika boyunca dikkatlice iki PBS damlasının içine daldırarak yıkayın.

Ardından, numune ızgarasının kurumasına izin vermeden, bir filtre kağıdı parçası kullanarak numune çözeltisinin bir kısmını ızgaradan çekin. Numune ızgarasındaki son tampon damlası çekildikten hemen sonra, numune ızgarasını boya damlacığının içine tamamen daldırın. Ve bir dakika bekleyin.

Bir dakika sonra, boya çözeltisini örnek ızgarasından tamamen emmek için yeni bir filtre kağıdı parçası kullanın. Gözlemden önce örnek ızgarasının birkaç dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Negatif boyalı V nps'lerin transmisyon elektron mikroskobu altındaki temsilci transmisyon elektron mikroskopi görüntüleri burada yer almaktadır.

Burada görebileceğiniz üzere, V NPS yaklaşık 30 nanometre ile 120 nanometre arasında değişen uzunluklarda, çubuk şekilli partiküllere benzemektedir. Oligomerik NP, daha sonra çift helisel tekrarlı bir yapıya katlanan NP moleküllerinden oluşan bir zincir şeklinde düzenlenmiştir. Bu nedenle, bu çubuk şekilli partiküllerin her iki ucundaki halkalar bazen görülebilir.

İnfluenza viral ribonükleoprotein komplekslerini nasıl saflaştıracağınızı ve görselleştireceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, negatif boyama için urasil asetat kullanıyorsanız, vRNP'leri seyreltirken PBS kullanmamanız önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.