Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Bu prosedürün amacı, bisiklet B'nin proteolizinin anafaz başlangıcını ve mitotik çıkışı nasıl yönettiğini izlemektir. Bu, ilk olarak mikroskopi slaytları üzerinde döngüsel B snap raportör hücrelerinin tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kimerik Siklin B ani raportör molekülünü floresan substrat TMR yıldızı ile etiketlemektir.

Daha sonra, görüntü serileri bir mikroskopi istasyonunda elde edilir. Son adım, hücreleri analiz etmek ve zaman içinde TMR yıldız floresan yoğunluğunu hesaplamaktır, bu da döngü B proteolizini yansıtır. Sonuç olarak, canlı raportör hücrelerin immünofloresan mikroskobu, mitoz sırasında meydana gelen döngü B proteolizinin kinetiğini ortaya koymaktadır.

Bu tekniğin siklon BGFP'nin izlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, siklon B SNAP'in tüm protein ekspresyonu yerine siklon B bozunmasının izlenmesine izin vermesidir. Bu deney için anlık raportör hücrelerin başlangıçta en az 48 saat boyunca log fazında eşzamansız olarak büyümesine izin verilir. Başlamak için, tripsin tohumlama prosedürü, hücrelerin oda santrifüjünün tüm yüzeyi boyunca sabit bir dağılımla sekiz kuyulu mikroskop odasına tohumlanması için alt birleşme snap raportör hücreleridir.

10.000 hücre ve Resus, fenol kırmızısı içermeyen normal bir büyüme ortamı olan 350 mikrolitrede harcar. Hücrelerin, odanın merkezinde maksimum hücre yoğunluğuna sahip sekiz kuyulu mikroskop odasına tohumlanması için hücre süspansiyonunu mikroskop odasına aktarın. İlk olarak, hazneyi 300 mikrolitre feno kırmızısı serbest normal büyüme ortamı ile yükleyin.

Daha sonra, hücrelerin 96 üzerine tohumlanması için mikroskop odasının merkezine dikkatlice 5.000 hücre ekleyin. Kuyu santrifüjünün tüm yüzeyi boyunca sabit bir dağılımda iyi özel optik plakalar, 5.000 hücre ve gerekli kuyucuk içeren toplam hücre sayısına bağlı olarak 300 mikrolitre fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında yeniden süspanse edilir. Hücre numarasını ve süspansiyon ortamının toplam hacmini ayarlayın.

Daha sonra, hücrelerin 96'ya tohumlanması için hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kuyu merkezinde maksimum hücre yoğunluğuna sahip özel optik plakalar. Her bir kuyucuğun ortasına küçük bir damla halinde 15 mikrolitre fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamına 1.500 hücreyi dikkatlice ekleyin.

Bu, hücre büyümesini kuyunun merkeziyle sınırlayacaktır. Boyama işleminin başlamasından 30 dakika önce tüm tohumlanmış hücrelerin standart hücre kültürü koşulları altında en az 18 saat büyümesine izin verin. Fenol kırmızısı serbest normal büyüme ortamının 37 santigrat dereceye kadar ısınma kuatları.

Bu gösterideki geçmeli substrat, TMR yıldız stok çözeltisinin 400 mikromolar seyreltik 0.5 mikrolitre konsantrasyonuna sahip bir stok çözeltisi elde etmek için DMSO'da TMR yıldızı çözünmüş TMR yıldızının kolay kullanımı için TMR yıldızıdır. 200 mikrolitre ılık fenol kırmızısı serbest normal büyüme ortamında, bir mikromolar nihai etiketleme konsantrasyonu elde etmek için. Daha sonra, asenkron olarak büyüyen hücrelerden normal büyüme ortamını çıkarın ve standart kültür koşulları altında 25 dakika boyunca etiketleme ortamında hücreleri inkübe eden hücreleri etiketleme ortamı ile değiştirin.

25 dakika sonra, etiketleme ortamını çıkarın ve hücreleri ılık fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı ile dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri mikroskoba taşımadan önce 30 dakika boyunca 300 mikrolitre ılık fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında inkübe edin. Önceden ısıtılmış 37 santigrat derece ısı bloğu üzerindeki bir strafor kutuda mikroskoba kalan bağlanmamış çıtçıtlı substrat taşıma hücrelerini çıkarmak için ortamı taze, ılık fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı ile değiştirin.

Floresan yoğunluğunun ölçülmesinden iki saat önce sıcaklık değişimini en aza indirmek için. Mikroskobu ve tüm bileşenlerini istenen sıcaklığa getirmek için iklim odasının hava sıcaklığını kuru modda 37 santigrat dereceye ayarlayın. Yoğuşmayı ve ardından mikroskobun hasar görmesini önlemek için, nemi ayarlamadan önce ön ısıtma yapmak önemlidir.

Tüm mikroskop sistemi 37 santigrat dereceye ulaştığında, hava nemini %60'a ve karbondioksiti %5'e ayarlayın Taramayı veya edinme yazılımını başlatın ve standart ayarları tanımlayın. Analiz edilecek kuyuların konumlarını tanımlayın. Delta T veya alım döngüsü süresini ve alım döngülerinin mutlak sayısını tanımlayın.

Bu gösteride. Donanım otofokusu, daha fazla sayıda kuyunun analizi için önceden seçilmiştir. Satın almayı başlatın ve ilk iki satın alma döngüsünü denetleyin.

Mikroskop, filtre değiştirilmeden ve karşılık gelen TMR yıldız görüntüsü elde edilmeden önce bu kanalda bir ilk görüntünün elde edilmesiyle histon H iki GFP sinyaline odaklanacaktır. Bu, bir kuyu içindeki tüm pozisyonlar için ve bir sonraki döngüyü tekrarlamadan önce incelenecek kuyuların her biri için tekrarlanır. Yine. Proteolitik profilleri analiz etmek için scan R analiz yazılımını başlatın.

Görüntüleri, sinyal yoğunluğuna dayalı bir eşik ve komşu hücreleri ayırmaya yardımcı olmak için bir havza algoritması kullanarak ana nesne olarak tanımlanan histon H iki GFP tarafından görselleştirilen hücre çekirdeği ile analiz edin. TMR yıldız analizi için sitoplazmalı çekirdekten oluşan bir alt nesne oluşturulmalıdır. Ana nesnenin önemli özellikleri, X ve Y konumları, zaman ve maksimum ve ana nesne için GFP'nin ortalama yoğunlukları ve toplam yoğunluğun alana bölünmesidir.

TMR yıldız alt nesnesi için, alt nesnenin zaman içindeki ortalama TMR yıldız floresan yoğunluğunu veya analiz edilen ana nesnelere atanan hücre izlerini görselleştirmek için izleme moduna geçin. Daha fazla sayıda hücreye bakmak, ilk temsili ve objektif bir görünüme izin verir, ancak incelenecek hücre sayısı, en az 140 döngü süren ve büyük bir maksimum histon H iki GFP yoğunluğu içeren ölçümler üzerine geçit yapılarak daraltılabilir. Tek hücre düzeyinde aynı anda histon H, iki GFP ve TMR yıldız floresanını görselleştirmek için ilgilendiğiniz bir hücre izini seçin.

Sağ fareyi kullanarak, ilgilendiğiniz bir hücreye tıklayın ve dışa aktarılabilir bir resim oluşturun. Histone H iki GFP ve bisiklet B'nin her seferinde TMR yıldızını yakaladığı illüstrasyon galerisi. Tarayıcı analiz yazılımının popülasyon moduna geçiş yapın ve ilgilenilen hücrenin nokta lekesi üzerinde temsil edildiği bölgeyi geçitleyin.

Geçitli bölgeye yeni bir nokta grafiği penceresi uygulayın ve zaman içindeki ortalama TMR yıldız floresan yoğunluğunu görselleştirin. Daha fazla hesaplama için verileri Microsoft Excel'e aktarın. Buradaki şekiller, nükleer zarf parçalanmasını takiben sitoplazmanın sıkışması üzerine kromozomal yanlış hizalama belirtileri olmadan düzenli bir mitoz boyunca ilerleyen bir hücrenin TMR yıldız floresan yoğunluk eğrisi ile temsil edilen Siklin B kinetiğini veya kırmızı üçgen TMR staph floresan yoğunluğu ile gösterildiği gibi NEBD'yi göstermektedir.

Hücre prometafaza girdiğinde, hücre profaz ve metafaz boyunca ilerlediği sürece floresan yoğunluğu sabit bir seviyede kalır ve daha sonra hızla düşmeye başlar. Tüm kromozomlar stabil bir metafaz plakası oluşturduğunda, bu damlalar kromozom ayrılmasından önce gelir. Geç mitozda eğri üzerinde mavi nokta ile gösterilen anafaz sırasında, kromatin yoğunlaşmaya başlar ve hücre faz morfolojisine geçer.

Floresan yoğunluk eğrisi platoya yaklaşırken, mitoz bölünmeden önceki platodan daha düşük olan platonun gelişmesinin ardından. Bu teknik, mitoz alanındaki araştırmacıların, mitotik ilerlemeyi düzenleyen döngü, bozunma ve sentez arasındaki sıkı dengeyi keşfetmelerinin yolunu açtı.