Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Bu prosedürün amacı, döngüsel B proteolizinin anafaz başlangıcını ve mitotik çıkışı nasıl yönettiğini izlemektir. Bu işlem, öncelikle döngüsel B snap reporter hücrelerinin mikroskopi lamlarına ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise kimerik Cyclin B snap reporter molekülünün floresan substrat TMR star ile işaretlenmesidir.

Ardından, görüntü serileri bir mikroskopi istasyonunda elde edilir. Son adım, hücrelerin analiz edilmesi ve cycling B proteolizini yansıtan TMR star floresan yoğunluğunun zaman içindeki değişiminin hesaplanmasıdır. Nihayetinde, canlı raporlayıcı hücrelerin immunofloresan mikroskopisi, mitoz sırasında gerçekleşen cycling B proteolizinin kinetiğini ortaya koyar.

Bu tekniğin, siklon BGFP izleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, siklon B SNAP'in tüm protein ekspresyonundan ziyade siklon B degradasyonunun izlenmesine olanak tanımasıdır. Bu deney için kullanılan snap raporlayıcı hücrelerin, başlangıçta log fazda asenkron olarak en az 48 saat boyunca büyümelerine izin verilir. Başlamak için, hücrelerin sekiz kuyucuklu mikroskop odacıklarına, odacık santrifüjünün tüm yüzeyi boyunca sabit bir dağılımla ekilmesi amacıyla, sub-konfluan snap raporlayıcı hücreler için tripsinleme prosedürü uygulanır.

10.000 hücre ve Resus, 350 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında süspanse edilir. Hücrelerin, odacığın merkezinde maksimum hücre yoğunluğu olacak şekilde sekiz kuyucuklu mikroskop odacıklarına ekilmesi için hücre süspansiyonunu mikroskop odacığına aktarın. Önce odacığı 300 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı ile doldurun.

Ardından, hücrelerin 96 kuyucuklu özel optik plakalara tüm kuyucuk yüzeyi boyunca sabit bir dağılımla ekilmesi için mikroskop bölmesinin merkezine dikkatlice 5.000 hücre ekleyin; gerekli toplam hücre içeren kuyucuk sayısına bağlı olarak 5.000 hücreyi santrifüjleyin ve 300 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında yeniden süspande edin. Hücre sayısını ve süspansiyon ortamının toplam hacmini ayarlayın.

Ardından, hücrelerin kuyucuk merkezinde maksimum hücre yoğunluğuna sahip olacak şekilde 96 kuyucuklu özel optik plakalara ekilmesi için hücre süspansiyonunu 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Her bir kuyucuğun merkezine, 15 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı içindeki 1.500 hücreyi küçük bir damla halinde dikkatlice ekleyin.

Bu işlem, hücre büyümesini kuyucuğun merkezine sınırlayacaktır. Boyama prosedürüne başlamadan 30 dakika önce, ekilen tüm hücrelerin standart hücre kültürü koşulları altında en az 18 saat boyunca büyümesine izin verin. Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı miktarlarını 37 °C'ye ısıtın.

Bu demonstrasyondaki snap substratı, kolay kullanım için TMR star'dır; 400 micromolar konsantrasyonda bir stok çözelti elde etmek için TMR star, DMSO içinde çözülür. Final etiketleme konsantrasyonu bir micromolar olacak şekilde, 0.5 microliters TMR star stok çözeltisi, 200 microliters ılık, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı ile seyreltilir. Ardından, asenkron olarak büyüyen hücrelerdeki normal büyüme ortamı uzaklaştırılır ve yerine etiketleme ortamı eklenir; hücreler, standart kültür koşulları altında etiketleme ortamında 25 dakika boyunca inkübe edilir.

25 dakika sonra, işaretleme besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri sıcak, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri ile dört kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, hücreleri mikroskoba taşımadan önce 30 dakika boyunca 300 microliters sıcak, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri içinde inkübe edin. Bağlanmamış kalıntı snaps substratını uzaklaştırmak için besiyerini taze, sıcak, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri ile değiştirin; hücreleri 37 degree Celsius derecede önceden ısıtılmış bir ısı bloğu üzerinde, strafor bir kutu içerisinde mikroskoba taşıyın.

Floresans yoğunluğu ölçümünden iki saat önce sıcaklık değişimini en aza indirmek için iklimlendirme kabininin hava sıcaklığını, mikroskobu ve tüm bileşenlerini istenen sıcaklığa getirmek amacıyla kuru modda 37 degrees Celsius olarak ayarlayın. Yoğuşmayı ve buna bağlı olarak mikroskobun zarar görmesini önlemek için, nem ayarını yapmadan önce ön ısıtma yapmak önemlidir.

Tüm mikroskop sistemi 37 °C sıcaklığa ulaştığında, hava nemini %60 ve karbondioksiti %5 olarak ayarlayın. Tarama veya veri toplama yazılımını başlatın ve standart ayarları belirleyin. Analiz edilecek kuyucukların konumlarını tanımlayın. Delta T veya veri toplama döngü süresini ve toplam veri toplama döngüsü sayısını belirleyin.

Bu gösterimde, daha fazla sayıda kuyucuğun analizi için donanım otomatik odaklama önceden seçilmiştir. Görüntülemeyi başlatın ve ilk iki görüntüleme döngüsünü denetleyin.

Mikroskop, histone H2 GFP sinyaline odaklanacak ve filtre değiştirilip karşılık gelen TMR star görüntüsü alınmadan önce bu kanalda ilk görüntü elde edilecektir. Bu işlem, bir kuyucuktaki tüm konumlar ve incelenecek kuyucukların her biri için, bir sonraki döngü tekrarlanmadan önce yinelenir. Proteolitik profilleri analiz etmek için scan R analiz yazılımını başlatın.

Sinyal yoğunluğuna dayalı bir eşik değer ve komşu hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için bir watershed algoritması kullanılarak, histone H2 GFP ile görselleştirilen hücre çekirdeklerinin ana nesne olarak tanımlandığı görüntüleri analiz edin. TMR* analizleri için sitoplazma içeren çekirdeklerden oluşan bir alt nesne oluşturulmalıdır. Ana nesnenin önemli özellikleri X ve Y konumları, zaman, GFP'nin maksimum ve ortalama yoğunlukları ve toplam yoğunluğun alana bölünmüş oranıdır.

TMR star alt nesnesi için, alt nesne ortalama TMR star floresan yoğunluğunun zaman içindeki değişimini veya analiz edilen ana nesnelere atanan hücre izlerini görselleştirmek amacıyla izleme moduna geçin. Daha fazla sayıda hücreye bakmak, ilk temsilî ve objektif görünümü sağlar; ancak incelenecek hücre sayısı, en az 140 döngü süren ve yüksek maksimum histon H iki GFP yoğunluğu içeren ölçümlere kapılama (gating) yapılarak daraltılabilir. Tek hücre düzeyinde histon H iki GFP ve TMR star floresansını eş zamanlı olarak görselleştirmek için ilgilenilen bir hücre izini seçin.

Farenin sağ tuşunu kullanarak ilgilenilen bir hücreye tıklayın ve dışa aktarılabilir bir resim oluşturun. Her bir zaman noktası için histon H2 GFP ve cyclin B snap TMR* illüstrasyon galerisi. Tarayıcı analiz yazılımının popülasyon moduna geçin ve nokta grafiğinde ilgilenilen hücrenin temsil edildiği bölgeyi belirleyin.

Kapılı bölgeye yeni bir nokta grafiği penceresi uygulayın ve zaman içindeki ortalama TMR star floresans yoğunluğunu görselleştirin. Daha ileri hesaplamalar için verileri Microsoft Excel'e aktarın. Buradaki şekiller, kırmızı üçgenle belirtilen çekirdek zarının parçalanması (NEBD) sonrası sitoplazma sıkışmasıyla birlikte kromozomal dizilim bozukluğu belirtileri göstermeden normal bir mitoz geçiren bir hücrenin TMR star floresans yoğunluğu eğrisiyle temsil edilen Cyclin B kinetiğini betimlemektedir; TMR staph floresans yoğunluğu, izomorfik pencereye ulaşılana kadar ani bir artış gösterir.

Hücre prometafaza girdiğinde, profaz ve metafaz boyunca ilerlediği sürece floresan yoğunluğu sabit bir seviyede kalır ve ardından hızla düşmeye başlar. Tüm kromozomlar stabil bir metafaz plağı oluşturduğunda, bu düşüş kromozom ayrılmasını önceden haber verir. Mitozun geç evresindeki eğride mavi nokta ile belirtilen anafaz sırasında, kromatin dekondans olmaya başlar ve hücre interfaz morfolojisini benimser.

Floresan yoğunluk eğrisi, mitoz sonrası gelişiminden önceki platoya göre daha düşük olan plato seviyesine yaklaşırken. Bu teknik, mitoz alanındaki araştırmacıların, mitotik ilerlemeyi düzenleyen döngüsel yıkım ve sentez arasındaki hassas dengeyi keşfetmelerinin önünü açmıştır.