Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Bu prosedürün genel amacı, model organizma drosophila melanogaster'deki canlı ve sabit dokuda mitokondriyal yapı ve işlevi incelemek için yöntemler göstermektir. Bu yöntem, Mitokondriyal Biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Mitokondriyal fonksiyonun düzenleyici mekanizmaları gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal yapı/fonksiyon ilişkisinin detaylı analizini yapmasıdır. Anestezi uygulanmış beş dişi sineği metin protokolüne göre ayırdıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında, toraksı karından ayırmak için iki çift forseps kullanın. Ardından, karınları dikkatlice yemeğin ikinci kuyusuna aktarın.

Karnı arka uçta tutmak için bir çift forseps kullanarak, yumurtalıkları yavaşça dışarı itmek için diğer forseps çiftini kullanın. Daha sonra, tek bir yumurtalığı opak arka ucundan tutmak için forsepsleri kullanın ve alay etmek veya sabitlemek için dikkatlice yemeğin üçüncü kuyusuna taşıyın. Arka ucu tutmak için bir çift forseps kullanarak ve bir alay iğnesini arkadan ön uca hafifçe süpürerek koruyucu kılıfı yumurtalıkların etrafından dikkatlice çıkarın.

Polilizan kaplı odaları hazırlamak için, cam tabanlı bir petri kabının kapak camına iki ayrı 20 mikrolitrelik polilizan damlası yerleştirin. Plakaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede havayla kurutun ve plakanın alt tarafındaki polilizini ana hatlarıyla belirtin. Görüntü alma yazılımını açarak konfokal mikroskopta tarama parametrelerini ayarlayın ve çekim sekmesinde uygun tarama parametrelerini ayarlayın.

Tek tek sekmeleri açmak için zaman serisi, ağartma ve bölgeler kutularını işaretleyin. Ardından, her sekmeye uygun alım parametresi değerlerini girin. Daha sonra, kesilmiş ve alay edilmiş bir yumurtalığı işaretli polilisin kaplı bir bölgeye yerleştirin ve yumurtalığı yaymak ve yumurtalıkları ayırmak için bir alay iğnesi kullanın.

Yumurtalığın üzerine 10 mikrolitrelik bir böcek diseksiyon ortamı damlatın ve tüm polilisin kaplı alanı kapladığınızdan emin olun. Ardından petri kabının üzerini örtün. Yumurtalığı monte ettikten hemen sonra, numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve canlı dokudaki ilgi alanını hızlı bir şekilde bulmak için göz merceğini kullanın.

Seçilen ilgi alanının canlı bir görüntüsünü elde etmek için canlı'yı tıklayın, ardından canlı taramayı durdurmak için durdur'u tıklayın. Gerekirse, algılama parametrelerini, ofset değerlerini ayarlayarak algılanan floresan sinyali, tanımlanan arka planla birlikte doygunluk seviyelerinin altında olacak şekilde ayarlayın. Grafik sekmesinden, tarama ile elde edilen görüntüdeki fotoğraf ağartma bölgesini sınırlamak için küçük bir ROI çizmek için bezier çizim aracını kullanın.

Ardından, deneyi başlat'a tıklayarak görüntü alımını gerçekleştirin. Floresan mitokondriyal boyalarla canlı boyama yapmak için, leke stoğunu ılık diseksiyon ortamında nihai çalışma konsantrasyonlarına kadar seyreltin. Diseksiyon ve alay daha önce gösterildikten sonra, yumurtalıkları bir diseksiyon kabının kuyusuna 200 mikrolitre boyama solüsyonuna yerleştirin.

Çanağı ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılı kutu ile örtün ve dokuyu 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, lekeli yumurtalıkları forseps kullanarak yıkayın ve lekesiz ortam içeren üç ardışık oyuğa dikkatlice hareket ettirin. TMRE ile birlikte boyama için, uyumlu genel mitokondriyal boyada, önce TMRE ile boyamayı gerçekleştirin, ardından dokuyu yıkamadan, numuneyi hemen genel mitokondriyal boyaya aktarın.

Bu videoda daha önce gösterildiği gibi yumurtalıkları yıkadıktan ve monte ettikten sonra, numune üzerinde konfokal görüntüleme yapmak için sekmeyi açmak için z-kesit kutusunu işaretleyin. Canlı tarama yapılırken odak tekerleğini numunenin altına doğru çevirin ve en alttaki z kesitini tanımlamak için önce ayarla'ya tıklayın. Ardından, en üstteki bölümü tanımlamak için odak tekerleğini ters yönde hareket ettirin.

Deneyi başlat'a tıklayarak görüntü alımını gerçekleştirin. Canlı xvivamikroskopi durumunda, veriler doku montajından sonraki 15 dakika içinde elde edilmelidir, aksi takdirde deneysel sonuçlar, dokunun ölümüne bağlı olarak fizyolojideki değişikliklerden etkilenebilir. Diseksiyondan hemen sonra, bir davlumbaz altında, yumurtalıkları bir cam diseksiyon kabının kuyusuna 200 mikrolitre taze oda sıcaklığındaki PFA'ya yerleştirin.

Düzeltmek için dokuyu 15 dakika inkübe edin. PBS'deki yumurtalıkları metin protokolüne göre yıkadıktan sonra, hala PBS'deyken, antikordan antijen erişimini engelleyebilecek koruyucu lif kılıfını dikkatlice çıkarmak için yumurtalıkları kızdırın. Alay edilen yumurtalıkları, PBS'de 500 mikrolitre yüzde 0.5 tritan x 100 içeren bir mikrosigorta tüpüne yerleştirerek geçirgen hale getirin.

Ardından, tüpü kapalı bir kutuya yerleştirin ve 30 dakika boyunca 25 RPM'de sallanmaya ayarlayın. PBS/TX'i metin protokolüne göre çıkarın, yüzde 0,5 PBS/TX içinde çözünmüş 200 mikrolitre BSA ekleyerek dokuyu bloke edin. Numuneleri külbütör üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Engelleme çözeltisini çıkardıktan sonra, anti-kuduz desycline E ve anti-fare ATPB antikorları ekleyin. Rocker üzerindeki dokuyu oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, yumurtalıkları her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkamak için PBS-TX kullanın.

Daha sonra, 200 mikrolitre uygun ikincil antikorlar ve taze PBS-TX ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Dokuyu iki kez yıkadıktan sonra, üçüncü yıkamaya kancalar ekleyin. Daha sonra bir mililitrelik bir mikropipet ile, immüno-lekelenmiş yumurtalıkları mikrofüze tüpünden 200 mikrolitre PBS içeren bir cam diseksiyon kabının taze bir kuyusuna çıkarın.

Bir cam slayta bir damla gliserol bazlı montaj ortamı ekleyin ve immüno-lekeli yumurtalıkları tek tek montaj ortamına ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, yumurtalığın opak kısmını forseps ile tutarken, şeffaf yumurtalıkları opak olgun yumurta odalarından nazikçe koparmak için bir alay iğnesi kullanın. Ardından, olgun yumurta odalarını montaj ortamından çıkarın.

Sürgünün üzerine bir kapak camı yerleştirin ve montaj ortamının eşit şekilde yayılmasını sağlamak için hafifçe bastırın. Kenarları kapatmak için oje kullanmadan önce numuneleri 15 dakika havayla kurutun. Son olarak, gerektiği gibi konfokal mikroskopi yapın.

Burada gösterildiği gibi, nerse hücreleriyle ilişkili mitokondriyal bulutlardan birine hedeflenen çevirme, 200 saniye içinde kırmızı çevirme ROI'sini çevreleyen mavi ve beyaz ROI'lerden gelen floresan sinyalinin yüzde 50'den fazla kaybına yol açarken, sarı kontrol ROI'si minimum düzeyde ağartılır. Drosophilla yumurtalıkları, doku derinliği ile sinyalde bir azalma sergiledi ve canlı görüntüleme sırasında TMRE ve mitostain gibi floroforların tespit edilebileceği maksimum doku derinliğini ayırt etmek önemlidir. TMRE ile birlikte boyamadan ve genel mitokondriyal boyamadan elde edilen kalitatif bir analiz, drisophilla germarium'un evre 2B'de birim kütle başına daha yüksek mitokondriyal potansiyel sergilediğini göstermektedir.

Bu şekilde, yarı kalitatif analiz, 9. aşama yumurta odasından analiz edildiği gibi, AFC'ler ve MBC'ler arasındaki birim kütle başına mitokondriyal potansiyel farkını göstermektedir. Bu görüntüler, mitokoks alımının mitotik ve mitotik sonrası drisophilla folikül hücrelerinde meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Bu deneyde, ko-immün boyama, mitokondriyal ATPB sinyali ve Germaryum'da ve bir aşama 9 yumurta odasında GFP negatif DRP1 nole klonları ile örtüşen yüksek desiklin sinyalini tanımlar.

Açıklanan yöntemler, diğer drisophilla dokularında mitokondriyal yapı fonksiyonunu incelemek için değiştirilebilir ve kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokonriyal yapı ve işlevi incelemek için sabit ve canlı drisophilla yumurtalıklarının nasıl diseksiyon yapılacağını, boyanacağını ve görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.