Name: Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Öğrenin, değişken açılı epifloresans mikroskopi ile Arabidopsis thaliana bitki hücrelerinde GFP etiketli PATROL1 protein dinamiklerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, zar trafik proteinlerinin davranışını incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

VAEM için teknik önerileri için Dr. Masaru Fujimoto'ya minnettarım. Ayrıca Prof. Koh Iba ve Dr. Mimi Hashimoto-Sugimoto'ya GFP-PATROL1 transgenik bitkiler sağladıkları ve PATROL1 hakkındaki tartışmaları için minnettarım. Prof. Seiichiro Hasezawa'ya çalışmalarıma verdiği sürekli destek için teşekkür ederim. Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) KAKENHI hibe numarası 25711017 tarafından desteklenmiştir.

Fidan 1. Hazırlık <ol><li> Tohum sterilize edin. <ol><li> Ve 1 ul% 10 Triton X-100 500 ul steril su: 500 ul NaClO (% 5.0 mevcut klorin) eklenerek sterilizasyon solüsyonu hazırlayın. </li><li> Yeri yaklaşık 10 transgenik A. Bir 1.5 ml tüp içine GFP PATROL1 8 taşıyan thaliana tohumları. </li><li> 1 ml% 70 etanol solüsyonu ekleyin ve beş kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. 1 dakika boyunca bekletin. </li><li> Tohumlar tüpün dibine çöker gözlemleyin. Temiz bir laminer akış kabininde, yavaşça bir mikropipet kullanılarak% 70 etanolü çıkarmak ve 1 ml sterilizasyon çözeltisi ilave edilir. Beş kez tersini İyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. </li><li> Tohum yıkayın. Hala temiz bir bankta aseptik koşullarda çalışan, yavaşça bir mikropipet kullanarak çözüm kaldırmak ve 1 ml steril su ekleyin. Bu beş kez tekrarlayın. Sterilize edilmiş tohumlara, 2 gün boyunca 4 ° C&#39;de steril su içinde depolanabilir. </li></ol></li><li> Yani% 0.5 gellan zamkı katılaşmış 1/2 Murashige ve Skoog levha (pH 5.8) 9 sterilize edilmiş tohumlar, w. Cerrahi bant iki kat kullanarak plaka üzerine kapağı bantlayın. </li><li> Soğuk depolama odası O / N 4 ° C&#39;de karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> 100 umol m-2 sec -1 beyaz ışık kullanarak 12 saat / 12 saatlik bir ışık-karanlık çevrimi ile 23.5 ° C &#39;ye ayarlanmış bir büyütme odasında içine plaka aktarın ve 7 gün boyunca inkübe edilir. Uzun yaklaşık 1 mm kotiledonlarında fideler daha sonra hasat edilebilir. </li></ol> 2. Sky Drop Kotiledon Örnekler montajı NOT: VAEM gözlem numune hazırlama önemli bir faktör numune ve kapak cam arasındaki hava kabarcıkları dahil kaçınmaktır. Kabarcıklar ölçüde kırılma indeksi farklılıkları yol açarak VAEM görüntü kalitesini azaltır. Biz montaj &#39;gökyüzü bırak&#39; çağrısında bulundu basit bir yöntem, kabarcıkları önlemek için de kullanılabilirA arasında thaliana Kotiledonlar ve kapak cam. Bu gözlem hemen önce yapılmalıdır. <ol><li> 76: Bazal tampon [5 mM 2- (N-morfolino) -etansülfonik pH 6.5&#39;te asit tris (MES-Tris), 50 mM KCI, 100 uM CaCl2] Bir cam slayt ortasına (boyut 30 ul koyun × 26 mm, kalınlığı: 1.0-1.2 mm). </li><li> Diseksiyon makas kullanarak 7 günlük bir fide bir kotiledon çıkarın. Gözlem tarafı bazal tampon damla (Şekil 1, aşama 1) üzerinde yukarı bakacak şekilde kotiledon kaydırın. </li><li> Bir kapak cam ortasına bazal tampon 30 ul yerleştirin (boyut: 18 × 18 mm, kalınlığı: 0,12-0,17 mm) (Şekil 1, adım 2). Başaşağı hafifçe cam kapak çevirin. Yüzey gerilimi düşmesini tampon damla önleyecektir. Bir kenarında cımbızla cam kapak tutun. Tampon damla yaklaşık kotiledon üstünde olacak şekilde cam slayt karşı kenarını yerleştirin. </li><li>Bu kotiledon örnek (Şekil 1, aşama 3) üzerinde yer almaktadır, böylece sürgü hala, kapak camın kenarına ve hala cımbız ile karşı kenarını tutarken, kapak camı altında tamponu damla konumunu ayarlamak. Kapak cam gidelim. Hava kabarcığı olmadan bir hazırlık sonucunda numune üzerinde bir damla monte edin. </li><li> Havsız dokuları kullanılarak aşırı tampon siliniz. Hemen hazırlık gözlemleyin (adım 3). NOT: örnekleri mühür gerek yoktur. </li></ol> 3. VAEM Gözlem ve Toplama Film Bir ters mikroskop, bir TIRF ünitesi ve 1.49 sayısal diyafram ile bir TIRF objektif lens ile donatılmıştır: NOT: aşağıdaki gibi bu çalışmada kullanılan TIRF mikroskop sistemi 9 açıklanmıştır. Lazer giriş açısının bilgisayarlı kontrol için, bir kontrol kutusu kullanılır. Yeşil floresan proteini (GFP) 488 nm optik pompalanan yarıiletken lazer ve t ile heyecanlıO floresans kloroplast gelen otoflüoresanı önlemek için 510-550 nm bant-geçiş filtresi içinden tespit edilir. Fiber çıkış gücü ölçülen maksimum değeri 13,0-13,5 mW olduğunu. Tespiti için, bir elektron kullanılır (EM-CCD) kamera kafası sistemi ve bir C-mount kamera büyütme değişim ünitesi şarj çiftli cihaz çarparak. <ol><li> Lazer üreticinin talimatlarına göre merkezleme ve odaklama kalibrasyonu. Not: Bu adım hassas VAEM gözlemleri için çok önemlidir. Kuvvetle lazer yolu ayar prosedürlerinin periyodik kontroller, mikroskop uygun, yürütülmektedir tavsiye edilir. <ol><li> Mikroskopi odasının tavanında bir objektif lens içermeyen ışık yolu ile aydınlatılmış merkezi konumunu belirleyin. Merkezi konumunu işaretlemek için, tavanda renkli daire mühür koymak (Şekil 2, adım 1, 2). </li><li> Objektif lensi (Şekil 2, aşama 3, 4) sahip tavan yakma. I Taşıorta konumda (Şekil 2, adım 5) &#39;bölgesini lluminated. Lazer (Şekil 2, Adım 6) odaklanın. Ince ayar yapma merkezi (Şekil 2, basamak 7) odaklanmış lazer konumu. </li></ol></li><li> Mikroskop sahnede bir örnek olarak ayarlayın ve parlak alan aydınlatma kullanılarak gözlem hücreleri seçin. </li><li> Floresan protein hücrelerinde görülebilir kontrol edin ve Epifloresans aydınlatma (Şekil 3A) kullanılarak hücre yüzeyinde z -Axis konumunu ayarlamak. </li><li> VAEM gözlemleri gerçekleştirin. <ol><li> Denetleyici kutusu ile yavaş yavaş lazer ışınının giriş açısı eğim. Aynı zamanda, özenle canlı görüntüyü izlemek. Başlangıçta, görüntü (Şekil 3B) bulanık olacaktır. </li><li> Lazer açısı arttıkça, VAEM görüntü sonunda net bir görüntü (Şekil 3C ve D) üreten, daha az bulanık hale gelecektir. Bu noktada, increa durdurmaLazer açısını şarkı. Floresan sinyali kaybolursa, sığ açı azalır. </li><li> İnce ayar lazer giriş açısı daha iyi bir görüntü elde etmek için. İnce ayar z -Axis pozisyon da imajını artırabilir. Gerekirse, optik parametreleri (lazer gücü, dalga boyu ve filtre seti) ve görüntü sensörü parametrelerini [görüntü boyutu, pozlama süresi, kazanç, sayısallaştırıcı ve elektron-çarparak (EM) kazanç] ayarlayın. NOT: TIRF mikroskop ekipman durumda yukarıda açıklanan aşağıdaki gibi, temsilci parametrelerdir. Sadece kamera önünde lens Büyütme: 2X; Lazer çıkışı: 1.0 mW; Resim boyutu: 512 × 512 piksel; Pozlama süresi: 100 ms; Kazanç: 5 ×; Dijitalleştirici: 11 MHz; ve EM kazanç: 100. </li></ol></li><li> Ticari mikroskop yazılımını kullanarak çok sayfalı TIFF görüntü dosyası olarak film edinin. Burada, film stoma hücrelerinin yüzeyi üzerinde yanıp sönen GFP-etiketli noktalar taşımaktadır. NOT: Temsili görüntü alma koşulları fol gibidiralçak. Toplama Modu: Akış RAM&#39;e; Kare sayısı: 600; ve çoklu sayfa TIFF dosya boyutu: ~ 302 MB. </li></ol> 4. kymograph Analizi Niceleme için GFP etiketli Dot Residence Time Fiji Yazılım Kullanma <ol><li> Fiji Install yazarların yönergeleri kullanarak yazılım 10 (&#39;Fiji Just ImageJ olduğu&#39;) (http://fiji.sc/Fiji). </li><li> Fiji çalıştırın ve Fiji menüsü &quot;Dosya-Aç&quot; kullanılarak elde çoklu sayfa TIFF dosyasını açın. </li><li> Fiji araç çubuğu menüsü &quot;Düz Çizgi Seçim Aracı&quot; seçeneğini kullanarak, ilgi sitede bir çizgi yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, &quot;Segment Hattı Seçim Aracı&quot; veya &quot;Serbest Hattı Seçim Aracı&quot; kullanın. Burada sunulan sonuçlar şekilde, (8.0 um karşı gelen) 100 piksellik bir düz çizgi bir yan hücre (Şekil 4A) üzerine yerleştirilmiştir. </li><li> Fiji menüsü &quot;Resim-Yığınları-Dinamik Reslice kullanarak bir kymograph görüntü olun </em&gt; &quot;(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Şekil 4B). İsteğe bağlı olarak, bir onay kutusu penceresinde ve &quot;Döndür 90 Degrees&quot; &quot;Dikey Döndürme&quot; de (100 piksel tekabül (Burada sunulan sonuçlar kullanılmaz) kymograph görüntüde. X ve y ekseni hattı konumunu belirtmek mevcuttur 8.0 mikron) ve gözlem süresi (600 piksel sırasıyla) 60 saniyeye tekabül etmektedir. kymograph görüntü tatmin edici değilse, pozisyon ve tip (düz, parçalı ve çok sayfalı görüntü hattın serbest) gibi. değiştirilebilir çizgi değişikliği, kymograph görüntü dinamik olarak değişir. Fiji menüsü &quot;Dosya-Farklı Kaydet-Tiff&quot; kullanarak bir TIFF dosyası olarak bir kymograph görüntüsünü kaydedin. </li><li> Zaman ekseni yönde blob uzunluğunu ölçün. <ol><li> Gürültü azaltma gerçekleştirmek için, Fiji menüsü &quot;Süreç Filtreler-Gaussian Blur&quot; seçeneğini kullanarak kymograph görüntüleri Gauss filtre uygulamak. &quot;Sigma (Radius) &quot;parametresi ayarlanabilir (1 piksel yarıçapı sunulan sonuçlar için kullanılan) &#39;dir. </li><li> Segment Fiji menüsünü kullanarak eşikleme sinyal bölgeleri, &quot;Resim-ayarlayın-Eşik&quot;. NOT: Aralarından seçim yapabileceğiniz çeşitli eşikleme algoritması vardır. Sunulan sonuçlarda, &quot;Yen&quot; algoritması (Şekil 4C) seçildi. </li><li> Menüsünü kullanarak blob&#39;un -Axis uzunluğu süresi (y) ölçmek için hazırlanın &quot;Analiz-Set Ölçümleri&quot;. &quot;Set Ölçümleri&quot; penceresindeki &quot;Sınırlayıcı dikdörtgen&quot; seçeneğini işaretleyin. İdeal Alan seti gürültü çıkarmak, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Burada asgari alan 50 piksel olarak belirlendi. Zaman (y) menüsünü kullanarak blob&#39;un -Axis uzunluğunu ölçün &quot;Analiz-Analiz Parçacıklar&quot;. Yöneticisi Ekle &quot;sonuç değerleri elde ve ölçüm bölgelerinin güvenilirliğini kanıtlamak,&quot; sonuçlarını görüntüle &quot;kontrol etmek ve &lt;/ em&gt; &quot;kutuları. </li><li> &quot;Yükseklik&quot; sütununda değerler (y) ölçülen damla (Şekil 4D) için uzunlukları -Axis zaman vardır. Sonuçlar tablo menüsü &quot;Dosya-Farklı Kaydet&quot; seçeneğini kullanarak değerleri kaydetmek ve hesaplanması ve istatistiksel paket ve / veya elektronik tablo yazılımı (Şekil 4E) kullanarak blob görüntü süreleri veri kümesi işlemek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+dynamics+and+functional+redundancy+of+the+Arabidopsis+dynamin-related+isoforms+DRP1A+and+DRP1C+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).</li>
<li>Fujimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+dynamin-related+proteins+DRP2B+and+DRP1A+participate+together+in+clathrin-coated+vesicle+formation+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).</li>
<li>Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microfilament+dynamics+and+actin+side-binding+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).</li>
<li>Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtFH1+formin+mutation+affects+actin+filament+and+microtubule+dynamics+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).</li>
<li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+epifluorescence+microscopy%3A+a+new+way+to+look+at+protein+dynamics+in+the+plant+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex.</a> Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).</li>
<li>Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+of+intact+cells+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 7 (27), (2011).</li>
<li>Hashimoto-Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Munc13-like+protein+in+Arabidopsis+mediates+H%2B-ATPase+translocation+that+is+essential+for+stomatal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses.</a> Nat. Commun. 4, 2215(2013).</li>
<li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+wall+of+the+Arabidopsis+pollen+tube-spatial+distribution%2C+recycling%2C+and+network+formation+of+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides.</a> Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).</li>
<li>Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+and+4-kinase+have+distinct+roles+in+intracellular+trafficking+of+cellulose+synthase+complexes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).</li>
<li>Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+PIP2%3B+1+dynamics+and+partitioning+reveals+multiple+modes+of+Arabidopsis+plasma+membrane+aquaporin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation.</a> Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).</li>
<li>Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+microdomain-associated+protein%2C+Arabidopsis+Flot1%2C+is+involved+in+a+clathrin-independent+endocytic+pathway+and+is+required+for+seedling+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development.</a> Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).</li>
<li>Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament+dynamics+are+dominated+by+rapid+growth+and+severing+activity+in+the+Arabidopsis+cortical+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array.</a> J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).</li>
<li>Ueda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+endoplasmic+reticulum+motility+and+F-actin+organization+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).</li>
</ol>

Yazar ifşa ilgisi yoktur.

Bu video makalede, protokoller izlenmesi ve Arabidopsis thaliana&#39;nın stoma kompleksi üzerine GFP-PATROL1 noktaların dinamik davranışını ölçmek için verilmiştir. Burada gösterildiği gibi, VAEM gözlem bitki hücre yüzeylerinin canlı görüntüleme için güçlü bir araçtır. Son derece hassas EM CCD VAEM optik bir nispeten zayıf uyarım lazer kullanımına izin verir, çünkü GFP PATROL1 izlenmesi için kullanılan deney koşulları altında, bir video yakalama 1 dakika için kullanılan numune çok az floresan ışıkla ağartma var...

Plazma zarı ve hemen bitişiğindeki sitoplazma da dahil olmak üzere bitki hücresi yüzeyi, bir bitki hücresinin hücre dışı ortamdan gelen biyotik ve abiyotik ipuçlarını algılamasının ve entegrasyonunun ana bölgesidir. Bu ipuçlarına yanıt olarak, plazma zarı proteinleri ve kortikal hücre iskeleti dahil olmak üzere hücre yüzeyi bileşenleri, saniyeler ila1-4 dakika arasında bir zaman ölçeğinde dinamik değişikliklere uğrar. Bu nedenle, hücre yüzeyindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı ve yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi, bir bitkinin moleküler düzeyde çevresel ipuçlarına verdiği tepkileri aydınlatabilir.
Konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan etiketli protein lokalizasyonunun belirlenmesi için güçlü bir araçtır3, ancak nispeten uzun yakalama süreleri nedeniyle gerçek zamanlı protein dinamiklerini izlemek genellikle zordur. Bitki hücresindeki proteinlerin gerçek zamanlı izlenmesi için ortaya çıkan bir teknik, genellikle toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için kullanılan ekipmanın bir uyarlaması olan değişken açılı epifloresan mikroskobudur (VAEM). TIRF mikroskobunda, floresan uyarma ışık kaynağı, lazerin giriş açısı, cam-su arayüzündeki ışığı tamamen dahili olarak yansıtacak kadar sığ olduğunda üretilen geçici bir ışık alanıdır. Buharlaşan ışık alanının penetrasyon derinliği yaklaşık 100 nm'dir. TIRF mikroskobu, hayvan hücrelerinde ekzositozun tespiti gibi tek moleküllü görüntüleme için olağanüstü bir araçtır5. Bununla birlikte, buharlaşan ışık, bitki hücrelerinde plazma zarlarına veya kortikal sitoplazmaya ulaşamaz, çünkü kalın hücre duvarlarına sahiptirler. Son zamanlarda, TIRF mikroskobu ekipmanı, bitki hücresi biyologları tarafından uyarlanmış ve bir lazerin, toplam iç yansıma fenomenini indüklemek için kullanıldığından biraz daha derin açılı olması durumunda, bitki hücresi örneklerinin yüzeyini uyarabileceğini ve bunun da yüksek kaliteli bitki hücresi görüntülemesi ile sonuçlanabileceğini gözlemlemiştir6,7. Uyarma aydınlatma derinliği, lazerin giriş açısı ayarlanarak değiştirilir; bu nedenle bu teknik VAEM olarak nitelendirilmektedir. Bu optik sistem aynı zamanda değişken açılı TIRF mikroskobu (VA-TIRFM) olarak da adlandırılır, çünkü hücre duvarı-periplazma arayüzünde7 toplam yansıma meydana gelme olasılığı vardır, ancak bu makalede VAEM terimi kullanılmıştır, bitkilerdeki ilk rapora göre6.
Bu protokolün amacı, bitki hücresi yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamiklerini görselleştirmek için VAEM kullanmak için pratik prosedürleri göstermektir. Ek olarak, VAEM film analizi için moleküllerin kalma süresini (mevcudiyet süresini) ölçmek için bir görüntü analiz protokolü açıklanmıştır. Örnek olarak Arabidopsis thaliana kotiledonlarında stoma kompleksi hücreleri üzerinde GFP-PATROL1 nokta yanıp sönmesi kullanılmıştır. PATROL1, ileri genetik yaklaşımlarla A. thaliana8'de bir stoma yanıt defekti mutantının nedensel geni olarak tanımlandı. PATROL1, sinaps vezikül ekzositozu8'de bir astar faktörü olan MUNC-13'ün bir bitki homologudur. Işık veya nem gibi çevresel ipuçlarına yanıt olarak, PATROL1'un bir proton pompasının stoma kompleksindeki plazma zarlarına verilmesini geri dönüşümlü olarak düzenlediği düşünülmektedir. Stoma komplekslerinin her biri bir çift koruyucu hücre8 ve yardımcı hücre9 içerir ve stoma hareketi için bir proton pompası gerektirirler. Bu hücrelerde, GFP etiketli PATROL1, plazma zarı üzerinde 1 dakikadan daha az kalan nokta benzeri yapılaralokalize olur 9.

<table><tbody><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>TIRF ünitesi</td><td>Olympus</td><td>IX3-RFAEVAW</td><td></td></tr><tr><td>TIRF objektif lensi&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100 ve zamanları; OTIRF&nbsp;</td><td>NA = 1.49</td></tr><tr><td>Lazer açı kontrol kutusu</td><td>Chuo Seiki</td><td>QT-AK</td><td></td></tr><tr><td>Optik olarak pompalanan yarı iletken lazer</td><td>Tutarlı</td><td>Safir TM LP USB 488-20 CDRH Lazer</td><td></td></tr><tr><td>510 &ndash; 550 nm bant geçiren filtre</td><td>Olympus</td><td>U-FBNA</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ImagEM C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>C-mount kamera büyütme değiştirme ünitesi&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MetaMorph sürüm 7.7.11.0</td><td></td></tr><tr><td>TIRF mikroskopi kılavuzu</td><td>Olympus</td><td>AX7385</td><td>Talimatlar: Toplam İç Yansıma Aydınlatma Sistemi (24 Ağustos 2012'de Japonya'da basılmıştır)</td></tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>Olympus</td><td>Daldırma Yağı Typr-F</td><td>ne = 1.518 (23 derece)</td></tr></tbody></table>

değişken açılı epifloresans mikroskopi ile bitki hücre yüzey dynamics gerçek zamanlı görüntüleme

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Bir bitkinin hücre yüzeyi, çevresel ipuçlarını algılamak için kullandığı arayüzdür; zar trafiği ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi gibi hücre biyolojik değişiklikleriyle yanıt verir. Bu tür hücre içi olayların gerçek zamanlı ve yüksek çözünürlüklü görüntü analizi, bitki hücre biyolojisinin moleküler düzeyde anlaşılmasını artıracaktır. Değişken açılı epifloresan mikroskobu (VAEM), bitki hücresi yüzeyindeki floresan etiketli proteinlerin yüksek kaliteli, hızlandırılmış görüntülerini sağlayan yeni bir tekniktir. Bu makalede, VAEM numune hazırlama, VAEM optik sisteminin ayarlanması, film yakalama ve görüntü analizi için pratik prosedürler açıklanmaktadır. VAEM gözlemine bir örnek olarak, PATROL1 dinamikleri hakkında temsili sonuçlar sunulmaktadır. Bu, Arabidopsis thaliana'nın stoma kompleksindeki plazma zarlarına proton pompası verilmesinde rol oynadığı düşünülen stoma hareketi için gerekli bir proteindir. A. thaliana kotiledonlarındaki koruyucu hücrelerin ve yardımcı hücrelerin VAEM gerçek zamanlı gözlemi, floresan etiketli PATROL1 birkaç saniye boyunca plazma zarları üzerinde nokta benzeri yapılar olarak göründüğünü ve daha sonra kaybolduğunu gösterdi. VAEM film verilerinin Kymograph analizi, nokta benzeri yapıların varlığının zaman dağılımını ('kalma süresi' olarak adlandırılır) belirledi. VAEM'in kullanımı bu örnek bağlamında ele alınmıştır.

Bu video makalede, A. GFP-PATROL1 ve VAEM gözlem için protokollerde yer thaliana kotiledon stoma karmaşık hücrelerin sağlanmaktadır. Gökyüzü açılan montaj A. VAEM hazırlıkları hava kabarcıklarının oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir basit bir hazırlık yöntemi thaliana kotiledonları (Şekil 1). Giriş lazer ve / veya VAEM için numunelerin z-konumlandırma Overtilting belirsiz bir görüntü sağlayacaktır. Eğer bu gerçekleşirse, bu Epifloresans aydınlatma tarafından değerle...

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Bu prosedürün genel amacı, değişken açılı epi floresans mikroskopisi ile bitki hücresi yüzeylerindeki floresan işaretli proteinlerin hareketini gözlemlemektir. Bu yöntem, proteinlerin bitki hücresi yüzeylerinde nasıl çalıştığı gibi konularda bitki hücre biyolojisi alanında ilerlememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan işaretli proteinlerin gerçek zamanlı dinamiklerini görselleştirmemize olanak tanımasıdır. Prosedüre başlamadan önce.Mikroskobun lazer merkezlemesini ve odaklamasını üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Ardından, mikroskopi odası tavanının merkezini belirlemek için objektif mercekten gelen serbest ışık yolunu kullanın ve bu konumu renkli bir mühürle işaretleyin. Sonrasında, tavanı bir objektif mercek ile aydınlatın ve aydınlatılan bölgeyi merkez konuma taşıyın.Ardından lazeri odaklayın ve lazerin konumunu tavanın merkezine göre hassas bir şekilde ayarlayın. Lazerin merkezlenmesi ve odaklanması, başarılı değişken açılı epi-floresan mikroskop veya VAEM gözlemi için çok önemlidir. Kullanıcılar, bir deneye başlamadan önce mikroskop şirketinden profesyonel bir personel tarafından eğitilmelidir.Mikroskop hazır olduğunda, 76 by 26 milimetrelik bi

real-time-imaging-plant-cell-surface-dynamics-with-variable-angle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Bu protokol, ışık tabakası mikroskobu için bir bitki örneği hazırlama yöntemini gösterir. Kurulum, bitkinin bir jelin yüzeyine dikey olarak monte edilmesi ve kontrollü parlak koşullarda büyümesine izin verilmesiyle karakterize edilir. Bu, standartlaştırılmış koşullarda bitki organ gelişiminin uzun süreli gözlemlenmesini sağlar.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Bu makale, canlı yosun dokusunun 3 boyutlu hücre duvarı dinamiklerini görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunarak, ggb mutantlarında hücre duvarlarının ayrılmasının görselleştirilmesine ve uzun bir süre boyunca gelişim sırasında vahşi tipte hücre duvarı desenlerinin kalınlaştırılmasına izin vermektedir.

Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Öğrenin, değişken açılı epifloresans mikroskopi ile Arabidopsis thaliana bitki hücrelerinde GFP etiketli PATROL1 protein dinamiklerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, zar trafik proteinlerinin davranışını incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet