Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme
12 Aralık 2015
Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.
Bu prosedürün genel amacı, floresan etiketli proteinlerin bitki hücre yüzeyleri üzerindeki hareketini değişken açılı epi floresan mikroskobu ile gözlemlemektir. Bu damar, proteinin plaka hücre yüzeylerinde nasıl çalıştığı gibi bitki hücre biyolojisi alanında ilerlememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, işleme başlamadan önce floresan atak proteinlerinin gerçek zamanlı dinamiklerini görselleştirmemize izin
vermesidir.Mikroskobun lazer merkezlemesini ve odaklanmasını üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Ardından, mikroskopi odası tavanının merkezini bulmak için objektif lenssiz bir ışık yolu kullanın ve konumu renkli bir conta ile işaretleyin. Ardından, tavanı objektif bir mercekle aydınlatın ve aydınlatılan bölgeyi orta konuma getirin.
Ardından lazeri odaklayın ve lazerin konumunu tavanın ortasına göre ince ayarlayın. Lazerin merkezlenmesi ve odaklanması, başarılı değişken açılı epi koku mikroskobu veya VAEM gözlemi için çok önemlidir. Kullanıcılar, bir deneye başlamadan önce mikroskop şirketinden profesyonel bir personel tarafından eğitilmelidir.
Mikroskop hazır olduğunda, 76 x 26 milimetrelik bir cam slaytın ortasına 30 mikrolitre bazal tampon dağıtın. Ardından, yedi günlük bir fideden bir co leadin'i çıkarmak için diseksiyon makası kullanın ve co leadin'i gözlem tarafı yukarı bakacak şekilde bazal tampon damlası üzerinde yüzdürün. Daha sonra, 18 x 18 milimetrenin merkezine 30 mikrolitre bazal tampon ekleyin.
Camı örtün ve kapak camını ters çevirin. Nazikçe yüzey gerilimi, kapak camını bir kenarında cımbızla tutarak damlanın düşmesini önleyecektir. Karşı kenarı, tampon ortak girişin üzerinde olacak şekilde cam sürgünün üzerine yerleştirin.
Ardından kapak camının kenarını slayt üzerinde tutun. Damlanın konumunu, doğrudan olein numunesinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın ve kapak camını bırakın. Hava kabarcığı yoksa, fazla tamponu silmek için tüy bırakmayan mendiller kullanın ve preparatı hemen mikroskoba aktarın.
Parlak alan aydınlatmasını kullanarak, gözlem için hücreleri seçin. Ardından, floresan proteinin gözlemlenebildiğini onaylayın ve hücre yüzeyindeki Z ekseni konumunu ayarlamak için epi floresan aydınlatmasını kullanın. VAEM gerçekleştirmek için, lazer ışınının giriş açısını eğmek için kontrol kutusunu kullanın.
Canlı görüntüyü dikkatlice izlerken yavaş yavaş. Başlangıçta, görüntü bulanık görünecektir. Lazer açısı arttıkça, VAEM görüntüsü daha az bulanık hale gelecek ve sonunda net bir görüntü üretecektir.
Bu noktada, lazer açısını artırmayı bırakın. Şimdi iyi. Daha iyi bir görüntü elde etmek için lazer giriş açısını ayarlayın, optik ve görüntü sensörü parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
Daha sonra ticari mikroskop yazılımını kullanarak, çok sayfalı bir TIFF görüntü dosyası olarak bir film elde edin. Burada film, STA model hücrelerinin yüzeyinde yanıp sönen GFP etiketli noktaları gösteriyor. Fiji kullanarak GFP etiketli DOT kalış süresini ölçmek için dosya açma menüsüne gidin ve alınan çok sayfalı bahşiş dosyasını açın.
İlgilenilen tarafa bir çizgi yerleştirmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Ardından, bir grafik görüntüsü oluşturmak için görüntü yığınları dinamik çözünürlük dilimi eklentisini kullanın. Çizgi değiştikçe, grafik görüntüsü dinamik olarak değişecektir.
Görüntüyü dosyanın altında bir TIFF dosyası olarak kaydedin, tiff olarak kaydet menüsünde. Ardından gürültü azaltma işlemi gerçekleştirmek için işlem filtreleri Gauss bulanıklığı menüsüne gidin ve kronograf görüntülerine bir Gauss filtresi uygulayın. Sigma yarıçapı parametresi gerektiği gibi ayarlanmalıdır.
Görüntü ayarlama eşiği aracını kullanarak, sinyal bölgelerini eşikleyerek bölümlere ayırın ve ayar ölçümlerini analiz et menüsünü açın. Ardından, mümkün olan en az piksel sayısını seçerek ayar ölçüleri penceresindeki sınırlayıcı dikdörtgeni kontrol edin. Ardından analiz altında, parçacıkları analiz et menüsü bulunur.
İlgilenilen noktanın Y eksenine karşı zamanını ölçün ve veri değerlerini görüntülemek için görüntüleme sonuçlarını ve yönetici kutularına eklemeyi kontrol edin. Son olarak, sonuç tablosu menüsü altında, dosyayı seçin, farklı kaydedin ve uygun analiz yazılımını kullanarak nokta görüntü sürelerinin veri kümesini işleyin. Burada, 185 GFP devriyesinin sekizinci sırada yer alan 12 bağımsız yardımcı hücreden bir nokta ile chm grafiği analizi ile ölçülen kalma süreleri grafikte gösterildiği gibi gösterilmiştir.
Takılan yoğunluk işlevi, GFP devriyesi bir noktanın çoğunun, yaklaşık 3,5 saniyelik bir tepe noktası ile iki ila 10 saniye arasında bir yan hücrede yerleşik olduğunu ortaya koydu. Bu, ikincil hücre yüzeyindeki proton pompalarının hızlı bir ekzositoz endositozunu önerir. Bu videoyu çalıştıktan sonra, değişken açılı epi floresan mikroskobu kullanarak bitki hücre yüzeyindeki ary tipi protein dinamiklerini nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, değişken açılı epifloresan mikroskopi kullanarak bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamiklerinin izlenmesini göstermektedir. Bu teknik, Arabidopsis thaliana'nın stomatal kompleksinin hücre korteksinde membran trafiği proteini olan GFP etiketli PATROL1'in yanıp sönen noktalarını görselleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
- Protein Dinamiği
Arka Plan
- Bitki hücre yüzeylerinde protein hareketini anlamak, bitki biyolojisi için çok önemlidir.
- Floresan etiketleme, protein dinamiklerinin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
- Değişken açılı epifloresan mikroskopi, görselleştirme yeteneklerini artırır.
- Arabidopsis thaliana, bitki çalışmaları için bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Membrana trafiği proteinlerinin dinamiklerini gözlemlemek.
- Hücre yüzeylerinde protein davranışı çalışma tekniklerini geliştirmek.
- Bitki hücre biyolojisinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Mikroskobun lazer merkezlenmesi ve odaklanması kalibasyonu.
- İlk kurulum için objektif lens serbest ışık yolunun kullanılması.
- Mikroskopi odasının tavanının merkezi belirlemek için aydınlatılması.
- Bitki hücrelerinde GFP etiketli proteinlerin gerçek zamanlı görüntülenmesi.
Ana Sonuçlar
- GFP etiketli PATROL1 dinamiklerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Tekniğin gerçek zamanlı görüntülemede etkinliğinin gösterilmesi.
- Bitki hücrelerinde membran trafiği süreçleri hakkında bilgiler.
- Bitki hücre biyolojisi üzerinde gelecekteki çalışmalar için bir protokolün oluşturulması.
Sonuçlar
- Protokol, protein dinamiklerini incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Değişken açılı epifloresan mikroskopi, bitki biyolojisi için değerli bir araçtır.
- Bulgular, membran trafiği hakkında daha geniş bir anlayışa katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Variable-angle epifluorescence microscopy (VAEM) enables real-time, high-resolution imaging of protein dynamics at the plant cell surface, providing critical insights into membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for understanding protein localization and trafficking relevant to plant biotechnology and synthetic biology. Integrating VAEM-derived quantitative data strengthens target validation and informs translational research decisions across R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein trafficking and localization at the cell surface.
- Supports functional validation of candidate proteins involved in membrane dynamics.
- Provides quantitative residence time data for mechanistic de-risking.
- Facilitates hypothesis testing regarding protein function in cellular signaling.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging workflows for quantifying protein dynamics in live cells.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting membrane trafficking.
- Enables high-content imaging approaches for compound evaluation in plant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein trafficking data with disease-relevant or stress-response pathways in plant models.
- Provides continuity from molecular discovery to phenotypic characterization in engineered plants.
- Informs risk-adjusted advancement of synthetic biology constructs or trait engineering strategies.
- Supports translational biomarker identification through quantitative imaging outputs.
Pipeline & Workflow Integration
VAEM imaging is positioned at the interface of early discovery and assay development, enabling hypothesis-driven interrogation of protein dynamics and supporting quantitative analytics for downstream translational research.
- Discovery Biology: Facilitates real-time hypothesis testing and pathway clarification for membrane-associated proteins.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and comparative studies.
- Analytics: Generates residence time and dynamic localization data to support statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Bridges molecular findings to phenotypic outcomes in engineered or stress-responsive plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform adaptable across diverse plant models and protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein trafficking studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and constructs for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to calibrated VAEM instrumentation and compatible imaging software.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different plant species or protein targets.
- Image quality and quantitative accuracy depend on precise laser alignment and sample handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Cotyledon specimen Sky Drop Mounting
2:35
Variable-angle Epifluorescence Microscopy (VAEM) Observation and Movie Acquisition
3:42
GFP-labeled Dot Residence Time Quantification by Kymograph Analysis
5:19
Results: Representative GFP-PATROL1 Dot Residence Time Analysis by Kymography
6:02
Conclusion
