Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, değişken açılı epi floresans mikroskopisi ile bitki hücresi yüzeylerindeki floresan işaretli proteinlerin hareketini gözlemlemektir. Bu yöntem, proteinlerin bitki hücresi yüzeylerinde nasıl çalıştığı gibi konularda bitki hücre biyolojisi alanında ilerlememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan işaretli proteinlerin gerçek zamanlı dinamiklerini görselleştirmemize olanak tanımasıdır. Prosedüre başlamadan önce.

Mikroskobun lazer merkezlemesini ve odaklamasını üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Ardından, mikroskopi odası tavanının merkezini belirlemek için objektif mercekten gelen serbest ışık yolunu kullanın ve bu konumu renkli bir mühürle işaretleyin. Sonrasında, tavanı bir objektif mercek ile aydınlatın ve aydınlatılan bölgeyi merkez konuma taşıyın.

Ardından lazeri odaklayın ve lazerin konumunu tavanın merkezine göre hassas bir şekilde ayarlayın. Lazerin merkezlenmesi ve odaklanması, başarılı değişken açılı epi-floresan mikroskop veya VAEM gözlemi için çok önemlidir. Kullanıcılar, bir deneye başlamadan önce mikroskop şirketinden profesyonel bir personel tarafından eğitilmelidir.

Mikroskop hazır olduğunda, 76 by 26 milimetrelik bir cam lama 30 µL bazal tampon damlatın. Ardından, yedi günlük bir fidandan bir kotiledonu çıkarmak için diseksiyon makası kullanın ve kotiledonu, gözlem tarafı yukarı bakacak şekilde bazal tampon damlası üzerine yerleştirin. Daha sonra, 18 by 18 milimetrelik bir lamın merkezine 30 µL bazal tampon ekleyin.

Lamelle kapatın ve lamelli ters çevirin. Cımbızla lamellin bir kenarından tutun; yüzey gerilimi damlanın düşmesini hafifçe önleyecektir. Tampon çözeltinin giriş kısmının üzerine gelmesi için lamellin karşı kenarını cam lama yerleştirin.

Ardından, lamelin kenarını lam üzerinde tutun. Damlanın konumunu, doğrudan olein örneğinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın ve lameli kapatın. Hava kabarcığı yoksa, fazla tampon çözeltiyi silmek için tüy bırakmayan mendiller kullanın ve preparatı hemen mikroskoba aktarın.

Aydınlık alan aydınlatmasını kullanarak gözlem yapılacak hücreleri seçin. Ardından, floresan proteinin gözlemlenebildiğini doğrulayın ve hücre yüzeyindeki Z ekseni konumunu ayarlamak için epi-floresan aydınlatmayı kullanın. VAEM gerçekleştirmek için lazer ışınının giriş açısını eğmek üzere kontrol kutusunu kullanın.

Canlı görüntü dikkatle izlenirken kademeli olarak gerçekleştirin. Başlangıçta görüntü bulanık görünecektir. Lazer açısı arttıkça, VAEM görüntüsü daha az bulanıklaşacak ve sonunda net bir görüntü oluşacaktır.

Bu noktada, lazer açısını artırmayı bırakın. Şimdi, gerektiğinde optik ve görüntü sensörü parametrelerini ayarlayarak daha iyi bir görüntü elde etmek için lazer giriş açısını hassas bir şekilde ayarlayın.

Ardından, ticari mikroskop yazılımını kullanarak görüntüyü çok sayfalı bir TIFF görüntü dosyası şeklinde kaydedin. Buradaki video, STA model hücrelerinin yüzeyinde yanıp sönen GFP etiketli noktaları göstermektedir. Fiji kullanarak GFP etiketli DOT kalış süresini nicelleştirmek için dosya açma menüsüne gidin ve kaydedilen çok sayfalı TIFF dosyasını açın.

İlgilenilen bölgeye bir çizgi yerleştirmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Ardından, bir grafik görüntüsü oluşturmak için image stacks dynamic res slice eklentisini kullanın. Çizgi değiştikçe, grafik görüntüsü de dinamik olarak değişecektir.

Görüntüyü dosya, farklı kaydet tiff menüsü altından bir TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından gürültü azaltma işlemi gerçekleştirmek için işlem filtreleri Gaussian bulanıklığı menüsüne gidin ve kronograf görüntülerine bir Gaussian filtresi uygulayın. Sigma yarıçapı parametresi gerektiği şekilde ayarlanmalıdır.

Görüntü eşik değerini ayarlama aracını kullanarak, eşikleme yoluyla sinyal bölgelerini segmente edin ve ölçüm setini analiz et menüsünü açın. Ardından, ölçüm setini ayarla penceresinde, mümkün olan en düşük piksel sayısını seçerek sınırlayıcı dikdörtgeni işaretleyin. Daha sonra analiz menüsü altındaki parçacıkları analiz sekmesine gidin.

İlgilenilen noktanın süresini Y eksenine göre ölçün, görüntüleme sonuçlarını kontrol edin ve veri değerlerini görüntülemek için yönetici kutularına ekleyin. Son olarak, sonuçlar tablosu menüsü altında "dosya" ve "farklı kaydet" seçeneklerini belirleyerek nokta görüntüsü süreleri veri setini uygun analiz yazılımını kullanarak işleyin. Burada, chm grafik analizi ile ölçülen, sekiz edin'deki 12 bağımsız yardımcı hücreden gelen 185 GFP patrol one noktasının kalış süreleri grafikte gösterildiği şekilde sunulmuştur.

Uydurulmuş yoğunluk fonksiyonu, GFP patrol one noktalarının çoğunun yardımcı hücrede 2 ile 10 saniye arasında kaldığını ve zirvenin yaklaşık 3,5 saniyede olduğunu ortaya koymuştur. Bu durum, yardımcı hücre yüzeyindeki proton pompalarının hızlı bir ekzositoz endositoz döngüsünde olduğunu göstermektedir. Bu videoyu tamamladıktan sonra, değişken açılı epi-floresan mikroskopi kullanarak bitki hücre yüzeyindeki herhangi bir protein dinamiğinin nasıl görselleştirileceği ve nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.