Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama

Bu prosedürün genel amacı, yetkin ektodermde bir yanıt oluşturabilen gen ürünlerinin tanımlanmasına uygun bir hayvan başı sistemi olan Xenopus oositini göstermektir. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, indüktif bir yanıtı tetiklemek için hangi genlerin gerekli olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef bir doku üzerinde etkili olan indükleyicileri veya hatta indükleyicilerinle yukarı akışta etkili olan genleri üretmek ve tanımlamak için bir ekspresyon sistemi olarak Xenopus oositinin kullanılmasıdır.

Diseksiyon ve rekombinasyon aşamaları yüksek düzeyde evre bağımlı olduğundan ve rafine bir teknik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi oldukça faydalıdır. Anestezize edilmiş dişi kurbağalardan yumurtalık dokusu toplandıktan sonra, dokuyu her biri yaklaşık 10 ila 20 oosit içeren küçük parçalara ayırın. Bu fragmanları önce taze OR2-solüsyonuna, ardından 2,0 mg/mL collagenase A içeren OR2-solüsyonuna aktarın. Dokuyu içeren karışımı bir çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca hafifçe ajite ederek işleme devam edin.

Ardından fragmanları taze kollagenaz solüsyonuna aktarın ve bir saat daha çalkalayın. Bu işlemin sonunda defloküle olmuş oositlerin gözlenmesi beklenir. Oositleri 10 kez tam OR2 ile ve ardından iki kez OCM olarak kısaltılan oosit kültür ortamı ile yıkayarak devam edin.

Ardından, oositleri taze OCM içerisine yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobu altında görsel olarak inceleyin. Daha küçük ve immatür oositleri ayıklayarak altıncı evredeki oositleri izole edin. Daha sonra, oositleri OCM içeren agaroz kaplı bir Petri kabına yerleştirin ve enjeksiyona kadar 18 ila 20 °C'de muhafaza edin.

Mikroenjeksiyon hazırlığı için, cam kılcal tüpleri bir iğne çekiciye yerleştirin, çekme işlemini gerçekleştirin ve ardından yaklaşık 20 mikrometre çapında iğneler oluşturmak için cam uçları kırın. Bir bileşik mikroskopta, iğne uçlarını kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ile ölçün. Ardından, bir 35 by 10 milimetrelik Petri kabının tabanına kili düzgün bir tabaka halinde yayın.

Ardından, küçük bir prob benzeri alet kullanarak bu katmanda paralel oluklar oluşturun. Kil kaplı çanağı, 1x modifiye Barth salini (MBS) içinde yaklaşık 2 mililitre %3 Ficoll ile doldurun. Daha sonra oositleri, geniş ağızlı bir pipet kullanarak buraya aktarın.

Oositleri, sonraki mikroenjeksiyon sırasında sabit kalacak şekilde oluklara yerleştirin. Bir mikroenjektör kullanarak, bir iğneyi önceden hazırlanmış mRNA havuzundan yaklaşık iki mikrolitre ile doldurun ve enjeksiyon sırasında oosit sitoplazmasının iğneye çekilmesini önlemek için hafif bir pozitif basınç oluşturacak şekilde dengeyi ayarlayın. Ardından, her bir oositin ekvatoral bölgesine 20 nanolitre RNA enjekte edin.

Ardından, oositleri bir saat boyunca Ficoll MBS içinde bekletin ve daha sonra nazikçe 1x MBS'ye aktarın. Oositleri 20 °C'de sekiz ila 24 saat boyunca inkübe etmeye devam edin. Animal cap analizine başlamak için NAM çözelti olarak kısaltılan 3/4x normal amfibi ortamı, ince penset, bir saç döngüsü (hairloop), önceden enjekte edilmiş oositler ve evre 11 ila 11.5'teki Xenopus embriyolarını hazırlayın.

Ardından, cam lamelleri yaklaşık bir milimetre çarpı iki milimetre boyutlarında parçalara ayırın ve kenarları cilalanıp eriyene kadar bu parçaları alevden geçirin. Daha sonra, önceden açıklandığı gibi, bir kap içerisine kili tek bir tabaka halinde bastırın. Bu kaplamanın üzerinde tekil çanak şeklinde izler oluşturmak için küçük bir prob kullanın.

Kabın içerisine yaklaşık iki mililitre 3/4x NAM ekleyin. Ardından, enjekte edilen oositleri, her biri tek bir çukura sabitlenecek şekilde yerleştirerek aktarın. Embriyoları hazırlamak için onları 3/4x NAM solüsyonu içeren bir kaba aktarın.

Ektodermin yaşını belirlemek için evreleme kontrolleri olarak kullanılacak bir grup gastrula seçin ve bunları aynı çözeltiyi içeren başka bir kaba aktarın. Bu plakayı kenara ayırın. Hayvan başlığı deneyi için kullanılacak embriyoların vitellin membranlarını iki çift ince forseps yardımıyla çıkarın.

Ardından, gastrula'yı oositlerin bulunduğu kil kaplı kaba aktarın. Başlangıç olarak, ekvatoriyel dokuya zarar vermemeye dikkat ederek, iki çift ince pens yardımıyla embriyolardan animal kapları kesin. İlk yöntemi kullanarak rekombinantlar oluşturmak için, bir animal kapı, iç yüzeyi önceden bir oyuğa yerleştirilmiş olan bir oositin animal hemisferine temas edecek şekilde konumlandırın.

Ve bu işlemi enjekte edilen birkaç oosit için tekrarlayın. Bu rekombinantların bir arada tutulduğundan emin olmak için, her birinin üzerine kavisli bir cam lamel parçası yerleştirin ve hayvan düzleşene ve lamel kile temas edene kadar aşağı doğru baskı uygulayın. İkinci yöntemi kullanarak rekombinantlar üretmek için, hayvan başlıklarını (animal caps) ve oositleri kil içindeki boş bireysel çukurlara birlikte yerleştirin.

Hayvan kalınçlarının iç yüzeylerinin oositlere dönük olduğundan emin olun. Ardından, iki dokuyu küçük kil parçaları kullanarak birbirine sabitleyin. Her iki yöntemle de birden fazla rekombinant oluşturulduktan sonra, bunları ve kenara ayrılan kontrol embriyolarını 20 °C'de kültüre alın.

Kontrol embriyoları istenen evreye ulaştığında, rekombinanlardan lamelleri kaldırın ve bir pens ile saç döngüsü kullanarak hayvan başlığı ektodermini izole edin. Hem ektodermal fragmanları hem de kontrol embriyolarını bir saat boyunca MEMFA içinde sabitleme işlemine geçin. Ardından bunları etanola aktarın ve bu dokuyu -20 °C'de saklayın.

Burada, oosit setlerine giderek azalan sayıdaki klon veya koloniye karşılık gelen mRNA havuzları enjekte edilmiş ve ardından animal cap'ler ile kültüre edilmiştir. Sonrasında, erken nöral plaka aşamalarından vezikül oluşumuna kadar varsayılan lens ektoderminde normalde gözlemlenen ve burada lens indükleme kapasitesini değerlendirmek için kullanılan bir belirteç olan foxe3'ü eksprese eden animal cap sayısının her bir set için belirlenmiştir. Bu yöntem, değerlendirilen animal cap'lerin 179'da 50'sinde veya %28'inde lens indükleyici bir yanıt oluşturabilen ldb1 nükleer faktör kodlayan geni tanımlamıştır.

Burada gösterilen, yaklaşık evre 11'den evre 23'e kadar ldb1 enjekte edilmiş oositlerle kültüre edilen hayvan şapkalarındaki foxe3 sinyalini (ok başları ile belirtilmiştir) betimleyen in situ hibridizasyon görüntülerimiz görülmektedir. Enjekte edilmemiş oositlerin üzerine yerleştirilen karşılık gelen kontrol hayvan şapkalarında herhangi bir foxe3 ekspresyonu gözlenmemiştir. Bu hayvan şapkalarından kesitler alındığında, foxe3 ekspresyonu hem iç hem de dış ektodermal tabakalarda gözlenmiştir.

İç tabakadaki ekspresyon, lens yanıtının karakteristik bir özelliğidir. Ya da her iki tabakada sinyal verilmesi, olfaktör plakod gibi diğer yapıların göstergesidir. Bu prosedürün ardından, hayvan başlığı ektodermindeki indüktif bir yanıtı değerlendirmek amacıyla immünohistokimya, in situ hibridizasyon veya floresan bir raporör genin doğrudan saptanması gibi yöntemler uygulanabilir.