Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama Xenopus Oosit ekspresyon sistemi

Bu prosedürün genel amacı, yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen gen ürünlerinin tanımlanması için uygun bir hayvan başlık sistemi olan bir Xenopus oositini göstermektir. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, tümevarımsal bir yanıtı yasadışı hale getirmek için hangi genlerin gerekli olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir hedef dokuya etki eden indükleyicileri ve hatta indükleyicilerin akışına etki eden genleri üretmek ve tanımlamak için bir ekspresyon sistemi olarak Xenopus oositinin kullanılmasıdır.

Diseksiyon ve rekombinasyon adımları oldukça evreye bağımlı olduğundan ve rafine bir teknik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi son derece yararlıdır. Anestezi uygulanmış dişi kurbağalardan yumurtalık dokusu toplandıktan sonra, dokuyu her biri yaklaşık 10 ila 20 oosit içeren küçük parçalara ayırın. Ve bu parçaları, önce taze OR2 çözeltisine ve daha sonra mililitre başına 2.0 miligram OR2 içeren kollajenaz A'ya aktarın. Doku içeren karışımı bir çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak devam edin.

Daha sonra parçaları taze kollajenaz çözeltisine aktarın ve bir saat daha çalkalayın. Bu tedavinin sonunda defloküle oositleri gözlemlemeyi bekleyin. Oositleri tam OR2'de 10 kez ve daha sonra OCM olarak kısaltılan oosit kültürü ortamında iki kez yıkamaya devam edin.

Daha sonra, oositleri taze OCM'ye yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobu altında görsel olarak inceleyin. Daha küçük, olgunlaşmamış oositleri atarak altıncı aşamada bunları izole edin. Daha sonra, oositleri OCM içeren agaroz kaplı bir Petri kabına yerleştirin ve enjeksiyona kadar 18 ila 20 santigrat derecede tutun.

Mikroenjeksiyona hazırlanmak için, cam kılcal boruyu bir iğne çektirmesine yerleştirin, çekin ve ardından yaklaşık 20 mikrometre çapında iğneler oluşturmak için camın uçlarını kırın. Bileşik bir mikroskopta, iğne uçlarını kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ile ölçün. Daha sonra, kili 35 x 10 milimetrelik bir Petri kabının altındaki düzgün bir katmana itin.

Ardından, alışveriş merkezi probu benzeri bir araç kullanarak bu katmanda paralel oluklar oluşturun. Kil kaplı tabağı 2x modifiye Barth'ın tuzlu suyunda veya MBS'de yaklaşık 3 mililitre% 1 Ficoll ile doldurun. Ardından, geniş delikli bir pipet kullanarak oositleri ona aktarın.

Oositleri, sonraki mikroenjeksiyon sırasında yerinde tutulacak şekilde korulara yerleştirin. Bir mikroenjektör kullanarak, bir iğneyi önceden oluşturulmuş bir mRNA havuzundan yaklaşık iki mikrolitre ile doldurun ve dengeyi, enjeksiyon sırasında oosit sitoplazmasının iğneye çekilmesini önleyecek hafif pozitif basınç üretecek şekilde ayarlayın. Ardından, ekvator bölgesindeki her oosit 20 nanolitre RNA ile enjekte edin.

Daha sonra, oositleri Ficoll MBS'de bir saat bekletin ve ardından yavaşça 1x MBS'ye aktarın. Oositleri 20 santigrat derecede sekiz ila 24 saat inkübe etmeye devam edin. Hayvan kapağı tahliline başlamak için, NAM çözeltisi olarak kısaltılan 3/4x normal amfibi ortamı, ince forseps, bir saç halkası, önceden enjekte edilmiş oositler ve evre 11 ila 11.5'te ksenopus embriyoları toplayın.

Daha sonra, cam kapağı yaklaşık bir milimetreye iki milimetre boyutlarında parçalara ayırın ve bu parçaları kenarları cilalanana ve çizilene kadar bir alevden geçirin. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi kili bir tabakta tek bir katmana bastırın. Ve bu kaplamada bireysel fincan şeklinde izlenimler oluşturmak için bir alışveriş merkezi probu kullanın.

Çanağı yaklaşık iki mililitre 3/4x NAM ile doldurmaya devam edin. Ve ona, enjekte edilen oositleri aktarın, her biri tek bir girintide hareketsiz hale getirilecek şekilde birkaç tane konumlandırın. Embriyoları hazırlamak için 3/4x NAM çözeltisi içeren bir kaba aktarın.

Ektodermin yaşı için evreleme kontrolleri olarak kullanılacak bir gastrula alt kümesi seçin ve bunları aynı çözeltiyi içeren başka bir tabağa aktarın. Ve bu tabağı bir kenara koyun. Hayvan şapkası assey'de kullanılacak embriyolar için, vitellin zarlarını iki çift ince forseps ile çıkarın.

Daha sonra gastrulayı oositlerle birlikte kil kaplı tabağa aktarın. Başlamak için, ekvator dokusundan kaçınmaya dikkat ederek iki çift ince foreceps kullanarak embriyolardan hayvan kapaklarını kesin. İlk yöntemi kullanarak rekombinantlar oluşturmak için, bir hayvan kapaklarını, iç yüzey, zaten bir girintide yerleştirilmiş olan bir oositin hayvan yarım küresine temas edecek şekilde konumlandırın.

Ve bu işlemi enjekte edilen oositlerin birkaçı için tekrarlayın. Bu rekombinantların bir arada tutulduğundan emin olmak için, her birinin üzerine kavisli bir cam lamel parçası yerleştirin ve hayvan düzleşene ve lamel kile temas edene kadar aşağı doğru basınç uygulayın. İkinci yöntemi kullanarak rekombinantlar oluşturmak için, hayvan kapaklarını ve oositleri kildeki boş bireysel girintilere birlikte yerleştirin.

Ve hayvan kapaklarının iç yüzeylerinin oosite baktığından emin olun. Ardından, küçük kil uzantıları kullanarak iki dokuyu birbirine sabitleyin. Her iki yöntem kullanılarak birden fazla rekombinant oluşturulduktan sonra, kültür ve bir kenara bırakılan kontrol embriyoları 20 santigrat derecede kontrol edin.

Kontrol embriyoları istenen aşamaya ulaştığında, lamelleri rekombinantlardan çıkarın ve forseps ve bir saç halkası kullanarak hayvan başlığı ektodermini izole edin. MEMFA'da hem ektodermal fragmanları hem de kontrol embriyolarını bir saat boyunca sabitlemeye devam edin. Ve bunları etanole aktarın ve bu dokuyu eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Burada, oosit setlerine, giderek daha az sayıda klon veya koloniye karşılık gelen mRNA havuzları enjekte edildi ve daha sonra hayvan kapakları ile kültürlendi. Daha sonra, erken nöral plaka aşamalarından vezikül oluşumuna kadar varsayımsal lens ektoderminde normal olarak gözlenen bir belirteç olan foxe3'ü ifade eden her setteki hayvan başlıklarının sayısı belirlendi ve burada lens indükleme kabiliyetini değerlendirmek için kullanıldı. Bu yöntem, 179 genin 50'sinde veya değerlendirilen hayvan kapaklarının %28'inde lens indükleyici bir yanıt üretebilen nükleer faktör kodlayan gen ldb1'de tanımlanmıştır.

Burada, kabaca evre 11'den evre 23'e kadar ldb1 enjekte edilmiş oositlerle kültürlenen hayvan kapaklarında, ok başlarıyla gösterilen tilki3 sinyalini gösteren yerinde hibridizasyon görüntülerimiz gösterilmektedir. Enjekte edilmemiş oositlere yerleştirilen karşılık gelen kontrol hayvanı kapaklarında foxe3 ekspresyonu gözlenmemiştir. Bu hayvan başlıklarından kesitler oluşturulduğunda, hem iç hem de dış ektodermal tabakalarda foxe3 ekspresyonu gözlendi.

İç katmandaki ifade, lens tepkisinin karakteristiğidir. Veya her iki katmanda da belirtildiği gibi, koku alma plakodu gibi diğer yapıların göstergesidir. Bu prosedürü takiben, hayvan başlığı ektoderminde indüktif bir yanıtı değerlendirmek için immünohistokimya, in situ hibridizasyon veya bir floresan raportör geninin doğrudan tespiti gibi yöntemler gerçekleştirilebilir.