Name: Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama Xenopus Oosit ekspresyon sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin Xenopus oosit ve hayvan kapağı sistemi kullanarak yetkin ektodermde yanıt oluşturan gen ürünlerini tanımlama yöntemini. Bu teknik gelişimsel biyolojide gen işlevlerini in vivo analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Shepherd University Foundation'dan C.Z.P.'ye verilen Mesleki Gelişim Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar, protokoller hakkındaki yararlı tartışmalar için Brett Zirkle ve Malia Deshotel'e ve cömert yardımları için Dr. Carol Hurney'e teşekkür etmek isterler.

Tüm deney prosedürleri Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Not: Şekil 1, deneysel prosedürler şematik görünümünü gösterir. Oosit hazırlanması 1. <ol><li> Ön asal X oosit izolasyon önceden Gebe Kısrak Serum Gonadotropin 150 U (PMSG) yaklaşık bir hafta ile kadın laevis. 29 G iğne ile 1 cc steril şırınga ile dorsal lenf kese içine 1 ml 150 U / ml PMSG enjekte edilir. </li><li> Oosit enjeksiyonu ve oosit-hayvan kap deneyi için çözümler hazırlayın. <ol><li> Ca Hazırlama ++ / Mg ++ içermeyen OR2 (OR2-): 82 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7.2. </li><li> OR2- artı 1 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2: ya da 2&#39;yi hazırlayın. </li><li> % 60 Leibovitz L15, 0.4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamisin, pH 7,8: OCM hazırlayın. </li><li> Ön1x MBS hazırlanması: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 mM 3 NaHCO. </li><li> 1x MBS% 3 Ficoll hazırlayın. </li><li> 1x NAM hazırlayın: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4 ile yıkanır. </li></ol></li><li> 0.1X MBS Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzunun% 0.03 çözeltisi (MS222) &#39;de kadın anestezisi için çözelti kurbağa yerleştirerek (ilk 10 ml% 95 etanol içinde 0.3 g MS222 çözülür, daha sonra 1 L, 0.1X MBS sulandırmak) 10-15 dakika veya tepkisiz kadar. <ol><li> Bu anestezi yanıt vermiyor sağlamak (eksik anestezi kurbağa uzuvları taşımak veya bedeni teslim) onun sırtına anestezi kurbağa çevirerek tam olup olmadığını kontrol edin. </li></ol></li><li> Cerrahi forseps ile yumurtalık dokusu izole bisturi cilt ve vücut duvarı boyunca abdominal insizyon yapılıp, yumurtalık fragmanlarını izoleve makas. OR2- içine yumurtalık parçaları yerleştirin. 24 mm&#39;lik kavisli iğne 3-0 ipek sütür ile vücut duvarı kapatın ve aynı sütür ile ayrı ayrı cilt kapatın. Su içinde 1 g / L akvaryum tuzu kadın kurtarma izin verir. </li><li> (- 20 oosit 10) adet ve taze OR2- transfer küçük içine ince forseps, gözyaşı yumurtalık dokusu kullanma. </li><li> 1 saat boyunca karıştırma cihazı üzerinde, hafifçe ajite taze kolajenaz geçiş ve bir saat daha çalkalayarak OR2- 2.0 mg / ml kollajenaz A Defolliculate yumurtalık fragmanları. </li><li> Yıkama küçük oosit atarak OR2 [Ca ++ / Mg ++ ihtiva eden] 10 kez, oositlerde. </li><li> OCM iki kez oosit yıkayın ve taze OCM transfer. Görsel inceleme üzerine boyutuna göre Evre VI oosit izole edin ve olgunlaşmamış (küçük) oosit atın: Sahne VI oositlerin hayvan yarımkürede bile pigmentasyon ile olgunlaşmamış oositlerin büyüktür ve çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm. </li><li> 20 ° C i - 18 oosit koruyunenjeksiyondan önce n OCM. Not: Agaroz kaplı petri kaplarına çanak oositlerin yapışmasını en aza indirmek için de kullanılabilir. </li></ol> Kütüphane Transkriptler 2. Enjeksiyon <ol><li> Gelişme uygun bir aşamada (örneğin, nöral plak aşaması 14 10) ekstre yönlü bir cDNA kütüphanesi 15 kullanarak, RNA yı hazırlamak. Bir cDNA kütüphanesi satın alın ya da aşağıda dört adımda genel başına bir ticari kit kullanılarak bir inşa. <ol><li> Poli (A) + RNA (Malzeme Tablo bakınız) için zenginleştirmek için bir ürünü kullanırken ve üreticinin yönergeleri izleyerek yaklaşık 5 ug mRNA izole edin. Not: transkript (istenilen doku mikrodiseksiyon sonra, nöral levha gibi) bir indükleme dokuya sınırlı olabilir cDNA kütüphanesini üretmek için kullanılır, ya da belirli bir aşamada bütün embriyolardan olabilir. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari kit ile cDNA üretin. </li><li> Bir Vecto içine cDNA ng, yaklaşık 20 Arterr ticari kit veya uygun başka bir vektör ile birlikte. Uygun bir plazmid vektörü mRNA stabilitesi gibi 5 &#39;β-globin ve 3 poli (A) sekansları (PCS2 +, pTnT, pCS105) için dizileri içerir. </li><li> Isı şok dönüşümü için tedarikçinin önerdiği protokol kullanılarak yetkili bakteri hücrelerine ligasyonu Transform. Not: Alternatif olarak, açık okuma çerçevesi (ORFeome) klonları koleksiyonu, ticari olarak mevcuttur ve enjeksiyon için transkriptleri oluşturmak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> 10 4 karmaşıklık (10 Nisan - 10 Mayıs toplam karmaşıklığı) 10 3 Plazmidlerin 10 havuzları hazırlayın. 10.000 kolonilerin her - Bu 1000 ile 10 plakaları temsil eder. <ol><li> 37 ˚C de 18 saat ve 7 ml LB bir cam dağıtıcı ile hafif basınç her gelen koloniler toplamak - Plaka kütüphane kültürü 10 15 cm LB-ampisilin plakalar üzerine, 12 büyüyecek </li><li> 0.5 ml bir gliserol stok hazırlayın (-20 &amp; 0.2 ml steril gliserol ve mağaza eklemek# 730 C) ve bir standart ile, üretici firmanın talimatlarına aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir DNA miniprep kiti DNA hazırlamak için, kalan 6.5 ml kullanılır. </li></ol></li><li> 1.5 saat - Enzim 1 için 37 ° C&#39;da 16 sindirimi, uygun kısıtlama - (2,0 ug 1,0) havuzlanmış plazmid DNA Linearize. Kullanılan RNA polimeraz kit özelliklerine göre su içinde etanol çökeltme ve yeniden süspansiyon haline getirildi, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile linearize DNA izole edin. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari RNA polimeraz kiti ile duyu RNA sentez. </li><li> Yaklaşık 20 mikron çapında (cam kılcal boru ile bir iğne çektirmenin kullanarak) mikroenjeksiyon için iğne hazırlayın; kalibre oküler mikrometre ile bir bileşik mikroskop iğne uçları ölçün. Not: İğne çektirmesi ayarları ince forseps ile kırıldığı zaman istenilen uç boyutu ortaya çıkarır şekilde ince uçlu bir iğne üretmek ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> (Içine kil itin hazırlayınçanak alt) üzerine muntazam tabakalı kil astarlı 35 x 10 mm mikroenjeksiyon sırasında yerinde oosit tutmak için paralel oluklar petri yemekler; alev ucunda erimiş bir alışveriş merkezi probu veya Pasteur pipeti ile oluklar üretirler. Kil, bir alternatif olarak, bir elastomer kalıp 17, girinti yaparak agaroz yemekler hazırlamak. Kil astarlı yemekleri satırları 1X MBS% 3 Ficoll (yaklaşık 2 ml) geniş çaplı bir pipet ile Aktarım oosit. </li><li> Mikroenjektör kullanarak, 1 ng / nl RNA ile iğne doldurup (oosit sitoplazması kadar çizim önlemek için) hafif pozitif basınç üretmek için dengesini ayarlamak. </li><li> Ekvator bölgesinde yaklaşık 20 nl RNA ile oosit enjekte edilir. Daha sonra, Ficoll-MBS kalır 1x MBS yavaşça aktarmak için enjekte edilmiş oositlerde için 1 saat izin verin. Önceden hayvan başlık tahlili için 20 ° C&#39;de 24 saat - 8 inkübe edin. </li></ol> 3. Hayvan Cap Testi <ol><li> Ince forseps, saç döngü, kavisli lamel parçaları, kil astarlı dis 3 / 4x NAM hazırlayın ve eldefincan şekilli girinti çıkıntılar ile hes oosit tutun. Kavisli parça üreten, (4 mm - - 2 mm x 2 yaklaşık 1) ve kenarları lehçe ve sarkık kadar alev geçerek küçük parçalara cam lamelleri ayrı kırarak kavisli lamel parçaları olun. </li><li> X döller laevis yumurta in vitro veya doğal çiftleşme ve aşamaları gastrula kültürün içinden 18 - önceden aşamaya göre sıralama için 0.1x MBS (10 oda sıcaklığında 11 saat sonrası fertilizasyon); 10 embriyoların - orta gastrula (11.5 aşama 11) toplamak. </li><li> 3 / 4x NAM yaklaşık yarısı dolu bir petri embriyolar transfer. Ince forseps iki çift kullanarak, gastrulae gelen fertilizasyon (vitellin) membran kaldırmak. </li><li> Aktarım kil astarlı yemekleri 3 / 4x NAM (yaklaşık 2 ml) oocytes ve oluklar yukarıda açıklandığı gibi bireysel embriyolar karşılamak için gösterim üreten, kil bireysel izlenimler hareketsiz. </li><li> Kil astarlı yemekleri embriyolar transfer ve g kapalı hayvan kesim kapaklarıastrulae ince forseps iki çift kullanarak. Değil, sadece ekvator doku 18 hayvan kap ektoderm izole etmek için özen gösterin. </li><li> Oosit ile temas hayvan kapağın iç yüzeyi ile her bir oosite hayvan yarımkürede bir hayvan kapağını yerleştirin. 8 saat veya daha uzun - 6 oosit yüzeyine maruz iç tabaka ile açık kalabilir (lamel kontaklar olarak hayvan kapakları kil ektoderm düzleşme, bombeli cam lamel fragmanı uygulanması ve cama aşağı doğru basınç uygulayarak rekombinantlarını arada tutmak ). Alternatif olarak, yukarı doğru bakan iç yüzeyi ile bir kil girinti hayvansal takarak ve kapağı üzerinde bir oosit yerleştirmek; Not: kil, küçük uzantıları ile rekombinant sabitleyin. </li><li> 20 ° C&#39;de Kültür kontrol embriyolar tahlil için sahne istenen ulaştıkları kadar. </li><li> Lamel / kil kaldırılması ve forseps ve saç döngü ile ektoderm izole ederek ayrı rekombinant. </li><li> MEMFA 1 saat (% 3.8 için ektodermal fragmanları FixMEM [0,1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA ve 1 mM MgSO 4] formaldehit). </li><li> -20 ˚C etanol ve mağaza MEMFA transfer fragmanları (ve kontrol embriyolar). </li></ol> In situ Hibridizasyon tarafından Ektoderm içinde Yanıtın 4. Analizi (ISH) <ol><li> ISH için çözümler hazırlayın. <ol><li> 1x PBS hazırlayın: 0.01 M fosfat tamponlu tuz, NaCl 0.138 M, pH 7.4 </li><li> Hazırlama PBS-Tween (PTW): 1x PBS,% 0.1 Tween-20 </li><li> 100x Denhart solüsyonu hazırlayın: 2% BSA,% 2 polivinilpirolidon,% 2 Ficoll </li><li> Hibridizasyon tamponu hazırlayın:% 50 formamid, 5x SSC, 1 mg / ml maya RNA Torula, 1 ug / ml heparin, 1x Denhart solüsyonu,% 0.1 Tween-20,% 0.1 CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC H2O </li><li> Hazırlama Maleik asit tampon (MAB): 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI, pH 7.5 </li><li> (Çözünmesi 60 ˚C ısı) MAB,% 2 reaktifi engelleme: MAB + blok hazırlayın </li><li> 100 mM Tris: Alkalen Fosfataz (AP) Tampon hazırlayınpH 9.5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> RNA Probe hazırlayın. <ol><li> 1.5 ml tüp (50 ul reaksiyon) eklemek ticari bir RNA polimeraz kit kullanılarak ve karışımı-NTP dig: 25.5 ul DEPC, H2O, 10 ul 5X Transkripsiyon tamponu, 2.5 ul 10x dig-NTP karışımı, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul doğrusallaştırılmış DNA şablonu (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polimeraz ve 90 dakika için 37 ° inkübe edin. </li><li> 2 ul RNA Polymerase ekleyin ve 60 dakika için 37 ° inkübe edin. </li><li> % 1 agaroz jeli üzerinde reaksiyon 2 ul kontrol edin. </li><li> 1 ul RQ1 RNase-barındırmayan DNase ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° inkübe edin. </li><li> 50 ul DEPC H2O, 25 ul 10 M amonyum asetat ve 313 ul etanolün eklenmesi ile prob Çökelme. -20 ° C&#39;de saklayın, gece boyunca (O / N), daha sonra 20 dakika boyunca 13.800 x g&#39;de santrifüjleme ile geri RNA. Kısaca spin 500 ul% 75 etanol ile yıkayın, kaldırmaketanol ve kuru hava pelet izin verir. Ekle 50 ul DEPC H 2 O. </li><li> 0.5 ug / ul ~ arasında nihai bir konsantrasyona kadar Hibridizasyon Tamponu ekleyin. </li></ol></li><li> Hibridizasyon için Tissue hazırlayın. Aksi belirtilmediği sürece, her bir çözüm değişikliği tarif edildiği gibi (yaklaşık 4 mi) ile üst şişeler doldurulur. <ol><li> Yatay rocker, 10 dakika her biri için% 75 etanol / PTW, daha sonra% 50 etanol / PTW Şişelerden ve transfer embriyolar etanol çıkarın. </li><li> 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın. </li><li> 10 ug PTW içinde / ul Proteinaz K tedavisi transfer; Kaya tüpleri dik 15 dk. </li><li> Dikey kaya tüpleri - 0.1 M Triethanolamine pH 7.8 iki kez 10 dakika her durulayın. </li><li> Tüplere 12.5 ul asetik anhidrit eklenir ve dikey olarak 5 dakika sallayın. 5 dakika boyunca ilave 12,5 ul asetik anhidrit ile tekrarlayın. </li><li> Rocker dk dikey PTW 5 yıkayın. </li><li> Rocker% 4 paraformaldehid 20 dakika içinde Refix. Isı Hibridizasyon Tampon60 ˚C ye. </li><li> 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın. </li><li> 250 ul Hyb Buffer her tüpten PTW tüm ama ~ 1 ml çıkarın ve ekleyin; hafifçe karıştırın tüpler girdap. Kaya tüpleri dik 5 dk. </li><li> 60 ˚C Hyb Tamponu (0.5 mi) ile değiştirin ve 60 ° C&#39;de 10 dakika yavaşça çalkalayın. Taze Hyb Tampon ile değiştirin ve 60 ˚C iki 4 saat sonra çalkalayın. </li><li> Isı sondası 60 ° C (3 dakika) (0.5 ug Hyb Tamponu içinde / ml 1 ml). Hyb Buffer çıkarın ve tüpler probu ekleyin. O / N 60 ° C&#39;de yavaşça çalkalayın. </li></ol></li><li> Antikor için Tissue hazırlayın. <ol><li> 60 ° C&#39;ye ısınmaya Hyb Tampon ve 2 x SSC +% 0.1 Tween-20 çözümler. </li><li> (- 3x yeniden kullanım için 2 -20 ˚C de probları kaydetmek) Hyb Tampon ile prob çözümü değiştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;de yıkanır. </li><li> 2x SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın. </li><li> 0.2X SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın. </li><li> Rocker üzerinde 15 dakika her yatay için MAB (RT) iki kez yıkayın. </li><li> 1 ml MAB + bloğu ekleyin. Rocker dikey 2 saat yıkayın. </li><li> 1 / 2.000 Anti-dioksijenin-AP içeren 1 ml MAB + blok transfer. 4 CO / N dikey sallayın. </li></ol></li><li> Renk Reaktif için Tissue hazırlayın. <ol><li> MAB ile antikor çözüm değiştirin; MAB 5 dakika her yatay rocker üç kez yıkayın. </li><li> MAB 1 saat her yatay rocker üç kez yıkayın. </li><li> AP Tampon 10 dakika içinde her yatay rocker iki kez yıkayın. </li><li> Birden-iyi plastik tepsi doku aktarın AP Buffer kaldırmak ve BM Mor reaktifmi (~ 1 ml). Reaksiyon O / N karanlık 5 dakika içinde ilerlemeye izin verin. </li><li> Uygun boyama elde edildiğinde, PTW ve şişelere doku aktarın. Rocker üzerinde PTW iki kez 10 dakika her yıkayın. </li><li> Rocker 4 CO / N at Bouin çözeltide sabitleyin. </li><li> RT&#39;de Bouin üç% 70 etanol /% 30 PTW yıkar ile yıkayın. T DevamGerekli 18 ise epi-aydınlatma ve bir mikroskop monte kamera, ağartma kullanarak o görüntü yakalama. </li></ol></li></ol> 5. Sib Seçimi ve Klonlama <ol><li> En yüksek aktivite ile seçin havuzu (ektodermal dokusunda büyük tepki). </li><li> (Yukarıda protokol bölümü 2 kullanılarak) önceki adımda elde edilen koloniler, en yüksek etkinliği olan havuzu için gliserol stokları (uygun yoğunluğa LB ile seyreltilmiş) ile yaklaşık onda biri ile on yeni plakaları plaka titre edilir. </li><li> Etkinlik tek koloni takip dek havuzu boyutunu azaltın. </li><li> Vektör standart primerler kullanılarak DNA sekansı elde edilir. </li></ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yetkili ektoderm bir yanıt indükleme yeteneğine sahip genlerin fonksiyonel klonlanması için, burada açıklanan yöntem, gen ürünlerinin geniş tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem ifade klonlama teknikleri ile doku uyaran deneyleri birleştirerek geçmiş iş üzerine genişletir. Bu RNA, enjeksiyonu takiben, doğrudan veya dolaylı olarak, faktör uyarıcı üretim kaynağı olarak, Xenopus oosit metabolik yolları kullanmaktadır. Bu ilgi, bir cDNA kütüphanesi veya klonları diğer toplama elde edilen transkriptlerin ekspres...

İlgilenilen genleri işlevleri veya işlev kayıpları yoluyla tanımlamaya yönelik ileri genetik yaklaşımlar1,2, gelişimdeki karmaşık modelleme olaylarını anlamanın ayrılmaz bir parçasıdır. Sürekli genişleyen bir dizi sistem ve araştırmacı3-5 için mevcut olan güçlü ters genetik tekniklerle birleştiğinde, artık bir yolda anahtar bir işlevsel role sahip genleri tanımlamak ve daha sonra hücresel düzeyde ve diğer gen ürünleriyle etkileşim içinde işlev gören genleri aydınlatmak mümkündür. Geçmişte birçok önemli bulgu ortaya çıkaran ilgili genleri işlevsel olarak tanımlamaya yönelik bir yaklaşım, ifade klonlamasıdır6,7.
Son zamanlardakihedefimiz 8, omurgalı lens indüktif sürecindeki ilk adımların gastrula evreleri kadar erken gerçekleştiği gösterildiğinden, erken lens indüktif faktörlerini belirlemekti. Bu amaçla, Xenopus embriyolarının geçici olarak lens yetkin9 hayvan başlığı ektodermini (evre 11-11.510) indüksiyon için yanıt veren doku olarak ve evre VI Xenopus oositini indükleyici faktörler için bir üretim kaynağı olarak kullandık.
Aşağıdaki protokol, Smith ve Harland6,7'nin ifade klonlama ve sib seçim protokolleri üzerine inşa edilmiştirve diğerleri 11-13 tarafından da başarıyla kullanılmıştır. Oosit ekspresyon sistemimizde (ilk olarak Lustig ve Kirschner14 tarafından indükleyici faktörlerin üretimi için kullanılmıştır), oositlerin doğrudan veya dolaylı olarak hayvan başlığı ektoderminde lens indüktif yanıtı ortaya çıkaran faktörler üretmesine neden olabilen enjekte edilmiş transkript havuzları seçilir ve tanımlanır. Sistem, salgılanan indükleyici molekülleri doğrudan eksprese etmek için yararlı olduğundan (oosit enjekte edilen INHBB mRNA, mezoderm yetkin hayvan kapektodermi 8'de mezoderm indüksiyonuna neden olur), başlangıçta tarama prosedürünün esas olarak parakrin faktörlerin tanımlanması için yararlı olmasını bekliyorduk. Bununla birlikte, ekranımızda bir nükleer faktör tanımladığımızdan (ldb18), sistemin transkripsiyonel veya translasyonel düzenleyici faktörler, miRNA'lar, kofaktörler veya jukstastrin faktörleri gibi çok çeşitli molekülleri tanımlamak için kullanılabileceği açıktır.

<table><tbody><tr><td>12/101 Antikor</td><td>Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası</td><td>12/101</td><td>Kas dokusunun tespiti için monoklonal antikor</td></tr><tr>ISH<td>Asetik anhidrit</td><td></td> için 20x SSC Tampon Sigma <td>S6639</td><td>ISH Anti-Dig-AP için</td>Sigma A6404</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ISH Aurum Plazmid Mini Kiti için <tr><td></td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Plazmid DNA saflaştırması</td></tr><tr><td>ISH BM için</td>Bloke <td>Edici Reaktif</td><td>Roche</td><td>11096176001</td> ISH</tr><tr><td>Boekel Hibridizasyon Fırını</td><td></td>için Mor Roche 11442074001 ISH Bouin'in Çözeltisi için <td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ISH <tr><td>BSA</td><td>için Sigma HT10132 OCM</td><td></td>CHAPS Sigma <td>C9647</td> için</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Sigma</td><td>C3023</td><td>ISH için</td></tr><tr><td>Kollajenaz A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Oositlerin Defollikasyonu</td></tr><tr><td>Sistein</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly embriyoları</td></tr><tr><td>ISH için</td><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td></tr><tr><td>Dig-RNA Etiketleme Karışımı</td><td>ISH probları için</td><td>Roche</td><td>11277073910</td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td> Vitellin zarfı için <td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td> çıkarma</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anestezik</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>Enjeksiyon ortamı için</td></tr> ISH Gentamisin sülfat <tr><td>için</td><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td></tr><tr><td></td><td>OCM için Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td> Dünya <td>Hassas Aletler</td><td>4878</td><td>3.5 "uzunluğunda, I, D, 0.530 mm</td></tr><tr><td>ISH için</td> <td>cam numune şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td></tr><tr><td>Saç halkası</td><td></td><td></td><td>Doku manipülasyonu için pasteur pipete yapıştırılmış saçlar</td></tr><tr><td>ISH</td>Enjektör Nanolitre 2010 için<td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H4784</td></tr><tr><td></td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>Nanolitre 2010</td><td>Mikroişlemci kontrollü mikroenjektör</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Kurbağa kurtarma için Akvaryum Tuzu</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus doğrulanmış tam uzunlukta kamera cDNA</td><td>Kaynak Biyobilim</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA kütüphanesi&nbsp;</td></tr><tr><td>100 & mikro ile LB Agar plakaları; g/ml Ampisilin Teknova</td><td></td><td>L5004</td><td>150 mm önceden dökülmüş LB-Amp sib seçimi için plakalar</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB sib'de kolonilerin toplanması, plakalardan seçilmesi ve kültürlerin seyreltilmesi için</td></tr><tr><td>Manyetik mRNA İzolasyon Kiti</td> ISH <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>için poli(A)-zenginleştirilmiş RNA Maleik Asit Sigma M0375'in izolasyonu için New England BioLabs S1550SManuel Microfil Micromanipülator</td><td>World Hassas Aletler</td><td>M3310R</td><td>Manuel mikromanipülatör</td></tr><tr><td>Nutating Mikser</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon ve diseksiyon yemekleri için</td>ISH<td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td> Kil</tr> için Rocker ISH PMSG Sigma <tr>G4877 <td>için</td><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td></td> Sigma <td>P5368</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Oosit gelişimini uyarmak</td></tr> için<tr><td>ISH</td>Programlanabilir <td>Çektirme Dünyası</td> Hassas Aletler için <td>Polivinilpirolidon</td><td>Sigma PVP40</td></tr> ISH pTnT Vektör için <tr><td></td><td></td><td>PUL-1000</td><td>Mikropipet iğne çektirme</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA kütüphane yapısı</td></tr><tr><td>Riboprobe Kombinasyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Üst Simge Tam Boy cDNA Kütüphanesi İnşaat Kiti cDNA</td><td>kütüphanesi yapımı için</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td> kiti</tr><tr><td>Sütürler, 3-0 ipek</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Oosit sonrası temizleme için dikiş ipliği ve iğnesi</td></tr><tr><td>ISH için Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>ISH</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Trietanolamin Sigma T1502ISH Universal</td> RiboClone cDNA Sentez Sistemi <td>için</td>Tween 20 <td>Sigma</td><td>P9416</td></tr><tr><td></td><td>cDNA kütüphanesi yapımı için</td><td>Promega</td><td>C4360</td> alternatif kiti</tr><tr><td>Xenopus Tam ORF Giriş Klonları - ORFeome İşbirliği</td><td>Kaynak Biyobilim</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Klonları</td></tr><tr><td>XL2-Mavi Ultra Yetkin Hücreler</td> cDNA dönüşümü için <td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>hücreleri kütüphane</td></tr></tbody></table>

bir kullanılması fonksiyonel klonlama<em&gt; xenopus</em&gt; oosit ekspresyon sistemi

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Embriyonik indüksiyondan sorumlu genlerin tanımlanması bir dizi zorluk doğurur; birkaçını saymak gerekirse, salgılanan ilgili moleküller bol miktarda olabilir, salgılanmayabilir, ancak sinyal hücresine/hücrelerine bağlı olabilir, veya bağlayıcı ortakların veya yukarı akış düzenleyici moleküllerin varlığını gerektirebilir. Bu nedenle, yetkin ektodermde erken bir lens indüktif tepkisi ortaya çıkarabilen gen ürünleri arayışında, parakrin veya jukstakriin faktörlerinin yanı sıra transkripsiyonel veya diğer düzenleyici proteinlerin tanımlanmasına izin verecek bir ekspresyon klonlama sistemi kullandık. mRNA havuzları Xenopus oositlerine enjekte edildi ve yanıt veren doku doğrudan oositlerin üzerine yerleştirildi ve birlikte kültürlendi. Lense yetkin hayvan şapkası ektoderminde erken lens plakod işaretleyicisi foxe3'ün ekspresyonunu ortaya çıkarma yeteneğine dayalı olarak bir nöral plaka aşaması cDNA kütüphanesinden ldb1'in fonksiyonel klonlanmasını takiben, mRNA ekspresyon modelini karakterize ettik ve ldb1'in aşırı ekspresyonu veya devrilmesini takiben gelişimsel ilerlemeyi test ettik. Bu sistem, bir indükleyicinin veya onun yukarı akış düzenleyici moleküllerinin tanımlanmasının, yetkin dokuda fonksiyonel bir yanıt kullanılarak arandığı çok çeşitli bağlamlarda uygundur.

Hayvan kap doku yanıt, oositler enjekte mRNA ekspresyonu yanıt olarak in situ hibridizasyon (Şekil 2 ve Tablo 1) e göre otx2 ekspresyonu için tahlil edilmiştir; otx2 göz taslakları nöral tüp kapanması ile ilgili olası lens ektoderm (PLE) cinsinden ifade edilir kalınlaşma 19. Otx2 da PLE dışındaki ön nöral ektoderm olarak nöral olmayan baş ektoderm ifade edilir Bununla birlikte, bu nöral ve placodal tepkiler...

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Bu prosedürün genel amacı, yetkin ektodermde bir yanıt oluşturabilen gen ürünlerinin tanımlanmasına uygun bir hayvan başı sistemi olan Xenopus oositini göstermektir. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, indüktif bir yanıtı tetiklemek için hangi genlerin gerekli olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef bir doku üzerinde etkili olan indükleyicileri veya hatta indükleyicilerinle yukarı akışta etkili olan genleri üretmek ve tanımlamak için bir ekspresyon sistemi olarak Xenopus oositinin kullanılmasıdır.Diseksiyon ve rekombinasyon aşamaları yüksek düzeyde evre bağımlı olduğundan ve rafine bir teknik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi oldukça faydalıdır. Anestezize edilmiş dişi kurbağalardan yumurtalık dokusu toplandıktan sonra, dokuyu her biri yaklaşık 10 ila 20 oosit içeren küçük parçalara ayırın. Bu fragmanları önce taze OR2-solüsyonuna, ardından 2,0 mg/mL collagenase A içeren OR2-solüsyonuna aktarın. Dokuyu içeren karışımı bir çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca hafifçe ajite ederek işleme devam edin.Ardından fragmanları taze kollagenaz solüsyonuna aktarın ve bir saat daha çalkalayın. Bu işlemin sonunda defloküle olmuş oositlerin gözlenmesi beklenir. Oositleri 10 kez tam OR2 ile ve ardından iki kez OCM olarak kısaltılan oosit kültür ortamı ile yıkayarak devam edin.Ardından, oositleri taze OCM içerisine yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobu altında görsel olarak inceleyin. Daha küçük ve immatür oositleri ayıklayarak altıncı evredeki oositleri izole edin. Daha sonra, oositleri OCM içeren agaroz kaplı bir Petri kabına yerleştirin ve enjeksiyona kadar 18 ila 20 °C'de muhafaza edin.Mikroenjeksiyon hazırlığı için, cam kılcal tüpleri bir iğne çekiciye yerleştirin, çekme işlemini gerçekleştirin ve ardından yaklaşık 20 mikrometre çapında iğneler oluşturmak için cam uçları kırın. Bir bileşik mikroskopta, iğne uçlarını kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ile ölçün. Ardından, bir 35 by 10 milimetrelik Petri kabının tabanına kili düzgün bir tabaka halinde yayın.Ardından, küçük bir prob benzeri alet kullanarak bu katmanda paralel oluklar oluşturun. Kil kaplı çanağı, 1x modifiye Barth salini (MBS) içinde yaklaşık 2 mililitre %3 Ficoll ile doldurun. Daha sonra oositleri, geniş ağızlı bir pipet kullanarak buraya aktarın.Oositleri, sonraki mikroenjeksiyon sırasında sabit kalacak şekilde oluklara yerleştirin. Bir mikroenjektör kullanarak, bir iğneyi önceden hazırlanmış mRNA havuzundan yaklaşık iki mikrolitre ile doldurun ve enjeksiyon sırasında oosit sitoplazmasının iğneye çekilmesini önlemek için hafif bir pozitif basınç oluşturacak şekilde dengeyi ayarlayın. Ardından, her bir oositin ekvatoral bölgesine 20 nanolitre RNA enjekte edin.Ardından, oositleri bir saat boyunca Ficoll MBS içinde bekletin ve daha sonra nazikçe 1x MBS'ye aktarın. Oositleri 20 °C'de sekiz ila 24 saat boyunca inkübe etmeye devam edin. Animal cap analizine başlamak için NAM çözelti olarak kısaltılan 3/4x normal amfibi ortamı, ince penset, bir saç döngüsü (hairloop), önceden enjekte edilmiş oositler ve evre 11 ila 11.5'teki Xenopus embriyolarını hazırlayın.Ardından, cam lamelleri yaklaşık bir milimetre çarpı iki milimetre boyutlarında parçalara ayırın ve kenarları cilalanıp eriyene kadar bu parçaları alevden geçirin. Daha sonra, önceden açıklandığı gibi, bir kap içerisine kili tek bir tabaka halinde bastırın. Bu kaplamanın üzerinde tekil çanak şeklinde izler oluşturmak için küçük bir prob kullanın.Kabın içerisine yaklaşık iki mililitre 3/4x NAM ekleyin. Ardından, enjekte edilen oositleri, her biri tek bir çukura sabitlenecek şekilde yerleştirerek aktarın. Embriyoları hazırlamak için onları 3/4x NAM solüsyonu içeren bir kaba aktarın.Ektodermin yaşını belirlemek için evreleme kontrolleri olarak kullanılacak bir grup gastrula seçin ve bunları aynı çözeltiyi içeren başka bir kaba aktarın. Bu plakayı kenara ayırın. Hayvan başlığı deneyi için kullanılacak embriyoların vitellin membranlarını iki çift ince forseps yardımıyla çıkarın.Ardından, gastrula'yı oositlerin bulunduğu kil kaplı kaba aktarın. Başlangıç olarak, ekvatoriyel dokuya zarar vermemeye dikkat ederek, iki çift ince pens yardımıyla embriyolardan animal kapları kesin. İlk yöntemi kullanarak rekombinantlar oluşturmak için, bir animal kapı, iç yüzeyi önceden bir oyuğa yerleştirilmiş olan bir oositin animal hemisferine temas edecek şekilde konumlandırın.Ve bu işlemi enjekte edilen birkaç oosit için tekrarlayın. Bu rekombinantların bir arada tutulduğundan emin olmak için, her birinin üzerine kavisli bir cam lamel parçası yerleştirin ve hayvan düzleşene ve lamel kile temas edene kadar aşağı doğru baskı uygulayın. İkinci yöntemi kullanarak rekombinantlar üretmek için, hayvan başlıklarını (animal caps) ve oositleri kil içindeki boş bireysel çukurlara birlikte yerleştirin.Hayvan kalınçlarının iç yüzeylerinin oositlere dönük olduğundan emin olun. Ardından, iki dokuyu küçük kil parçaları kullanarak birbirine sabitleyin. Her iki yöntemle de birden fazla rekombinant oluşturulduktan sonra, bunları ve kenara ayrılan kontrol embriyolarını 20 °C'de kültüre alın.Kontrol embriyoları istenen evreye ulaştığında, rekombinanlardan lamelleri kaldırın ve bir pens ile saç döngüsü kullanarak hayvan başlığı ektodermini izole edin. Hem ektodermal fragmanları hem de kontrol embriyolarını bir saat boyunca MEMFA içinde sabitleme işlemine geçin. Ardından bunları etanola aktarın ve bu dokuyu -20 °C'de saklayın.Burada, oosit setlerine giderek azalan sayıdaki klon veya koloniye karşılık gelen mRNA havuzları enjekte edilmiş ve ardından animal cap'ler ile kültüre edilmiştir. Sonrasında, erken nöral plaka aşamalarından vezikül oluşumuna kadar varsayılan lens ektoderminde normalde gözlemlenen ve burada lens indükleme kapasitesini değerlendirmek için kullanılan bir belirteç olan foxe3'ü eksprese eden animal cap sayısının her bir set için belirlenmiştir. Bu yöntem, değerlendirilen animal cap'lerin 179'da 50'sinde veya %28'inde lens indükleyici bir yanıt oluşturabilen ldb1 nükleer faktör kodlayan geni tanımlamıştır.Burada gösterilen, yaklaşık evre 11'den evre 23'e kadar ldb1 enjekte edilmiş oositlerle kültüre edilen hayvan şapkalarındaki foxe3 sinyalini (ok başları ile belirtilmiştir) betimleyen in situ hibridizasyon görüntülerimiz görülmektedir. Enjekte edilmemiş oositlerin üzerine yerleştirilen karşılık gelen kontrol hayvan şapkalarında herhangi bir foxe3 ekspresyonu gözlenmemiştir. Bu hayvan şapkalarından kesitler alındığında, foxe3 ekspresyonu hem iç hem de dış ektodermal tabakalarda gözlenmiştir.İç tabakadaki ekspresyon, lens yanıtının karakteristik bir özelliğidir. Ya da her iki tabakada sinyal verilmesi, olfaktör plakod gibi diğer yapıların göstergesidir. Bu prosedürün ardından, hayvan başlığı ektodermindeki indüktif bir yanıtı değerlendirmek amacıyla immünohistokimya, in situ hibridizasyon veya floresan bir raporör genin doğrudan saptanması gibi yöntemler uygulanabilir.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem...

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Biz petrol su microemulsions içinde Xenopus laevis yumurta özleri Kapsüllenen tarafından vitro kendini sürekli mitotik salınımlarını tek hücre düzeyinde nesil için bir yöntem mevcut.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Öğrenin Xenopus oosit ve hayvan kapağı sistemi kullanarak yetkin ektodermde yanıt oluşturan gen ürünlerini tanımlama yöntemini. Bu teknik gelişimsel biyolojide gen işlevlerini in vivo analiz etmeye yardımcı olur.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama

Daha fazla video keşfet