Name: Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, retinal şerit sinapslarındaki membran proteinlerini yüksek çözünürlüklü sayısal immunogold yöntemiyle nicel olarak analiz etmeyi. Bu teknik, glutamat reseptörlerinin sinaptik lokalizasyonunu hassas şekilde belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü (NIDCD), (NIH) İntramural Programları tarafından desteklendi. Biz NINDS EM tesis ve yardım için NIDCD gelişmiş görüntüleme çekirdek (kod # ZIC DC 000081-03) teşekkür ederim.

Bakım ve hayvanların taşıma NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komite Kurallarına göre idi. 12 saat ışık: Postnatal gün (P) bilateral üstün colliculus ile 1-1.2% CTB enjekte 15-21 Sprague-Dawley sıçanları, 12 muhafaza edildi karanlık döngüsü. 1. Retina Doku Fixation <ol><li> Bir diseksiyon mikroskobu, çok ince ipuçları, makas, selüloz filtre kağıdı, plastik pipet ve bir mikroskop lamı ile 2 forseps: Aşağıdaki malzemeler ve aletler monte edin. </li><li> 2.0 mi, halotan (bir uçucu anestezik) ile kapalı bir bölme sıçan anestezisi. ayak tutam veya göz kırpma refleksi eksikliği sonra arka pençe çekilmesi eksikliği: bu yöntemlerle yeterli anesthetization belirleyin. Sonra, bir giyotinle birlikte derhal başını kesmek. pH 7.4&#39;te 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) içinde% 4 paraformaldehid içeren bir cam tabak içinde iris makas ve yer ile gözler çıkarın. </li><li> diseksiyon mikroskobu kullanarak, mısır kaldırmakgöz küresinin ön keserek ad. forseps ile iç retina yüzeyinden lens ve vitreus çıkarın. </li><li> Retina Göz yuvası izole edilene kadar iki forseps ile sklera soyun. </li><li> Bir jilet ile 200 mikron kalınlığında şeritler ve pH-shift tespitin tabi - 100 içine hemen retina kesti. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika için 10 - pH 10.5, 30 dakika ve daha sonra% 4 paraformaldehid artı% 0.01 glutaraldehid - 20 pH 6.0&#39;da 0.1 M PB içinde% 4 paraformaldehit retina şeritler düzeltildi. </li><li> (4 ° C&#39;de pH 7.4), 0.15 mM CaCI2 ile PB pek çok kez yıkamadan sonra, 0.1 (% 30 O / N sonra% 10,% 20,% 30, her 60 dakikada bir) M gliserol ile retina şeritler cryoprotect ikamesi dondurmak için önce PB. </li></ol> 2. Freeze-ikamesi NOT: Bu donma-ikame yöntemi erken yayınlanmış bir protokol 19,20 modifiye edilir. Ayrıca, araçlar (eldiven giymek) çok soğuk olduğu önemlidir; Oaletleri ile dokunulduğunda therwise, doku kısmen çözülme olabilir. Bu adımların hepsi AFS odasının içinde yapılır ve cihazlar odasının kenarına üzerinde hareket etmek asla izin verilmez. Benzer şekilde, AFS kullanılan bütün kimyasal maddelerin uygun soğutma gereklidir. <ol><li> -Dalma donma bir EM kriyoprezervasyon enstrüman (TBM) içinde -184 ° C&#39;de sıvı propan retina şeritler. ince bir fırça kullanarak, (fırça kullanarak ekstra tampon kapalı fitil) dalan çubukların ucunda gitmek metal taslakları bağlı çift sopa bant küçük parçalar üzerinde örnekleri yerleştirin. </li><li> Sıvı propan içine çubuklar dalma ve yaklaşık 5 saniye boyunca orada tutun ve sonra sıvı nitrojen ile doldurulmuş küçük bir taşıma odasını kullanarak otomatik dondurarak ikame enstrüman (AFS) transfer ( &#39;LN 2 cryo transferi konteyner soğutmalı&#39;). </li><li> AFS içine donmuş örnek ve aletleri (forseps ve neşter) yerleştirdikten sonra, se için odasında aletleri serinVeral dakika doku dokunmadan, ya da küçük nakil odasına birkaç saniye için araçların ipuçları koyarak bunları soğutmak önce (sıvı azot ile dolu () &#39;LN 2 cryo transferi konteyner soğutmalı&#39;). </li><li> AFS kez ince bir neşter kullanılarak saplama numune ve bandı çıkarın. Ayrıca, azot gazı akış kontrol altında tutmak, TF bu işlemler sırasında açık (TF &#39;LN 2 buharlaştırıcı için regülatör kontrol&#39; olarak tarif edilmiştir). </li><li> (AFS kurmadan önce, yani) düz gömme sahipleri içine donmuş doku yerleştirmeden önce, şeffaf bir plastik levha ince bir daire kesip ve her iyi alt hattına kadar tutucu dibine yerleştirin. Bittiğinde Bu polimerize örnek blok görece daha kolay çıkarılmasını sağlar. NOT: Daha önce, çift Reichert + jelatin kapsülleri (Petralia ve Wenthold, 1999 bakınız) istihdam düz katıştırma sahiplerine alternatif bir yöntem kullanılabilir, ve &lt;sup&gt; 20. </li><li> = 4 ° C / saat (11.3 saat), T2 ile 32 saat, S1 = artış sıcaklığı için T1 = -90 ° C -45 ° C 50 saat, S2 için: AFS (enstrüman terminolojiyi kullanarak) aşağıdaki otomatik dizisini kullanın = 5 ° C / saat (9 saat), (toplam = 142.3 saat) 40 saat süre ile T3 = 0 ° C artış sıcaklığı. önce zamanlı dizisi başlamadan (-90 ° C&#39;de) AFS örnekleri yerleştirmek için 4 saat - 2 adet sürebilir. </li><li> AFS&gt; 32 saat boyunca -90 ° C&#39;de metanol içinde% 1.5 uranil asetat içinde dondurulmuş bölümler bırakın. Düz gömme alüminyum tutucu yedi kuyu her dokuların (tipik olarak) iki adet yerleştirin (üç AFS uyması). <ol><li> kuyularda uranil asetat / metanol içine doku + bandı yerleştirin ve bant doku kaldırmak çok zor ise, hemen önce infiltrasyon (örneğin Lowicryl HM20 gibi) başlangıç ​​gömme ortamına, daha sonra bandı çıkarın. </li></ol></li><li> Daha sonra sıcaklık adım adım artış, saat başına -45 ° C (+ 4 ° C; Otomatik sırayla). </li><li> Her düz gömme sahibinden eski çözüm kaldırmak için ince uçlu bir plastik pipet kullanarak, ve sonra soğutulmuş taze metanol eklemek için başka bir standart plastik pipet kullanarak, önceden soğutulmuş metanol numuneleri üç kez yıkayın. </li><li> 1 ve 2: Daha sonra, aynı yöntemi kullanarak, örneğin 1 de ortamı (HM20 / metanol gömme kütlesi olarak düşük sıcaklık gömme reçine ile kademeli örnekleri infiltre 2 saat boyunca saf reçine ardından 2 saat süre ile, 1 her biri, ve daha sonra reçine değiştirme ve) O / N tutun. </li><li> Sadece kuyu üst kenarına ulaşmak için reçine seviyesinin ayarlanması, ertesi gün tekrar reçine değiştirin. </li><li> örnekleri polimerize (-45 ° C, otomatik sırayla 0 ° C&#39;ye kadar, saatte ortalama + 5 ° C) 40 saat süre ile, UV ışığı ile. </li><li> Sonra AFS örnekler kaldırın. Tipik olarak, örnek bloklar hala renkli bazı pinkness göstermektedir. RT O kimyasal davlumbaz floresan ışık yakın örnekleri, koyun / N veya daha uzun onlar kadar uygulamaKulak tamamen net. </li></ol> 3. Postembedding EM immunogold İmmünositokimya Not: 23,24,25 tarif edildiği gibi Postembedding immünositokimya gerçekleştirilir. <ol><li> % 1 toluidin mavisi ile 1 mikron Ultramikrotomla bölümleri, leke bölümleri kesmek ve bölüm oryantasyonu için onları incelemek; Kesit optimal enine uçağı elde etmek için doku bloğu yönlendirmek. </li><li> Ultramikrotomla 70 nm kalınlığında ultra ince bölümleri kesmek ve Formvar-karbon kaplı nikel yuvası ızgaraları onları toplamak. </li><li> Yıkama bir Tris-tamponlu tuzlu su, üç kez (TBS, 0.05 M Tris tamponu,% 0.7 NaCl, pH 7.6) yıkama izledi damıtılmış H2O içinde bir kez ağlar. </li><li> ve bir NMDAR alt-birimi (anti-tavşan GluN2A 1:50 ila bir antikor: keçi anti-CTB ihtiva eden bir karışım 20 ul damla (3,000 1) daha sonra, 30 dakika TBS içinde% 5 BSA, 20 ul damlalar ızgaraları inkübe ve , GluN2B 1:30), ya da bir anti-tavşan GluA2 / 3 (1:30)% 2 BSA ile TBS-Triton (TBST,% 0.01 Triton X-100, pH 7.6) ve 0.02 M Nan 3 O / RT N. </li><li> 5 dakika TBS (pH 8.2) ve ardından üç ayrı 10 için TBS damla (20 ul) (pH 7.6), 10, ve 20 dk yıkama ızgaraları. </li><li> TBST içinde 18 nM altın parçacıklarına bağlanmıştır 10 nm altın parçacıkları ve eşek anti-keçi IgG (1:20) bağlı eşek anti-tavşan IgG (1:20) ihtiva eden bir karışım damla 2 saat (20 ul) için ızgaraları inkübe 2% BSA ve 0.02 M NaN 3 (pH 8.2). </li><li> ultra saf su içinde, daha sonra 5, 5 ve 10 dakika süre ile TBS 20 ul damlalar (pH 7.6) &#39;de ızgaraları yıkayın ve kurutun. </li><li> Sırasıyla, karanlık koşullarda 8 ve 5 dakika için damıtılmış H2O içinde% 5 uranil asetat ve% 0.3 kurşun sitrat ile karşı-ızgaralar. </li><li> Paket etiketleme deneyleri için, ızgaralar inkübe O / anti-keçi CTB bir karışımının 20 ul damla (1: 3000) oda ısısında N, anti-fare PSD-95 (1: 100) ve anti-tavşan GluN2A (1 : 50). Ardından 2 2 saat süreyle ızgaraları inkübe2% BSA ve 0.02 M NaN 3 TBST içinde 18, 10, ve 5 nm ve altın parçacıklarına bağlanmıştır IgG&#39;lerin bir karışımı (pH 8.2) içinde 0 ul düşer. Yıkama arasında ve antikor inkübasyondan sonra counterstaining çift etiketleme gibi aynı prosedürleri tutun. </li><li> Kontroller ikincil antikorlar, tek başına uygulandığında edildiği yapılmıştır. </li><li> Bir EM isimli ızgaraları ve digitalize görüntüler. 24 gerekirse, sadece parlaklık ve kontrast için Adobe Photoshop 6.0 ​​final rakamları işleyin. </li></ol> 4. sayısallaştırılması <ol><li> El ile 8,000X büyütmede delik veya çatlak olmadan iç pleksiform tabakasının (IPL) seçkin alanlar, daha sonra rastgele 25,000X büyütmede IPL tam derinliğini fotomontaj. </li><li> bunlar: a) retrograd taşınan CTB sinyali (büyük altın parçacıkları) içerir, b) sergiler iyi tanımlanmış membranlar, yarıklar ve postsinaptik yoğunlukları, c) en az iki küçük altın bölümü içerdiğinde konik bipolar çiftlerinde de RGC dendrit tespitPSD içindeki icles veya extrasynaptic plazma zarı boyunca, birden fazla küçük bir altın parçacığı. </li><li> kantitatif analiz için yukarıdaki kriterlere göre, 55 RGC dendrit - 45 toplayın. </li><li> PSD ve NIH ImageJ yazılımı ile bireysel RGC dendritler extrasynaptic plazma zarı uzunlukları ölçün. Membranın 10 nm olan altın parçacıkları sayısı 7, bir ortalama kalınlığına göre, membran bağlantılı - plazma zarı 26 9 nm. </li><li> Doğrusal mikrometre (altın / um) başına altın parçacıkları sayısı parçacık yoğunluğu hesaplayın. Her altın parçacığının merkezi ve (sinaptik konumu için) PSD ortasında ya da (extrasynaptic konumu için) PSD kenarı arasındaki mesafeyi ölçün. </li><li> yazılım tarafından istatistiksel analiz. karşılaştırmak için iki kuyruklu t-testi kullanın. önemi p &lt;0.05 varıldı. Aksi belirtilmedikçe, rapor değerleri ± SEM 18 demek. </li></ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Başarılı kantitatif sonrası gömme immunogold EM için dört teknikleri tarif etmişlerdir: 1) kısa ve zayıf tespit, 2) donma-ikamesi, 3)-sonrası gömme immunogold boyama ve 4) ölçümü. EM immünolojik ultra ince doku kesitlerinde spesifik proteinlerin belirlenmesini sağlar. altın partikülleri ile etiketlenmiş antikorlar ile doğrudan EM kullanılarak görüntülenebilir. Bir zar reseptörü subsynaptic lokalizasyonu tespit güçlü iken, EM immünolojik teknik açıdan zor olabilir ve doku fiksasyon ve işleme ...

Glutamat retinada 1 majör eksitatör nörotransmiter olduğunu. Bipolar hücreleri 2 glutamaterjik sinaptik girdi alan retina ganglion hücrelerinin (RGCs), beyne görsel bilgi göndermek retinanın çıkış nöronları vardır. Fizyolojik çalışmaları RGCs sinaptik uyarım NMDA reseptörlerinin (NMDARs) ve AMPA reseptörleri (AMPARs) 3,4,5 tarafından postsynaptically aracılık ettiğini göstermiştir. RGCs eksitatuvar postsinaptik akımlar (EPSCs) AMPARs ve NMDARs aracılık ettiği, ancak RGCs ilgili 3,5,6,7,8 spontan minyatür EPSCs (mEPSCs) sadece AMPARs aracılı bileşen 4,5,9 sergiler. Ancak, glutamat alımını azaltarak RGC dendritler üzerinde NMDARs uyarıcı sinaps dışında olabilir düşündüren, spontan EPSCs 5 bir NMDAR bileşeni saptandı. Membran ilişkili guanilat kinazlar PSD-95 olarak (MAGUKs) o glutamat reseptörleri ve iyon kanalının da dahil olmak üzere küme nörotransmitter reseptörleri,sinaptik s, ayrıca ayrı subsynaptic ekspresyonu 10,11,12,13,14 sergiler. Son yıllarda, konfokal immünohistokimya ve ön gömme elektron mikroskobu (EM) immünohistokimya üzerinde zar reseptör ekspresyonunu incelemek için istihdam edilmiştir. konfokal immün reseptör ekspresyonunun geniş desenler ortaya koymaktadır rağmen, onun düşük çözünürlüklü imkansız hücre içi konumu ayırt etmek kullanmayı kolaylaştırır. Memeli retinada ön gömme EM çalışmaları NMDAR alt birimleri koni bipolar hücre şerit sinaps 15,16,17 de postsinaptik elemanları mevcut olduğunu göstermektedir. Bunun sebebi, fizyolojiksel kanıt açıkça aksine. Bununla birlikte, reaksiyon ürünü difüzyon ön gömme immünoperoksidaz yöntemi iyi bilinen bir sonucudur. Bu nedenle, bu yaklaşım genellikle istatistiksel güvenilir veriler vermez ve extrasynaptic membran 18,19,20,21 karşı sinaptik membran lokalizasyonu arasındaki ayrımı hariç tutabilir. üzerindeÖte yandan, fizyolojik ve anatomik veriler RGCs 3,5,7,9,22 üzerine AMPARs bir sinaptik lokalizasyonu ile uyumludur. Böylece, retina şerit sinaps glutamat reseptörleri ve MAGUKs postsinaptik değil, aynı zamanda perisynaptic veya extrasynaptic zar bölmelerine sadece lokalizedir. Ancak, retina şerit sinaps bu zar proteinlerinin yüksek çözünürlüklü kantitatif analiz hala ihtiyaç duyulmaktadır. Burada, kolera toksin altbirim B kullanılarak etiketli (CTB) sıçan RGCs üzerine sinaps bu proteinlerin sayısı, yoğunluğu ve değişkenliği tahmin izledi NMDAR alt birimden, Ampar alt birimlerin ve PSD-95 subsynaptic lokalizasyonu incelemek için bir postembedding EM immunogold tekniği geliştirdi retrograd izleme yöntemleri.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polisciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Milipor</td><td>AB1555P</td><td>Seyreltme 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Milipore</td><td>AB1557P</td><td>Seyreltme 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2 / 3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Seyreltme 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1 &ndash; 046</td><td>Seyreltme 1/100</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG-10 nm altın parçacıkları</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Seyreltme 1/20</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare IgG-10 nm altın parçacıkları</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Seyreltme 1/20</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare IgG-5 nm altın parçacıkları</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>Seyreltme 1/20</td></tr><tr><td>Eşek anti-keçi IgG-18 nm altın parçacıkları</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Seyreltme 1/20</td></tr><tr><td>Formvar-Karbon kaplı nikel yuvalı ızgaralar.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun sitrat</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sıvı azot&nbsp;</td><td>Roberts Oksijen Propan</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roberts Oksijen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>104</td><td>1 - %1.2</td></tr> <tr><td>Anti-CTB</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>703</td><td>Seyreltme 1/4.000</td></tr></tbody></table>

retina Şerit sinapslar at membran reseptör yüksek Çözünürlüklü sayısal immunogold analizi

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) bipolar hücrelerden uyarıcı glutamaterjik girdi alır. RGC'lerin sinaptik uyarılmasına postsinaptik olarak NMDA reseptörleri (NMDAR'lar) ve AMPA reseptörleri (AMPAR'lar) aracılık eder. Fizyolojik veriler, RGC'lerdeki glutamat reseptörlerinin sadece postsinaptikte değil, aynı zamanda perisinaptik veya ekstrasinaptik membran kompartmanlarında da eksprese edildiğini göstermiştir. Bununla birlikte, RGC sinapslarındaki glutamat reseptörleri için kesin anatomik yerler belirlenmemiştir. Merkezi sinapslardaki glutamat reseptörlerinin yüksek çözünürlüklü kantitatif analizi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu yaklaşımın retinada sadece sınırlı bir başarısı olmuştur. Membran reseptörlerinin analizi için gömme sonrası bir immünogold yöntemi geliştirdik ve bu reseptörlerin retinal şerit sinapslarında sayısını, yoğunluğunu ve değişkenliğini tahmin etmeyi mümkün kıldık. Burada, aşağıdakiler için gerekli olan araçları, reaktifleri ve pratik adımları açıklıyoruz: 1) retina fiksasyonunun başarılı bir şekilde hazırlanması, 2) donma ikamesi, 3) immünogold elektron mikroskobu (EM) immünositokimyası ve 4) şerit sinapslarında glutamat reseptörlerinin kantitatif görselleştirilmesi.

Daha önce 24,25 açıklandığı gibi burada sunulan sonuçlar, sıçan retina RGC dendritler üzerinde çarpıcı farklı subsynaptic lokalizasyon GluA 2/3 kalıplarını ve NMDARs göstermektedir. RGC dendritik profillerde GluA 2/3 immünolojik parçacıklarının% 77, merkezi sinapslara benzer PSD (Şekil 1A) içinde yer. Ancak, NMDARs ya sinaptik veya extrasynaptically bulunurdu. GluN2A immünolojik partiküllerin% 83 PSD lokalize edilmiştir (Şekil 1 c, 2a, 2b), te...

Gömme sonrası immünogold yöntemi, spesifik moleküllerin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlüklü analizlerini sağlamanın en etkili yollarından biridir. Burada, retinal şerit sinapslarında glutamat reseptörlerini kantitatif olarak analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Bu deneyin genel amacı, retinal şerit sinapslardaki membran proteinlerini kantitatif olarak analiz etmek için yeni bir yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntem, devre içindeki sinapslarda proteinlerin kesin konumu gibi retinal nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, retinal şerit sinapslardaki birden fazla proteinin sayısını, yoğunluğunu ve hızını tahmin edebilmesidir.NIDCD Gelişmiş Görüntüleme Çekirdeği'nden Ron Petralia ve Ya-Xian Wang ile dondurarak ikame prosedürünü ve ultra ince kesit alma işlemini gösteriyoruz. Bu prosedüre başlamak için, mikroskop altında bir göz küresini diseke edin. Bunun için öncelikle korneayı çıkarın.Ardından, lensi ve vitreusu pensle retina arası yüzeyden uzaklaştırın. Daha sonra, retina göz çukurundan izole olana kadar sklera tabakasını soyun. Retinayı hemen bir ustura ile 100 200 mikrometre kalınlığında şeritler halinde kesin.Ardından, retina şeritlerini 0,1 molar PB içindeki %4 paraformaldehit ile karıştırın. Daha sonra, oda sıcaklığında %4 paraformaldehit artı %0,01 glutaraldehit ile karıştırın. 0,15 milimolar kalsiyum klorür içeren PB ile birkaç kez yıkadıktan sonra, dondurarak yer değiştirme öncesinde retinal şeritleri 0,1 molar PB içindeki gliserol ile kriyokorunmaya alın. Donmuş dokuyu düz gömme tutucularına yerleştirmeden önce, şeffaf bir plastik levhadan ince bir daire kesin ve polimerize numune kutusunun işlem bittiğinde daha kolay çıkarılmasını sağlamak için her tutucunun tabanına yerleştirin.Şimdi, AFS'de otomatik diziyi ayarlayın. AFS'yi sıvı azot ile doldurun ve düz gömme tutucuları AFS'ye yerleştirin. Bunları metanol içinde %1,5 uranil asetat ile doldurun ve ön soğutma yapın.Retina şeritlerini 184 °C'deki sıvı propanda şok dondurmak için, örnekleri daldırma çubuklarının ucundaki metal desteklere yapıştırılmış küçük çift taraflı bant parçalarının üzerine yerleştirmek için ince bir fırça kullanın. Ardından, fırçayı kullanarak fazla tamponu emdirin. Çubukları yaklaşık beş saniye boyunca sıvı propanın içine daldırın.Ardından, bunları sıvı azotla doldurulmuş küçük bir taşıma haznesi kullanarak AFS'ye aktarın. Donmuş örneği ve pens ile bistüri gibi aletleri AFS'ye yerleştirdikten sonra, dokuya dokunmadan önce aletleri hazne içinde birkaç dakika boyunca soğutun. Alternatif olarak, aletlerin uçlarını sıvı azotla doldurulmuş küçük taşıma haznesine birkaç saniye daldırarak soğutun.Ardından, örneği ve bandı ince bir skalpel kullanarak stubdan çıkarın. Daha sonra, düz gömme alüminyum tutucunun yedi kuyucuğunun her birine, metanol içinde %1,5 uranil asetat ile birlikte ikişer adet dondurulmuş kesit yerleştirin. Bunları AFS içinde en az 32 saat boyunca 90 °C'de tutun.Ardından, otomatik sekansla sıcaklığı kademeli olarak 45 °C'ye yükseltin. Bundan sonra, örnekleri önceden soğutulmuş metanol ile üç kez yıkayın. Sonra, gömme ortamı olarak düşük sıcaklıklı gömme reçineleri ile örnekleri aşamalı olarak sızdırın.Ertesi gün, reçineyi tekrar değiştirin ve reçine seviyesini kuyucukların üst kenarına ulaşacak şekilde ayarlayın. AFS üzerindeki UV ışığını kurun ve AFS'deki örnekleri otomatik sekans bitene kadar UV ışığı ile polimerize edin. Ardından, örnekleri AFS'den çıkarın.Genellikle, numune blokları hâlâ bir miktar pembelik ve renk gösterir. Numuneleri oda sıcaklığında, gece boyunca veya tamamen şeffaf görünene kadar kimyasal çeker ocaktaki floresan ışığının yakınına yerleştirin. Bu adımda, bir ultramikrotom ile 70 nanometre kalınlığında ultra ince kesitler alın ve bunları formvar karbon kaplı nikel ızgaralar üzerinde toplayın.Izgaraları bir kez distile suyla, ardından üç kez TBS ile yıkayın. Sonra, ızgaraları TBS içinde %5 BSA içeren 20 microliters çözeltide 30 dakika, ardından keçi anti-CTB ve bir NMDAR alt birimine yönelik antikor içeren bir karışımın 20 microliters çözeltisinde oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Bunun ardından, ızgaraları her seferinde pH 7.6'da 20 microliters TBS ile üç kez yıkayın.Ardından, ızgaraları pH 8.2'de TBS ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. Izgaraları, 10 nanometre altın partiküllere bağlanmış eşek anti-tavşan IgG ve 18 nanometre altın partiküllere bağlanmış eşek anti-keçi IgG içeren 20 microliters'lık bir karışım ile iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, ızgaraları pH 7.6'da 20 microliters TBS ile üç kez yıkayın, ardından ultra saf su ile yıkayıp ızgaraları havada kurutun.Ardından, ızgaraları sekiz dakika boyunca distile su içindeki %5 uranil asetat ile, sonrasında ise karanlıkta beş dakika boyunca distile su içindeki %0,3 kurşun sitrat ile karşı boyamaya tabi tutun. Üçlü etiketleme deneyleri için ızgaraları, anti-keçi CTB, anti-fare PSD-95 ve anti-tavşan UN2A karışımından 20 µL ile oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Daha sonra ızgaraları, 18, 10 ve beş nm altın partiküllerle eşleşmiş IGG'lerden oluşan bir karışımdan 20 µL ile iki saat boyunca inkübe edin.Bu bölümde, önce ölçek çubuğunu ayarlayın. Ardından, ImageJ yazılımı ile bireysel RGC dendritlerinin PSD uzunluğunu ölçün. Sonra, plazma membranı için yedi ila dokuz nanometrelik ortalama kalınlığı temel alarak, membranın 10 nanometre yakınındaki altın partiküllerini sayın.Parçacık yoğunluğunu, doğrusal mikrometre başına düşen altın parçacık sayısı olarak hesaplayın. Ardından, her bir altın parçacığının merkezi ile sinaptik konum için PSD'nin ortası veya ekstra-sinaptik konum için PSD'nin kenarı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu görüntü, GluA2/3 ve CTB'nin çift immünogold etiketlemesini göstermektedir.Bu, presinaptik şerit ve küçük altın partikülleri RGC uzantılarının PSD'sinde kümelenmiştir. Bu görüntü, GluN2B ve CTB'nin çift immünogold etiketlemesini göstermektedir. Küçük altın partiküller ekstra-sinaptik plazma membranının üzerindedir.Ve bu görüntü, GluN2A ve CTB'nin çift immünogold markalamasını göstermektedir. GluA2/3'e benzer şekilde, küçük partiküller PSD içinde kümelenmiştir. GluN2A, PSD-95 ve CTB'nin üçlü immünogold markalaması burada gösterilmektedir.GluN2A altın partikülleri ve PSD-95 altın partikülleri, tekil CTB-pozitif RGC dendritlerindeki PSD içerisinde ko-lokalize olmuştur. Bu prosedürü uygularken, NMDA reseptörleri gibi bazı proteinlerin antijenitesinin güçlü ve uzun süreli fiksasyonla belirgin şekilde azaldığı nedeniyle, dokunun çok nazikçe fikse edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, retinal şerit sinapslarındaki membran proteinlerinin yüksek hassasiyetle nasıl tespit edileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir kavrayışa sahip olmalısınız.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Kaynak: Zhang, J., et al. Retinal Şerit Sinapslarında Membran Reseptörlerinin Yüksek Çözünürlüklü Kantitatif İmmünogold Analizi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, retinal sinapslarda nörotransmitter reseptör lokalizasyonunu görselleştirmek için bir elektron mikroskobu tekniğini göstermektedir. Retina bölümleri, membrana bağlı nörotransmitter reseptörleri sergileyen ve kolera toksin alt birimi B (CTB) ile işaretlenmiş retinal ganglion hücreleri içerir. İşaretleyiciler altın nanopartikül konjuge...

Retinal Sinapslarda Nörotransmitter Reseptörlerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Bu makale, nörotransmitter reseptörlerinin ekspresyonunun nasıl ölçülebileceğini ve optogenetik araçların viral transdüksiyonu ve donma-kırık replika immünoetiketleme tekniğinin bir kombinasyonu kullanılarak tanımlanmış presinaptik ve postsinaptik elementlerle sinapslarda analiz edilen modeli göstermektedir.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin, retinal şerit sinapslarındaki membran proteinlerini yüksek çözünürlüklü sayısal immunogold yöntemiyle nicel olarak analiz etmeyi. Bu teknik, glutamat reseptörlerinin sinaptik lokalizasyonunu hassas şekilde belirlemenizi sağlar.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Daha fazla video keşfet