Name: Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin, genetik kodlanmış voltaj göstergeleriyle membran potansiyeli değişimlerini optik olarak görüntüleme yöntemini. FRET tabanlı problarla ratiometrik görüntüleme yaparak sinir aktivitesini gerçek zamanlı izleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı Hibe WCI 2009-003 ve Kore Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Kurumsal Program Projesi 2E24210 tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı'nın World Class Institute (WCI) programı tarafından desteklenmiştir. Sungmoo Lee, Milli Eğitim Bakanlığı'na (MOE, Kore) bağlı Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Küresel Doktora Burs programı (NRF-2013H1A2A1033344) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246, 508-509 (1973).</li>
<li>Cohen, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+axon+fluorescence+during+activity%3A+molecular+probes+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential.</a> J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).</li>
<li>Tasaki, I., Warashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-membrane+interaction+and+its+changes+during+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation.</a> Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).</li>
<li>Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75, 779-785 (2012).</li>
<li>Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154, 904-913 (2013).</li>
<li>St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).</li>
<li>Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+mutagenesis+of+the+voltage-sensing+domain+enables+the+optical+resolution+of+action+potentials+firing+at+60+Hz+by+a+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential.</a> J Neurosci. 35, 372-385 (2015).</li>
<li>Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+length+and+fusion+site+composition+improve+the+optical+signal+of+genetically+encoded+fluorescent+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophoton%22%5BJournal%5D)">Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors.</a> Neurophoton. 2, 021012(2015).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+an+enhanced+fluorescent+protein+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor.</a> PLoS One. 2, e440(2007).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).</li>
<li>Sung, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+fast+fluorescent+protein+voltage+sensors+by+optimizing+FRET+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions.</a> PLoS One. 10, e0141585(2015).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nat Methods. 9, 90-95 (2012).</li>
<li>Flytzanis, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaerhodopsin+variants+with+enhanced+voltage-sensitive+fluorescence+in+mammalian+and+Caenorhabditis+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons.</a> Nat Commun. 5, 4894(2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nat Methods. 11, 825-833 (2014).</li>
<li>Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+spiking+in+brain+tissue+using+FRET-opsin+protein+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors.</a> Nat Commun. 5, 3674(2014).</li>
<li>Zou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+fast+multicoloured+voltage+reporters+via+electrochromic+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET.</a> Nat Commun. 5, 4625(2014).</li>
<li>Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+approach+to+measuring+electrical+activity+in+genetically+specified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons.</a> Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).</li>
<li>Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+eGFP-F+expressing+neurons+in+chicken+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices.</a> J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+JC+%22Methods+in+Cell+Biology+Volume+81%22">Methods in Cell Biology Volume 81</a>. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+clamping%3A+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology%22">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).</li>
<li>Osorio, N., Delmas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+enteric+neurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from enteric neurons in situ.</a> Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+shot+noise+limits+on+optical+detection+of+neuronal+spikes+and+estimation+of+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing.</a> Biophys J. 104, 51-62 (2013).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3, e2514(2008).</li>
<li>Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage in neurons.</a> Neuron. 69, 9-21 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

sinir sistemi çeşitli yollarla voltaj inhibisyon hafif hiperpolarizasyon, sinaptik girişi nispeten büyük bir gerilim değişikliği hafif bir depolarizasyonu ve hareket potansiyeli sonuçlar neden olur kullanır. GeViS tarafından membran potansiyeli değişiklikleri ölçmek yeteneği aynı anda nöronal devrelerin çeşitli bileşenleri analiz umut verici bir potansiyel sunmaktadır. Bu yazıda GeViS kullanarak membran potansiyelindeki görüntüleme değişiklikler için temel bir yöntem ortaya koymaktadır. Geri...

Bu çalışmanın temel odak noktası genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri kullanılarak in vitro membran potansiyelleri değişikliklerin optik görüntüleme göstermektir. membran potansiyeli Görüntüleme değişiklikleri nöronal devrelerin aktivitesini okuyan heyecan verici imkanı sunar. Bir floresan yoğunluğu değişikliği membran potansiyeli sonuç değişiklikler, kameranın her bir piksel nöronal aktivitenin nonintrusive ölçümlerini sağlayan bir vekil elektrot olduğunda. Kırk yıl boyunca, organik voltaja duyarlı boyalar 1-4 zardaki potansiyel değişimlerinin gözlemlemek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, bu boyalar, selüler özgüllük yoksundur. Buna ek olarak, bazı hücre türleri leke zordur. Genetik olarak kodlanmış gerilim göstergeleri (GeViS) hücreleri, özellikle çalışılan floresan voltaja duyarlı prob ifade edilecek olan bu sınırlamaları aşmak. GeViS üç sınıf vardır. GeVi birinci sınıf vo kullanırTek bir floresan proteini (FP) 5-9 veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) çifti 10-12 biriyle voltaj algılama fosfataz alan adını ltage algılama. Sensörlerin ikinci sınıf bir floresan göstergesi doğrudan 13-15 veya elektrokromik FRET 16,17 aracılığıyla mikrobiyal rodopsin kullanır. Üçüncü sınıf iki bileşeni, bir zara bağlı AP ve zara bağlı söndürme boyasının 18-20 olan bir ikinci bileşen olan genetik bileşen kullanır. İkinci ve üçüncü sınıf nitro ve kesiti deneyleri 19,20 olarak yararlı olsa da, sensör, sadece birinci sınıf an in vivo 6 analizleri için de yararlıdır. Bu yazıda in vitro GeViS ilk sınıfını (Şekil 1) kullanılarak membran potansiyelinin görüntüleme gösterecektir. Gerilim sensörlerinin Bu birinci sınıf in vivo görüntüleme geçiş için en kolay yoldur. GeViS u yanayaklaşık sensörlerin rodopsin sınıfından daha parlak 50 kat bir FP kaynaşmış bir gerilim algılayan bölge olan tilizing, onlar ark lambası aydınlatma kullanılarak yerine son derece güçlü bir lazer gerektiren görüntülü olabilir. parlaklık eşitsizlik diğer sonucu GeViS birinci sınıf kolayca beynin otomatik floresan aşabilir olmasıdır. rodopsin tabanlı sondalar olamaz. Sensörün üçüncü sınıf birinci sınıf kadar parlak fakat in vivo olarak uygulanması zor bir kimyasal söndürücü eklenmesini gerektirir. Bu nedenle biz, tek bir FP (Bongwoori) 8 bir FRET çiftinin oluşan bir prob (Nabi 2) 12, bir probun satın gösterecektir. Nabi 2.242 ve Nabi 2,244 adlandırılan yeşil fluoresan verici, yonca oluşan 11 ve kırmızı flüoresan alıcıya, mRuby2, - VSFP-CR (yonca mRuby2 voltaja duyarlı flüoresan protein) kelebek versiyonları FRET bu raporda yapılarıdır <s&gt; 12 kadar. Kayıtların bu tür tanıtım araştırmacılara sağlayabilir bilgi GeViS türü daha iyi fikir verecektir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Şekil 1. Bu Rapor (A) görüntülenmistir Genetik kodlanmış Gerilim Göstergeleri (GeViS) bir trans-membran voltaj algılama alanını ve bir floresan proteini olan GeVi dayalı bir mono FP İki Türleri. (B) trans-membran voltaj algılama etki, bir FRET verici ve alıcı oluşan bir FRET tabanlı GeVi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X objektif lensi (sayısal açıklık = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Uyarma filtresi</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Bongwoori Dikroik aynada süper ekliptik pHluorin'in voltaj görüntülemesi için</td></tr><tr><td></td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Xenon ark lambası</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Aydınlatıcı</td><td>LED'ler ve lazerler de etkili ışık kaynaklarıdır</td></tr><tr><td>Yavaş hızlı CCD kamera</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Çift portlu kamera adaptörü</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı CCD kamera</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Uyarma filtresi</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Clover ve mRuby2'den oluşan FRET çifti tabanlı GEVI'nin voltaj görüntülemesi için)</td></tr><tr><td>Dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Titreşim izolasyon sistemi</td><td>Kinetik sistemler</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Yama odası</td><td>Warner aletleri</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Mikro Kapak Camı (22 x 40 mm)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm çapında cam lamel</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofeksiyon ajanı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum fosfat reaktifi</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi amplifikatörü</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB amplifikatörü</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı veri toplama yazılımı</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü toplama ve analiz yazılımı</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet uygulama yazılımı</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Veri analizi yazılımı</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Büyüteç</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem standart kamera bağlayıcı 0.38x SC38 J kelepçe</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R konfokal mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Solma önleyici reaktif</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

genetik kodlanmış floresan gerilim sensörleri İki türleri ile potansiyel görüntüleme membran

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri (GEVI'ler), in vivo kayıtlar için yararlı olmaya başladıkları noktaya kadar gelişmiştir. Nihai amaç nöronal aktiviteyi in vivo olarak görüntülemek olsa da, başarılı in vivo preparatları sağlamak için tek bir hücrenin aktivitesini görüntüleyebilmek gerekir. Bu prosedür, sonunda in vivo olarak görüntülemek için bir temel sağlamak üzere tek bir hücrede zar potansiyelinin nasıl görüntüleneceğini açıklayacaktır. Burada, in vitro olarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) yapabilen tek bir floresan proteine (FP) veya iki floresan proteine kaynaşmış bir voltaj algılama alanından oluşan GEVI'leri görüntüleme yöntemlerini açıklıyoruz. Bir görüntü ayırıcı kullanmak, iki farklı dalga boyu tarafından oluşturulan görüntülerin aynı şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerasına aynı anda yansıtılmasını sağlar. Görüntü ayırıcı, ışık yoluna ikinci bir filtre küpü yerleştirir. Bu ikinci filtre küpü, GEVI'nin FP'lerine bağlı olarak verici ve alıcı floresan dalga boylarını ayırmak için bir dikroik ve iki emisyon filtresinden oluşur. Bu kurulum, hem alıcı hem de verici floresan ortaklarının aynı anda kaydedilmesini sağlarken, membran potansiyeli tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonu aracılığıyla manipüle edilir. Tek bir FP'den oluşan bir GEVI kullanırken, ikinci filtre küpü çıkarılabilir, böylece görüntü ayırıcıdaki aynalar CCD kameraya tek bir görüntü yansıtabilir.

Geçici olarak transfekte hücrelerde anlamlı floresan değişimi ve plazma membranı ifade derecesi sergileyebilirler. Hatta aynı lamel bazı hücreler iç floresan çeşitli düzeylerde olacaktır. Bu durum, hücre tarafından emilen transfeksiyon ajanı miktarı muhtemeldir. Bazen çok fazla ifade apoptosis 27 sonuçlanan gelişeceğini protein yanıt yaşamaya hücreyi neden (parlak, yüksek iç floresan ile, hücreler yuvarlak). deneyci, bu nedenle iç ifade gürültü oranı (SNR) sinyali düşürür duya...

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış bir voltaj indikatörü ile membran potansiyeli değişimlerini optik olarak raporlamaktır. Bu yöntem, farklı genetik kodlu floresan voltaj probları ile görüntülemenin güçlü ve zayıf yönlerini açıklayacaktır. Örneğin, FRET tabanlı problar rasyometrik görüntüleme avantajı sunacak ancak daha düşük bir sinyal verecektir.Bu tekniğin temel avantajı, nöral aktiviteyi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sinyal-gürültü oranının çok yüksek olmaması, çeşitli gürültü kaynaklarının bulunması ve hata oluşabilecek çok sayıda adımın yer alması nedeniyle zorluk yaşarlar. Yeni kullanıcılar sıklıkla kafa karışıklığı yaşamakta ve interferans gerçek sinyallerle karıştırılmaktadır.Kullanılan probların geçerliliğini ve gerçekte neyi belirttiğini belirlemek için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Kurulum için, FRET tabanlı GEVI görüntülemesi amacıyla yavaş ve hızlı CCD kameralar arasına bir görüntü ayırıcı yerleştirilir. Deneyden önce, görüntü ayırıcıya dikroik aynalı ve iki emisyon filtreli bir filtre küpü yerleştirin.Tek bir floresan protein içeren bir GEVI görüntülenirken bu ikinci filtre küpünü çıkarın. Deneye başlamak için, iç floresansa kıyasla güçlü ve lokalize membran floresansı gösteren sağlıklı bir HEK293 hücresi bulun; bölünen veya ölen hücreler oldukları için dairesel hücrelerin yamalanmasından kaçının. Ardından, akım yanıtını kontrol etmek için bir test palsi uygulayın.Ardından, patch clamp pipetini hücre yüzeyinin hemen üzerine indirin. Daha sonra, pipeti hücre membranına hafifçe değene kadar yavaşça indirin. Membran direnci bir ila iki megaohm değerine yükselmelidir.Ardından, pipet aracılığıyla nazikçe negatif basınç uygulayarak gigaohm sızdırmazlığı sağlayın. Gigaohm sızdırmazlık sağlandığında, pipet potansiyelini istenen tutma potansiyeline ayarlayın. Sonra, yüksek hızlı CCD kamerasını hücre gövdesine odaklayın.FRET tabanlı GEVI kaydı için, görüntü ayırıcı üzerindeki düğmeleri kullanarak, her emisyon dalga boyu için eşit aralıklı bir görünüm elde edecek şekilde bölünmüş görüntülerin boyutunu ayarlayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için negatif basınç uygulayarak hücre membranını yırtın. Şimdi, görüntüleme yazılımını açın.Ardından, CCD görüntüleme sayfasını açmak için SciMeasure kamera menüsündeki acquire seçeneğine tıklayın. Daha sonra, kaydı kaydetmek için yeni bir veri dosyası oluşturun. Görüntülemeyi gerçekleştirmek amacıyla bir darbe protokol dosyası açmak için analog output ve ardından read an ASCII seçeneklerine tıklayın.Ardından, deneme sayısını ortalamak için dahili tekrarları ortalayıp (average) tıklayın. Daha sonra analog çıkış sayfasını kapatın. CCD kazanım sayfasında spesifik kazanım parametrelerini ayarlayın.Ardından, veri toplama için kare sayısı ve deneme sayısı için spesifik değerleri girin. Sonra, kaydı başlatmak için "take data optics plus BNC" düğmesine tıklayın. Voltaj görüntüleme gerçekleşirken, kayıt boyunca stabil tüm hücre konfigürasyonunu sağlamak için osiloskobu izleyin.Fraksiyonel floresan değişimini hesaplamak için önce file (dosya) ve ardından read data file (veri dosyasını oku) seçeneğine tıklayarak önceki adımda kaydedilen bir veri dosyasını açın. Hücre görüntüsü, dinlenme ışık yoğunluğunda sağ tarafta görünmelidir. Ardından, mevcut uç voltaj değerlerini görüntülemek için show BNC's (BNC'leri göster) seçeneğine tıklayın.Yanıt veren optik sinyallere sahip pikselleri tanımlamak için kare çıkarma işlevinden yararlanmak amacıyla, sayfa modunu RLI çerçevesinden kare çıkarmaya değiştirin. Ardından, çıkarma işlemi için iki zaman noktası seçin ve membran potansiyeli değişimine yanıt olarak sinyaller gösteren hücre alanını belirleyin. Son olarak, her bir piksele tıklayarak veya sürükleyerek analiz edilmesi gereken pikselleri tanımlayın.Seçilen piksellerden elde edilen ortalama floresans yoğunluğunun grafiksel gösterimi, yazılım penceresinin sol tarafında görünmelidir. Fraksiyonal floresans değişim değerlerini elde etmek için "divide by RLI" butonuna tıklayarak, çıkarılan pikselleri dinlenme ışık yoğunluğuna bölün. Verileri dışa aktarmak için, "show BNC" menüsünün işaretini kaldırarak mevcut uç voltaj grafiklerini kaldırın.Eğri uydurma analizi için floresan izini bir ASCII dosya formatında dışa aktarmak amacıyla çıktıya gidin ve izleri görüntülenen ASCII olarak kaydedin. Bu prosedürde, bir veri analiz programında voltaja yanıt olarak fraksiyonal floresan değişimlerini grafiğe dökerek voltaja karşı floresan değişim grafiğini çizin. Ardından, analiz, uydurma, sigmoidal uydurma seçeneklerine tıklayıp diyalog penceresini açarak, optik sinyalin voltaj aralığını belirlemek için eğriyi bir Boltzmann fonksiyonuna uydurun.Veri analiz programını kullanarak, voltaja yanıt olarak meydana gelen normalize edilmiş fraksiyonel floresans değişimlerini yeniden çizin. Optik yanıtın hızını hesaplamak için ASCII dosyasını açın ve fraksiyonel floresans değişim izini zamana karşı grafiğe dökün. Ardından, veri analiz yazılımındaki veri seçiciye tıklayın ve basamaklı voltaj pulsunun başlangıcına karşılık gelen bir zaman noktası ile optik sinyalin kararlı duruma ulaştığı ikinci bir zaman noktasını seçin.Analiz, uyumlama, eksponansiyel uyumlama seçeneklerine tıklayıp ardından iletişim kutusunu açarak bu aralığı hem tekli hem de çiftli eksponansiyel azalma fonksiyonuna uydurun ve daha iyi olan uyumlama sonucunu bildirin. Bu şekil, tek bir FP tabanlı GEVI Bongwoori eksprese eden bir HEK hücresinin floresans değişimini göstermektedir. Bu, kademeli voltaj darbelerine yanıt olarak meydana gelen tipik bir floresans değişimidir.Burada bir HEK293 hücresi, yüksek hızlı bir CCD kamera ile görüntülenmiştir. Bu görüntü, Bongwoori eksprese eden bir hücrenin dinlenme halindeki ışık yoğunluğunu göstermektedir. Bu ise floresan değişiminin gözlemlendiği pikselleri belirten bir kare çıkarma görüntüsüdür.Burada, Bongwoori eksprese eden fare hipokampal primer nöronlarından indüklenen aksiyon potansiyellerinin optik kaydı gösterilmektedir. Aksiyon potansiyelleri, tüm hücre akım klembi (whole-cell currents clamp) modunda uyarılmıştır. Fraksiyonel floresans değişim izi, soma ile ilişkili piksellerden seçilmiştir.Bu şekilde, FRET tabanlı GEVI eksprese eden bir HEK hücresinin floresan değişimi, iki farklı dalga boyunda basamaklı voltaj palslarına verilen yanıtları göstermektedir. Kayıtlar, yüksek hızlı bir CCD kamera ile bir kilohertz hızında alınmıştır. Bu prosedür uygulanırken, floresan aşırı ekspresyonu hücre sağlığını etkileyebileceği için değişken floresan seviyelerinin test edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Bu prosedürün ardından, çeşitli devrelerin nöron aktivitelerini içeren ek soruları yanıtlamak amacıyla dilimleyici kodlamaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı prob türlerini kullanarak membran potansiyelinin nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Dış elektrik alan bir hücre zarı üzerinde bir gerilim indükler kaynaklı membran gerilimi (ΔΦ) olarak adlandırılır. Potansiyometrik boya di-8-ANEPPS kullanarak, noninvaziv ΔΦ ölçmek mümkündür. Bu video ölçmek için protokol gösterir ΔΦ di-8-ANEPPS kullanarak.

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Burada özellikle ventriküler benzeri indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes içinde optik görüntü Aksiyon potansiyelleri, bir yöntem mevcut. Bu yöntem bir voltaj duyarlı floresan protein organizatörü tahrik ifade üzerinde dayanır.

Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Öğrenin, genetik kodlanmış voltaj göstergeleriyle membran potansiyeli değişimlerini optik olarak görüntüleme yöntemini. FRET tabanlı problarla ratiometrik görüntüleme yaparak sinir aktivitesini gerçek zamanlı izleyin.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Daha fazla video keşfet