Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış bir voltaj indikatörü ile membran potansiyeli değişimlerini optik olarak raporlamaktır. Bu yöntem, farklı genetik kodlu floresan voltaj probları ile görüntülemenin güçlü ve zayıf yönlerini açıklayacaktır. Örneğin, FRET tabanlı problar rasyometrik görüntüleme avantajı sunacak ancak daha düşük bir sinyal verecektir.

Bu tekniğin temel avantajı, nöral aktiviteyi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sinyal-gürültü oranının çok yüksek olmaması, çeşitli gürültü kaynaklarının bulunması ve hata oluşabilecek çok sayıda adımın yer alması nedeniyle zorluk yaşarlar. Yeni kullanıcılar sıklıkla kafa karışıklığı yaşamakta ve interferans gerçek sinyallerle karıştırılmaktadır.

Kullanılan probların geçerliliğini ve gerçekte neyi belirttiğini belirlemek için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Kurulum için, FRET tabanlı GEVI görüntülemesi amacıyla yavaş ve hızlı CCD kameralar arasına bir görüntü ayırıcı yerleştirilir. Deneyden önce, görüntü ayırıcıya dikroik aynalı ve iki emisyon filtreli bir filtre küpü yerleştirin.

Tek bir floresan protein içeren bir GEVI görüntülenirken bu ikinci filtre küpünü çıkarın. Deneye başlamak için, iç floresansa kıyasla güçlü ve lokalize membran floresansı gösteren sağlıklı bir HEK293 hücresi bulun; bölünen veya ölen hücreler oldukları için dairesel hücrelerin yamalanmasından kaçının. Ardından, akım yanıtını kontrol etmek için bir test palsi uygulayın.

Ardından, patch clamp pipetini hücre yüzeyinin hemen üzerine indirin. Daha sonra, pipeti hücre membranına hafifçe değene kadar yavaşça indirin. Membran direnci bir ila iki megaohm değerine yükselmelidir.

Ardından, pipet aracılığıyla nazikçe negatif basınç uygulayarak gigaohm sızdırmazlığı sağlayın. Gigaohm sızdırmazlık sağlandığında, pipet potansiyelini istenen tutma potansiyeline ayarlayın. Sonra, yüksek hızlı CCD kamerasını hücre gövdesine odaklayın.

FRET tabanlı GEVI kaydı için, görüntü ayırıcı üzerindeki düğmeleri kullanarak, her emisyon dalga boyu için eşit aralıklı bir görünüm elde edecek şekilde bölünmüş görüntülerin boyutunu ayarlayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için negatif basınç uygulayarak hücre membranını yırtın. Şimdi, görüntüleme yazılımını açın.

Ardından, CCD görüntüleme sayfasını açmak için SciMeasure kamera menüsündeki acquire seçeneğine tıklayın. Daha sonra, kaydı kaydetmek için yeni bir veri dosyası oluşturun. Görüntülemeyi gerçekleştirmek amacıyla bir darbe protokol dosyası açmak için analog output ve ardından read an ASCII seçeneklerine tıklayın.

Ardından, deneme sayısını ortalamak için dahili tekrarları ortalayıp (average) tıklayın. Daha sonra analog çıkış sayfasını kapatın. CCD kazanım sayfasında spesifik kazanım parametrelerini ayarlayın.

Ardından, veri toplama için kare sayısı ve deneme sayısı için spesifik değerleri girin. Sonra, kaydı başlatmak için "take data optics plus BNC" düğmesine tıklayın. Voltaj görüntüleme gerçekleşirken, kayıt boyunca stabil tüm hücre konfigürasyonunu sağlamak için osiloskobu izleyin.

Fraksiyonel floresan değişimini hesaplamak için önce file (dosya) ve ardından read data file (veri dosyasını oku) seçeneğine tıklayarak önceki adımda kaydedilen bir veri dosyasını açın. Hücre görüntüsü, dinlenme ışık yoğunluğunda sağ tarafta görünmelidir. Ardından, mevcut uç voltaj değerlerini görüntülemek için show BNC's (BNC'leri göster) seçeneğine tıklayın.

Yanıt veren optik sinyallere sahip pikselleri tanımlamak için kare çıkarma işlevinden yararlanmak amacıyla, sayfa modunu RLI çerçevesinden kare çıkarmaya değiştirin. Ardından, çıkarma işlemi için iki zaman noktası seçin ve membran potansiyeli değişimine yanıt olarak sinyaller gösteren hücre alanını belirleyin. Son olarak, her bir piksele tıklayarak veya sürükleyerek analiz edilmesi gereken pikselleri tanımlayın.

Seçilen piksellerden elde edilen ortalama floresans yoğunluğunun grafiksel gösterimi, yazılım penceresinin sol tarafında görünmelidir. Fraksiyonal floresans değişim değerlerini elde etmek için "divide by RLI" butonuna tıklayarak, çıkarılan pikselleri dinlenme ışık yoğunluğuna bölün. Verileri dışa aktarmak için, "show BNC" menüsünün işaretini kaldırarak mevcut uç voltaj grafiklerini kaldırın.

Eğri uydurma analizi için floresan izini bir ASCII dosya formatında dışa aktarmak amacıyla çıktıya gidin ve izleri görüntülenen ASCII olarak kaydedin. Bu prosedürde, bir veri analiz programında voltaja yanıt olarak fraksiyonal floresan değişimlerini grafiğe dökerek voltaja karşı floresan değişim grafiğini çizin. Ardından, analiz, uydurma, sigmoidal uydurma seçeneklerine tıklayıp diyalog penceresini açarak, optik sinyalin voltaj aralığını belirlemek için eğriyi bir Boltzmann fonksiyonuna uydurun.

Veri analiz programını kullanarak, voltaja yanıt olarak meydana gelen normalize edilmiş fraksiyonel floresans değişimlerini yeniden çizin. Optik yanıtın hızını hesaplamak için ASCII dosyasını açın ve fraksiyonel floresans değişim izini zamana karşı grafiğe dökün. Ardından, veri analiz yazılımındaki veri seçiciye tıklayın ve basamaklı voltaj pulsunun başlangıcına karşılık gelen bir zaman noktası ile optik sinyalin kararlı duruma ulaştığı ikinci bir zaman noktasını seçin.

Analiz, uyumlama, eksponansiyel uyumlama seçeneklerine tıklayıp ardından iletişim kutusunu açarak bu aralığı hem tekli hem de çiftli eksponansiyel azalma fonksiyonuna uydurun ve daha iyi olan uyumlama sonucunu bildirin. Bu şekil, tek bir FP tabanlı GEVI Bongwoori eksprese eden bir HEK hücresinin floresans değişimini göstermektedir. Bu, kademeli voltaj darbelerine yanıt olarak meydana gelen tipik bir floresans değişimidir.

Burada bir HEK293 hücresi, yüksek hızlı bir CCD kamera ile görüntülenmiştir. Bu görüntü, Bongwoori eksprese eden bir hücrenin dinlenme halindeki ışık yoğunluğunu göstermektedir. Bu ise floresan değişiminin gözlemlendiği pikselleri belirten bir kare çıkarma görüntüsüdür.

Burada, Bongwoori eksprese eden fare hipokampal primer nöronlarından indüklenen aksiyon potansiyellerinin optik kaydı gösterilmektedir. Aksiyon potansiyelleri, tüm hücre akım klembi (whole-cell currents clamp) modunda uyarılmıştır. Fraksiyonel floresans değişim izi, soma ile ilişkili piksellerden seçilmiştir.

Bu şekilde, FRET tabanlı GEVI eksprese eden bir HEK hücresinin floresan değişimi, iki farklı dalga boyunda basamaklı voltaj palslarına verilen yanıtları göstermektedir. Kayıtlar, yüksek hızlı bir CCD kamera ile bir kilohertz hızında alınmıştır. Bu prosedür uygulanırken, floresan aşırı ekspresyonu hücre sağlığını etkileyebileceği için değişken floresan seviyelerinin test edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu prosedürün ardından, çeşitli devrelerin nöron aktivitelerini içeren ek soruları yanıtlamak amacıyla dilimleyici kodlamaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı prob türlerini kullanarak membran potansiyelinin nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.