Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran
4 Şubat 2016
Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.
Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış bir voltaj göstergesi ile membran potansiyel değişikliklerini optik olarak raporlamaktır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış farklı floresan voltaj probları ile görüntülemenin güçlü ve zayıf yönlerini tanımlayacaktır. Örneğin, FRET tabanlı problar oransal görüntüleme avantajı sunacak ancak daha düşük bir sinyal verecektir.
Bu tekniğin temel avantajı, sinirsel aktiviteyi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilmemizdir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, sinyal-gürültü oranı çok büyük olmadığından ve birkaç gürültü kaynağı ve yanlış gidebilecek birden fazla adım olduğundan mücadele edeceklerdir. Yeni kullanıcıların kafası genellikle karışır ve parazit gerçek sinyaller olarak alınır.
Bu yöntemin görsel gösterimi, kullanılan probların geçerliliğini ve gerçekte neyi gösterdiğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Kurulum için, FRET tabanlı GEVI'nin görüntülenmesi için yavaş ve hızlı CCD kameralar arasına bir görüntü ayırıcı yerleştirilmiştir. Deneyden önce, görüntü ayırıcıya dikroik aynalı bir filtre küpü ve iki emisyon filtresi yerleştirin.
Tek bir floresan proteini içeren bir GEVI'yi görüntülerken bu ikinci filtre küpünü çıkarın. Deneye başlamak için, iç floresansa kıyasla güçlü, lokalize membran floresansı gösteren sağlıklı bir HEK293 hücresi bulun ve dairesel hücrelerin bölünürken veya ölürken yamalanmasını kaçının. Ardından mevcut yanıtı kontrol etmek için bir test darbesi uygulayın.
Daha sonra, yama kelepçesi pipetini hücre yüzeyinin hemen üzerine indirin. Ardından, pipeti hücre zarına hafifçe dokunana kadar yavaşça indirin. Membran direnci bir ila iki megaohm'a yükselmelidir.
Bundan sonra, pipetten hafifçe negatif basınç uygulayarak bir gigaohm contası oluşturun. Bir gigaohm sızdırmazlık elde edildiğinde, pipet potansiyelini istenen tutma potansiyeline ayarlayın. Ardından, yüksek hızlı CCD kamerayı hücre gövdesine odaklayın.
FRET tabanlı GEVI kaydı için, görüntü ayırıcı üzerindeki düğmeleri kullanarak her emisyon dalga boyu için eşit aralıklı bir görünüm elde etmek için bölünmüş görüntülerin boyutunu ayarlayın. Daha sonra tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için negatif basınç uygulayarak hücre zarını yırtın. Şimdi, görüntüleme yazılımını açın.
Ardından, CCD edinme sayfasını açmak için SciMeasure kamera edinme menüsüne tıklayın. Ardından, kaydı kaydetmek için yeni bir veri dosyası oluşturun. Analog çıkışa tıklayın ve ardından görüntülemeyi gerçekleştirmek için bir darbe protokolü dosyası açmak için bir ASCII okuyun.
Ardından, deneme sayısının ortalamasını almak için dahili tekrarların ortalamasını alın. Ardından analog çıkış sayfasını kapatın. CCD edinme sayfasında belirli edinme parametrelerini ayarlayın.
Bundan sonra, alım için çerçeve sayısı ve deneme sayısı için belirli değerleri girin. Ardından, kaydı başlatmak için veri optiği artı BNC al düğmesine tıklayın. Voltaj görüntüleme gerçekleşirken, kayıt boyunca kararlı tüm hücre konfigürasyonunu sağlamak için osiloskopu izleyin.
Kesirli floresan değişimini hesaplamak için, önceki adımda kaydedilmiş bir veri dosyasını açmak için dosyayı ve ardından veri dosyasını oku'yu tıklatın. Dinlenme ışığı yoğunluğundaki hücre görüntüsü sağ tarafta görülmelidir. Ardından, mevcut bitiş voltajı değerlerini göstermek için BNC'leri göster'e tıklayın.
Duyarlı optik sinyallere sahip pikselleri tanımlamak için kare çıkarma işlevini kullanmak için sayfa modunu RLI karesinden kare çıkarmaya değiştirin. Ardından, çıkarma için iki zaman noktası seçin ve zar potansiyel değişikliğine yanıt olarak sinyalleri gösteren hücre alanını belirleyin. Ardından, her pikseli sürükleyerek veya tıklayarak analiz edilmesi gereken pikselleri belirleyin.
Seçilen piksellerden gelen ortalama floresan yoğunluğunun grafiksel gösterimi, yazılım penceresinin sol tarafında görünmelidir. Fraksiyonel floresan değişim değerlerini elde etmek için RLI'nin düğmesine tıklayarak çıkarılan pikselleri dinlenme ışığı yoğunluğuna bölün. Verileri dışa aktarmak için, BNC'nin menüsünü göster seçeneğinin işaretini kaldırarak mevcut bitiş voltajı grafiklerini kaldırın.
Çıktıya gidin, floresan izini eğri uydurma analizi için bir ASCII dosya biçiminde dışa aktarmak için izleri ASCII'de görüntülendiği gibi kaydedin. Bu prosedürde, bir veri analiz programında voltaja yanıt olarak fraksiyonel floresan değişikliklerini çizerek floresan değişimine karşı voltaj grafiğini çizin. Bundan sonra, analiz, uydurma, sigmoidal uyum ve ardından diyaloğu açarak optik sinyalin voltaj aralığını belirlemek için eğriyi bir Boltzmann fonksiyonuna uydurun.
Veri analiz programını kullanarak voltaja yanıt olarak normalleştirilmiş fraksiyonel floresan değişikliklerini yeniden düzenleyin. Optik yanıtın hızını hesaplamak için ASCII dosyasını açın ve zamana karşı fraksiyonel floresan değişim izini çizin. Ardından veri analiz yazılımındaki veri seçiciye tıklayın ve kademeli bir voltaj darbesinin başlangıcına karşılık gelen bir zaman noktası ve optik sinyalin sabit duruma ulaştığı ikinci bir zaman noktası seçin.
Analiz, uydurma, üstel sığdırma'ya tıklayarak bu aralığı hem tek hem de çift üstel bozunma fonksiyonuna sığdırın, ardından iletişim kutusunu açın ve daha iyi uyumu bildirin. Bu şekil, tek bir FP tabanlı GEVI Bongwoori'yi ifade eden bir HEK hücresinin floresan değişimini göstermektedir. Bu, kademeli voltaj darbelerine yanıt olarak tipik bir floresan değişikliğidir.
Burada bir HEK293 hücresi yüksek hızlı bir CCD kamera ile görüntülendi. Bu görüntü, Bongwoori'yi ifade eden bir hücrenin dinlenme ışığı yoğunluğunu göstermektedir. Ve bu, floresan değişiminin gözlemlendiği pikselleri gösteren bir çerçeve çıkarma görüntüsüdür.
Burada gösterilen, Bongwoori'yi eksprese eden fare hipokampal birincil nöronlarından indüklenen aksiyon potansiyellerinin optik kaydıdır. Aksiyon potansiyelleri, tüm hücre akımları kelepçe modu altında uyarıldı. Fraksiyonel floresan değişim izi, soma ile ilişkili piksellerden seçildi.
Bu şekilde, FRET tabanlı GEVI'yi eksprese eden bir HEK hücresinin floresan değişimi, iki dalga boyunda kademeli voltaj darbelerine verilen yanıtları göstermektedir. Yüksek hızlı CCD kamera ile bir kilohertz'de kaydedildi. Bu prosedürü denerken, değişken floresan seviyelerini test etmeyi unutmamak önemlidir, çünkü floresanın aşırı ekspresyonu hücrenin sağlığını etkileyebilir.
Bu prosedürü takiben, çeşitli devrelerin nöron aktivitesini içeren ek soruları yanıtlamak için dilimleyici kodlamaları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı prob türleri kullanarak membran potansiyelinin nasıl görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanarak zar potansiyelinin değişimlerini görselleştirme yöntemini açıklar. Teknik, gürültü ve sinyal yorumlama sorunları nedeniyle yeni kullanıcılar için zorluklar sunsa da, nöral aktivitenin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri, zar potansiyeli değişikliklerini izlemek için kullanılır.
- Farklı floresan probların değişen güçlü ve zayıf yönleri vardır.
- FRET temelli problar oranlı görüntüleme sağlar ancak daha düşük sinyaller üretebilir.
- Sinyal-gürültü oranının anlaşılması, doğru yorumlama için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Zar potansiyeli değişikliklerini optik olarak raporlamak.
- Çeşitli genetik olarak kodlanmış floresan probların etkinliğini değerlendirmek.
- Gerçek zamanlı nöral aktivite görselleştirmesi hakkında içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergelerinin kullanımı.
- Farklı görüntüleme tekniklerinin karşılaştırılması.
- Sinyal-gürültü oranlarının analizi.
- Sinyalleri yorumlamadaki kullanıcı zorluklarının değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Gerçek zamanlı nöral aktivite görselleştirmesi mümkündür.
- FRET temelli problar, daha düşük sinyallere rağmen avantajlar sunar.
- Yeni kullanıcılar, gürültü müdahalesi nedeniyle zorluklarla karşılaşır.
- Gerçek sinyalleri gürültüden ayırmak için uygun eğitim gereklidir.
Sonuçlar
- Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri, nörobilimciler araştırması için değerlidir.
- Farklı probların sınırlarının anlaşılması kritik öneme sahiptir.
- Eğitim ve deneyim, sinyal yorumlamasını iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Imaging membrane potential with genetically encoded voltage indicators (GEVIs) enables real-time visualization of cellular electrophysiology, supporting early-stage target validation in neuroscience drug discovery. The method provides quantitative, dynamic readouts of neuronal activity, aiding mechanistic de-risking by linking compound effects to functional membrane potential changes. This capability improves predictive confidence in lead identification by offering direct, optical reporting of target engagement in live cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by optically reporting membrane potential dynamics in response to pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct, real-time measurement of voltage changes in live cells expressing GEVIs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by providing ratiometric or intensity-based fluorescence readouts correlated to voltage shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cellular systems (e.g., HEK293) for downstream compound screening via stable GEVI expression and whole-cell patch clamp integration.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging with FRET-based GEVIs, improving signal reliability and reducing artifacts from expression variability or photobleaching.
- Scalability: Compatible with high-speed CCD acquisition and automated pulse protocols, supporting repeated trials and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to neuronal models (e.g., hippocampal primary neurons) to assess compound effects in disease-relevant electrophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo potential by establishing single-cell imaging competence as a prerequisite for complex tissue studies.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination of compound-specific voltage effects from nonspecific noise through frame subtraction and baseline normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target interrogation to lead optimization, where functional voltage readouts inform compound selection prior to preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating optical signals with voltage-clamp stimuli to validate probe response and cellular health.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible measurements through standardized whole-cell configuration and baseline fluorescence normalization.
- Analytics: Provides fractional fluorescence change and kinetic analysis (exponential fitting) to quantify signal amplitude and response speed.
- Translational Research: Enables progression from single-cell HEK293 models to primary neurons, supporting assessment of translational relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for ion channel modulation studies across multiple target classes and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time optical reporting of membrane potential changes as a functional biomarker of neuronal activity.
- Operational Value: Promotes standardization via defined patch clamp protocols, image splitter calibration, and standardized analysis steps (frame subtraction, RLI normalization).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of off-target electrophysiological effects, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying compound-induced voltage shifts with defined thresholds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology (whole-cell patch clamp), fluorescence microscopy, and GEVI handling.
- Dependent on high-speed CCD cameras, image splitters, and filter cubes for dual-wavelength FRET detection.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for consistent data acquisition.
- Adaptation considerations include GEVI type (single FP vs. FRET-based), expression levels, and cell line suitability (e.g., avoiding dividing/dying HEK293 cells).
- Practical limitations include low signal-to-noise ratio, susceptibility to overexpression artifacts, and user-dependent interpretation of optical signals versus noise.
