Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Açıklanan deneylerin genel amacı, bir nöron üzerindeki birden fazla bölgeden altı mikrometre ve milisaniye altı çözünürlükle optik olarak tek bir sinir hücresi tarafından membran potansiyel sinyal entegrasyonunun ve bilgi işlemenin izlenmesidir. Bu, ilk olarak, membran potansiyel geçişine karşılık gelen ışık yoğunluğundaki küçük fraksiyonel değişikliklerin kaydedilmesine izin vermek için uygun hassasiyete sahip bir görüntüleme kurulumu oluşturularak elde edilir. Daha sonra, dilimin yüzeyine yakın tek bir odak düzleminde uzun bozulmamış süreçlere sahip nöronları etkili bir şekilde görüntülemek için uygun anatomiye sahip nöronları seçin.

Ardından, zar potansiyel değişikliklerinin optik olarak izlenmesine izin vermek için önceden seçilmiş nöronları voltaja duyarlı boyalarla yükleyin. Sonuçlar, bu yaklaşımın, aksonlardan, dendritlerden ve dendritik dikenlerden gelen zar potansiyel sinyallerini izleyerek bireysel sinir hücreleri tarafından elektrik sinyali entegrasyonu hakkında bilgi elde etme konusundaki benzersiz yeteneğini göstermektedir. Hücresel nörofizyolojide.

Konvansiyonel elektrofizyolojinin uzun süredir devam eden iki sınırlaması, elektrot ölçümlerinin düşük uzamsal çözünürlüğü ve akson teminatları veya dendritik dikenler gibi küçük yapılardan kayıt yapılamaması nedeniyle yeni araçlar geliştirilmektedir. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için, yama elektrot yaklaşımı, bir nöronun tüm bölümlerinden paralel kayıtlara izin veren optik tekniklerle birleştirilebilir. Burada böyle bir tekniği, tek omurga çözünürlüğü ile membran potansiyel geçici akımlarının çok taraflı optik kaydını açıklıyoruz.

Bu deneyde, düzgün aydınlatmayı ayarlamak için dik bir mikroskop ve üç kamera kullanılır. İlk olarak, lazer ışını yoluna uygun bir nötr yoğunluk filtresi yerleştirin. Ardından, hedefi standart floresan slaytın yüzeyine odaklayın.

Monitör ekranında görüş alanının CCD görüntüsünü gözlemlerken, kuvars ışık kılavuzunun alıcı ucunun konumunu ve ışık kılavuzunun çıkış ucunun konumunu, epi floresan kondansatör üzerindeki uygun aktüatörleri kullanarak ayarlayın. Titreşim gürültüsünü belirlemek için, yüzeyinde floresan olmayan bir işaret bulunan standart bir floresan slayt kullanın. Nöro CCD ile sürekli modda ışık yoğunluğunu kaydedin.

Objektifi siyah işaretin karanlık bir kenarına odaklayın ve ışık yoğunluğunu iki kilohertz kare hızında yaklaşık 100 milisaniye boyunca kaydedin. Ardından, eşit şekilde aydınlatılmış alandan ışık alan yaklaşık 20 pikselden ve siyah işaretin kenarı boyunca yaklaşık 20 pikselden oluşan kesirli ışık yoğunluğu izlerinin uzamsal ortalamasını görüntüleyin. Yüksek kontrastlı kenarlara sahip piksellerden gelen uzamsal ortalamadaki aşırı gürültü, sistemdeki titreşim gürültüsünü yansıtır.

Deklanşör açıklığının optik kayıtta titreşimsel gürültüye neden olmaması için mekanik deklanşörün titreşim izolasyon masasının dışına monte edilmesi önemlidir. Bu kritik bir adımdır. Optik kayıt sistemi tarafından alınabilecek akustik titreşim gürültüsünü azaltmak için plastik vidalar ve titreşim yalıtım malzemesi kullanarak deklanşörü monte edin.

Titreşimi izole etmek için, görüntünün keskin kenarını kaplayan piksellerin titreşim gürültüsü çekim gürültüsünden daha küçük olana kadar titreşim yalıtım tablosunu ayarlayın. Mekanik titreşimlerin mikroskop dürbününe iletilmesini önlemek için masa üzerindeki ekipman telleri gevşek olmalıdır. Bu prosedürde, 300 ila 400 mikron kalınlığındaki beyin dilimlerini, eğirme diski konfokal sistemi ile ilgilenilen bireysel sinir hücrelerinde EGFP'yi ifade eden bir fare hattı ile standart prosedürlere göre hazırlayın.

Dilimdeki EGFP etiketli nöronları görselleştirin. Daha sonra, bozulmamış dendritik aksonal ağaçlara sahip nöronları ve membran potansiyel görüntülemesi için dilimin yüzeyine paralel ve yakın çalışan süreçleri seçin. Ardından, yaklaşık 15 saniye boyunca negatif basınç uygulayarak elektrot konikliğinin üçte ikisine kadar boya içermeyen hücre içi çözelti ile uçtan bir cam yama pipeti doldurun.

Bundan sonra, elektrodu, hücre içi çözelti içinde çözülmüş membran IMP nüfuz eden voltaja duyarlı boya içeren çözelti ile doldurun. Şimdi, boyayı elektroda yükledikten sonraki bir dakika içinde önceden seçilmiş bir nöronu yamalayın. Pipet banyoya indirilmeden önce yaklaşık 10 milimetre cıva kadar düşük pozitif basınç uygulayın ve elektrodu dilime yerleştirirken, bu, sızdırmazlık oluşturulmadan önce elektrottan boya sızmamasını sağlar.

Elektrot hücre yüzeyine temas etmeden hemen önce yaklaşık 100 milimetre cıva ile yüksek basınca yükseltin. Sızdırmazlığın tüm hücre konfigürasyonunda oluşturulması, boyanın somatik bir yama pipetinden soma'ya 20 ila 45 dakika boyunca serbest difüzyonuna izin verir. Boyalı difüzyon sırasında, akım kelepçe modunda uyarılan aksiyon potansiyellerini kaydederek nöronun fizyolojik durumunu izleyin.

Ek olarak, hücre somasından gelen dinlenme ışığı yoğunluğunu iki kilohertz'lik bir kare hızında ve nötr yoğunluk filtreleriyle ayarlanan tam ışık yoğunluğunun bir kısmında kaydederek boyama miktarını izleyin. Eylem potansiyeli genişlemeye başlayana kadar indirme işlemine devam edin. Boyamanın sonunda, işlem sırasında tüm hücreden dış yama konfigürasyonuna geçişin sağlandığından emin olmak için yama pipetini voltaj kelepçesi konfigürasyonunda soma'dan dikkatlice çekin.

S daha sonra, voltaja duyarlı boyanın nöronal süreçlere yayılmasına izin vermek için dilimi oda sıcaklığında 1.5 ila iki saat daha inkübe edin. Önemli miktarda boya somadan dendritik ve aksonal süreçlere yayıldıktan sonra, aksiyon potansiyelinin dalga formu tamamen eski haline getirilmelidir. Bir sonraki adımda, düşük yoğunluklu floresan altında leke nöronunun soma'sını bulun.

Nötr yoğunluk filtreleriyle ışık yoğunluğunu, bir XY aşaması kullanarak ilgilenilen nesneyi görselleştirmek için gereken en aza düşürün Floresan soma tanımlanana kadar floresan nöronu içeren dilimin alanını tarayın. Lekeli hücrenin soma'sını mikroskop alanının merkezine yerleştirin, nöronu DIC altında boya içermeyen standart bir yama elektrotu ile temsil edin. Ardından, voltaj görüntüleme için CCD'nin sürekli kayıt modunda 10 ila 40 hertz kare hızında düşük yoğunluklu floresan altında nöronal süreçleri görselleştirin.

Bir XY evre pozisyonu kullanarak, görüntüleme alanının ortasındaki nöronal süreci ilgilendirir. Ek olarak, fotodinamik hasarı azaltmak için mikroskobun kısmen kapalı alan durdurma irisini kullanarak SOMA'yı uyarma ışığından koruyun. Ardından, tek tek dendritik dallardaki geri yayılma aksiyon potansiyelleri ile ilgili optik sinyalleri kaydedin.

Ardından aksondaki aksiyon potansiyelleri ile ilgili optik sinyalleri kaydedin. Bundan sonra, dendritik dikenlerdeki geri yayılma aksiyon potansiyelleri ile ilgili optik sinyalleri kaydedin. Sinyal dalgası formunun doğru bir şekilde yeniden yapılandırılması için uygun kare hızını kullanın.

Aynı zamanda, boya ağartımını ve fotodinamik hasarı en aza indirmek için kayıt periyotlarını ve yüksek yoğunluklu uyarma ışığına maruz kalmayı mümkün olduğunca kısa tutun. Optik sinyallerin kaydı burada gösterilmektedir. Burada. Üst panel, aksonu kayıt pozisyonundayken lekeli bir nöronun yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüsünü gösterir.

Orta panel, membran potansiyel görüntüleme için kullanılan CCD ile elde edilen aksonun düşük uzamsal çözünürlüklü floresan görüntüsünü gösterirken, alt panel, soma'dan gelen elektrot kayıtlarını ve A IS ve rvi düğümünden gelen optik kayıtları sunar. Ham veriler ve işlenen sinyaller gösterilir. Bu şekil, voltaja duyarlı boya etkisi ile yüklü bir L beş kortikal nöronun aksonundan gelen aksiyon potansiyeli sinyallerini göstermektedir.

Potansiyel ilgili sinyaller 10 kilohertz kare hızında kaydedildi. Bu izler, üç konumdan geçici olan aksiyon potansiyelini gösterir. Birincisi, somadan alınan elektrot kaydı.

İki, akson tepeciğinden gelen optik kayıtlar ve üç, vie'nin ilk notasından gelen optik kayıt ve burada aynı üç konumdan üst üste binen sinyaller var. Bu şekil, 100 hertz'de kısa depolarize edici akım darbeleri tarafından başlatılan bir L beş kortikal nöronun dendritik çardağı üzerinde birden fazla yerden dört geri yayılan aksiyon potansiyeli sinyalinin bir patlamasını göstermektedir. Burada, tek bir dendritik omurgadan gelen aksiyon potansiyeli sinyalleri gösterilmektedir.

İşte dönen disk konfokal görüntü yığınından elde edilen anatomik rekonstrüksiyon ve burada CCD kamera ile elde edilen aynı bölgenin floresan görüntüsü var. Membran potansiyel görüntüleme için, CCD görüntüsünde belirtildiği gibi bir ila üç arasındaki konumlardan geri yayılma eylemi Potansiyellerine karşılık gelen floresan yoğunluğu izleri sağ panelde gösterilir. Alttaki iz, somadan gelen elektrot kaydını gösterir.

Ön kayıt hazırlığı, zarların distal işlemlere yayılması için bekleme süresi de dahil olmak üzere yaklaşık üç saat sürer. Kayıt süresi, hazırlığın normal özeti ve PO fotodinamik hasarı ile sınırlıdır. Fotodinamik hasarın miktarı, uyarma ışığı yoğunluğu ve bireysel kayıt denemelerinin süresi ve sayısı ile orantılıdır.

Bazı deneylerde, bir veya iki saat boyunca 50'den fazla kayıt denemesi yapmak mümkündür. Diğer ölçümler yüksek uyarılma, ışık yoğunlukları ve daha uzun kayıtlar gerektirir ve fotodinamik hasarla yalnızca birkaç kayıt denemesiyle sınırlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, beyin dilimlerindeki tek tek nöronların tüm aksonal ve endr yapısından voltaj görüntülemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.