Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Bu cerrahi buluşun genel amacı, yara iyileştirme amacıyla aynı ameliyat sırasında hemen kullanılmaya hazır otolog deri mikro greftler üretmektir. Bu yöntem; kronik yara iyileşmesi, yanıklar ve travma sonrası ülserler gibi konularda, rejeneratif tıp ve deri doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uzmanlık gerektiren bir teknik olmadan doktorlar tarafından kullanımının çok kolay olması, aynı zamanda hızlı ve uygun maliyetli olmasıdır.

Başlamak için, bir hastadan cilt örnekleri toplamak üzere biyopsi punch'ı kullanın. Ardından epitelyal tabakayı çıkarıp atın. Otolog mikro greftler oluşturmak için her doku örneğini 1 milliliter salin solüsyonu ile birleştirin.

Klinik uygulama için biyokompleksleri hazırlamak üzere, 1 mililitre mikrogreft çözeltisini kolajen süngerlere aktarın. Biyokompleksi hemen hastanın yaralı bölgesine uygulayın. Biyokompleksin canlılığını test etmek için in vitro analizler yapın.

Üç günlük kültürleme işleminin ardından, biyokomplekslerin üzerine doğrudan %0,3 formalin dökün ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fikse edin. 5 mikrometre kalınlığında kesitler almak için bir mikrotom kullanın ve kesitleri doğrudan bir cam lama monte edin. Ardından kesitleri üç dakika boyunca 15 ila 20 mililitre ksilen içerisine yerleştirin.

Ardından, kesitleri deparafinize etmek ve yeniden hidrate etmek için, her birinde bir saat bekleyecek şekilde azalan dereceli etanol serilerine daldırın ve sonrasında deiyonize suya yerleştirin. Daha sonra kesitleri boyamak için 1 ila 2 dakika boyunca 1 g/L hematoksilinden 1 ila 2 mL kullanın. Ve boyayı durulamak için suya aktarın.

Şimdi 1 ila 2 mililitre %1 Eosin Y ve %70 etanol karışımını su ile seyrelterek kesitleri dört ila beş dakika boyunca boyayın. Ardından lamları durulamak için akan musluk suyu kullanın. Kesitleri, ksilen içinde bir saatlik inkübasyondan önce, her biri birer saat olacak şekilde artan konsantrasyonlardaki etanollere daldırın.

Son olarak, kapatma lamini eklemeden önce örneklere bazlı bir montaj ortamı uygulayın. Ardından, bir ışık mikroskobu altında 100x büyütmede gözlemleyin. Hasatla ilgili ulusal kuralları takip ederek, 40 ila 55 yaş arasındaki dört çoklu doku donörünün gövde bölgelerinden bir dermatom kullanarak sırasıyla 0,6 milimetre, 1 milimetre veya 0,2 milimetre kalınlığında papiller, ölü veya dermis örnekleri alın.

Numuneleri %0,9 NaCl içine koyun ve dokuyu nazikçe durulamak için beş dakika boyunca orbital sarsıcıya yerleştirin. 5 milimetrelik bir biyopsi punch'ı ile deri dokusundan, epidermisten ve dermisten çapları tek tip olan numuneler oluşturun ve tüm doku örneklerini tartın. Ardından, sırasıyla sekiz, üç veya dört adet tek tip epidermis veya dermis deri dokusu numunesini doku parçalayıcıya yerleştirin ve disaggregasyon için 1,5 mililitre salin çözeltisi ekleyin.

Tüm doku örnekleri için bu tabloda belirtildiği şekilde disagregasyon işlemini gerçekleştirin. Kontrol grubu olarak, sağlam doku örneklerinden elde edilen karşılık gelen sayıda punch biyopsi kullanın. Mekanik disagregasyonun ardından, mikrogreftleri içeren salin solüsyonunu aspire edin ve her bir örneği 12 kuyucuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin.

Her örneğe %10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş 1 milliliter RPMI-1640 besiyeri ekleyin. Hücre canlılığını değerlendirmek için, her kuyucuğa 0.5 milligrams per milliliter MTT çözeltisi içeren 1 milliliter besiyeri ekleyin ve 37-degree Celsius ve %5 carbon dioxide ortamında üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, MTT besiyerini uzaklaştırın ve yerine 1 milliliter DMSO ekleyin.

10 dakika inkübasyondan sonra, DMSO içindeki her örneği bir küvete aktarın ve 570 nanometredeki optik yoğunluğu okumak için bir spektrofotometre kullanın. Hücre canlılığını, 570 nanometredeki absorbansın, disagregasyon öncesinde kullanılan dokunun ağırlığına ve gramına oranı olarak hesaplayın. Ardından, tek bir donörden alınan deri ve dermis örneklerinden salin solüsyonu aspire edildikten sonra, her bir örneği hücre canlılık testi için 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna veya morfolojik analiz için bir kültür flaskına ayrı ayrı yerleştirin.

12 kuyucuklu plakaya %10 FBS ve antibiyotikler içeren 1 ml RPMI-1640 veya kültür balonuna 5 ml ekleyin ve sırasıyla 37 °C ve %5 karbondioksit altında 24 saat veya yedi gün boyunca kültüre edin. 24. saatte, hücre süspansiyonunun varlığını değerlendirerek morfolojik analiz gerçekleştirmek için ışık mikroskobu kullanın. Yedinci günde işlemi tekrarlayın.

FACS analizi ile dermis örneklerini CD146, CD34 ve CD45 gibi mezenkimal ve hematopoetik hücre belirteçleri açısından analiz edin. Ayrıştırılmış hücrelere besiyeri ekleyin, ardından üç gün boyunca 37-degree Celsius'ta inkübe edin. Ve daha önce açıklandığı şekilde mikrobiyolojik analiz gerçekleştirerek dokunun sterilite durumunu değerlendirin.

Burada gösterildiği gibi, kolajen destek üzerine hemen yüklenen insan otolog mikro-greftleri bir bacak lezyonuna implante edilmiştir. 30 gün sonra, doku onarımı ile ilişkili tam bir re-epitelizasyon gözlemlenmiştir. Dahası, klinik takip beş ay sonra hasarlı bölgenin iyi bir dokuya ve yumuşaklığa sahip olduğunu göstermiştir.

Bu tabloda belirtildiği üzere, tek bir adımda işlenebilen sekiz, dört ve üç biyopsi eşikleri belirlenmiş ve hücre canlılığını korumak için optimal disagregasyon koşullarını tespit etmek amacıyla dokular dört farklı sürede disagrege edilmiştir. Bu videoda gösterilen mekanik disagregasyon, sağlam doku ile karşılaştırıldığında, farklı zamanlarda değerlendirilen tüm deri örneklerinde (epidermis ve dermis) ortalama %30 hücre canlılığı sağlamaktadır. Bu grafik, kültürde 24 saat veya yedi gün sonra, kültürdeki homojenizasyon zamanına kadar deri dokusu örneklerinde hücre canlılığında başlangıç zamanına kıyasla önemli bir varyasyon gözlemlenmediğini göstermektedir.

Bununla birlikte, kültürdeki ölü örneklerin canlılığının 24 saat sonra, başlangıç zamanına kıyasla azaldığı gözlemlendi. Ancak hücre canlılığı, kültürdeki yedinci günün ardından yeniden sağlandı. Benzer sonuçlar dermis için de gözlemlendi.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde beş dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, epitelyal tabakanın deriden uzaklaştırılmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, kemik iyileşme mekanizması gibi diğer sorulara yanıt bulmak amacıyla kemik dokusu disagregasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların hastalardaki doku iyileşmesini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bu mikro-greft işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Dokularla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedür gerçekleştirilirken, koruyucu gözlük kullanımı gibi güvenlik önlemleri her zaman alınmalıdır.