Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Bu cerrahi buluşun genel amacı, yara iyileşmesi amacıyla aynı ameliyatta hemen kullanılmaya hazır otolog deri mikro greftleri üretmektir. Bu yöntem, rejeneratif tıp ve cilt dokusu mühendisliği alanındaki kronik yara iyileşmesi, yanıklar ve travma sonrası ülserler gibi konularla ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, beklentisiz bir teknik olmadan doktor tarafından kullanımının çok kolay olması, hızlı ve uygun fiyatlı olmasıdır.

Başlamak için, bir hastadan cilt örnekleri toplamak için bir biyopsi yumruğu kullanın. Ardından epitel tabakasını çıkarın ve atın. Otolog mikro greftler oluşturmak için her doku örneğini 1 mililitre salin solüsyonu ile birleştirin.

Klinik uygulama için biyokompleksler hazırlamak için, 1 mililitre mikro greft solüsyonunu kollajen süngerler üzerine aktarın. Biyokompleksi hemen hastanın yaralı bölgesine uygulayın. İn vitro olarak, biyokompleksin canlılığını test edin.

Üç günlük kültürün ardından,% 0.3 formalini doğrudan biyokomplekslerin üzerine dökün ve oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. 5 mikrometre kalınlığındaki bölümleri dilimlemek için bir mikrotom kullanın ve doğrudan bir cam slayt üzerine monte edin. Daha sonra bölümleri üç dakika boyunca 15 ila 20 mililitre ksilenin içine yerleştirin.

Daha sonra, bölümleri deparafinize etmek ve yeniden sulandırmak için deiyonize suya koymadan önce dilimleri her biri bir saat boyunca azalan derecelerde etanole batırın. Daha sonra bölümleri lekelemek için bir ila iki dakika boyunca litre hematoksilen başına 1 ila 2 mililitre 1 gram kullanın. Ve lekeyi durulamak için suya aktarın.

Şimdi 1 ila 2 mililitre% 1 Eosin Y ve% 70 etanol ile su ile seyreltin, bölümleri dört ila beş dakika boyayın. Ardından slaytları durulamak için akan musluk suyu kullanın. Ksilen içinde bir saatlik inkübasyondan önce bölümleri her biri bir saat boyunca artan etanol konsantrasyonlarına daldırın.

Son olarak, bir lamel eklemeden önce numunelere bazlı bir montaj ortamı uygulayın. Daha sonra 100x büyütmede ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Bir dermatom kullanarak, toplama ile ilgili ulusal kurallara uygun olarak 40 ila 55 yaşındaki dört çok doku donörünün gövde alanlarından sırasıyla 0,6 milimetre, 1 milimetre veya 0,2 milimetre kalınlığında papiller, ölü veya dermis örnekleri alın.

Numuneleri %0.9 NaCl'ye koyun ve dokuyu nazikçe durulamak için beş dakika orbital çalkalayıcı üzerine koyun. 5 milimetrelik bir biyopsi zımbası ile cilt dokusundan, ölü ve dermisten tek tip çapta örnekler oluşturun ve tüm doku örneklerini tartın. Daha sonra, doku bozucuya sırasıyla sekiz, üç veya dört üniform cilt dokusu örneği, ölü veya dermis yerleştirin ve ayrıştırma için 1.5 mililitre salin çözeltisi ekleyin.

Bu tabloda belirtildiği gibi tüm doku örnekleri için ayrıştırma işlemini gerçekleştirin. Kontrol olarak sağlam doku örneklerinden elde edilen karşılık gelen sayıda punch biyopsisi kullanın. Mekanik ayrıştırmadan sonra, mikro greftler içeren salin solüsyonunu aspire edin ve her bir numuneyi ayrı ayrı 12 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna yerleştirin.

Her numuneye% 10 FBS ve antibiyotik ile desteklenmiş 1 mililitre RPMI-1640 ortamı ekleyin. Hücre canlılığını değerlendirmek için, her bir oyuğa mililitre MTT çözeltisi başına 0.5 miligram içeren 1 mililitre ortam ekleyin ve üç saat boyunca 37 derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyonun ardından, MTT ortamını çıkarın ve 1 mililitre DMSO ile değiştirin.

10 dakika inkübe ettikten sonra, DMSO'daki her numuneyi bir küvete aktarın ve 570 nanometredeki optik yoğunluğu okumak için bir spektrofotometre kullanın. Hücre canlılığını, 570 nanometredeki absorbans oranı ve ayrıştırmadan önce kullanılan doku ağırlığı ve gramı olarak hesaplayın. Daha sonra, tuzlu su çözeltisi cilt dokusundan, tek bir donörden alınan ölü ve dermis örneklerinden aspire edildikten sonra, her bir numuneyi bir hücre canlılık testi veya morfolojik analiz için bir kültür şişesi için 12 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna ayrı ayrı yerleştirin.

12 oyuklu plakaya% 10 FBS ve antibiyotikli 1 mililitre RPMI-1640 veya kültür şişesine 5 mililitre ekleyin ve sırasıyla 24 saat veya yedi gün boyunca% 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte kültüre ekleyin. 24 saatte, hücre süspansiyonunun varlığını değerlendirerek morfolojik analiz yapmak için ışık mikroskobu kullanın. Yedinci günde tekrarlayın.

FACS analizi ile, CD146, CD34 ve CD45 gibi mezenkimal ve hematopoietik hücre belirteçlerinden dermis örneklerini analiz edin. Ayrılmış hücrelere ortam ekleyin, ardından üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ve daha önce tarif edildiği gibi mikrobiyolojik analiz yaparak dokunun sterilitesini değerlendirin.

Burada gösterildiği gibi, kollajen desteğine hemen yüklenen insan otolog mikrogreftleri bir bacak lezyonuna implante edildi. Ve 30 gün sonra doku onarımı ile ilişkili tam bir yeniden epitelizasyon gözlendi. Ayrıca, klinik takip, beş ay sonra hasarlı bölgede iyi bir doku ve yumuşaklık gösterdi.

Bu tabloda listelendiği gibi, tek bir adımda işlenebilen sekiz, dört ve üç biyopsi eşikleri belirlendi ve iyi hücre canlılığını korumak için en uygun ayrıştırma koşullarını belirlemek için dokular dört farklı zamanda ayrıştırıldı. Bu videoda gösterilen mekanik ayrıştırma, sağlam dokuya göre farklı zamanlarda değerlendirildiğinde, ölü ve dermis olmak üzere tüm cilt örneklerinde ortalama %30 hücre canlılığı değerini korur. Bu greft, kültürde 24 saat veya yedi gün sonra, kültürdeki homojenizasyon zamanına kıyasla cilt dokusu örneklerinde hücre canlılığında önemli bir değişiklik gözlenmediğini göstermektedir.

Bununla birlikte, kültürde 24 saat sonra ölü numunelerin canlılığının başlangıç zamanına kıyasla azaldığı gözlenmiştir. Ancak kültürde yedi gün sonra hücre canlılığı geri yüklendi. Dermis için de benzer sonuçlar gözlendi.

Ustalaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa beş dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, epitel tabakasını ciltten çıkarmayı unutmamak önemlidir. Bu işlemi takiben, kemik iyileşme mekanizması gibi diğer sorulara cevap vermek için kemik dokusunun ayrıştırılması gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu teknik, geliştirildikten sonra rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların hastalardaki doku iyileşmesini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bu mikro greft prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Doku ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Ve bu işlem yapılırken koruyucu gözlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.