Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık alanında, hastalıkla ilişkili proteinlerin toksisitesini hangi genetik faktörlerin ve yolların düzenlediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, maya modellerini geniş bir kütüphane genleri koleksiyonuna karşı taramak için yüksek verimli maya çiftleşme işleminin kullanılmasıdır. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesi hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer stres koşullarının toleransı gibi mayadaki diğer hücresel süreçlerin incelenmesine de uygulanabilir.

Bu prosedüre, dizili bir plazmit kütüphanesinden yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakalara plazmit DNA'nın oyuğu başına beş mikrolitre alikot ederek başlayın. Plakaları dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, 150 mililitre maya pepton dekstroz veya YPD ortamını 500 mililitrelik bir şişeye haploid maya suşu W303 Alpha'nın bir kolonisi ile aşılayın.

Kültürü gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD600'ünü ölçtükten sonra, kültürü iki litre YPD'de 0.1'lik bir OD600'e seyreltin. Kültür 0,4 ila 0,6 arasında bir OD600'e ulaşana kadar yaklaşık beş saat boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin.

Maya kültürünü hasat etmek için sekiz adet steril 250 mililitrelik santrifüj şişesini doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3000 xG'de santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dökün. Mayayı metin protokolünde anlatıldığı gibi yıkayın ve hücreleri iki santrifüj tüpünde birleştirin.

Her hücre peletini 25 mililitre 0.1 molar lityum asetat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan hücreleri birleştirin, beş mililitre somon sperm DNA'sı ekleyin ve bunları 150 mililitrelik bir şişeye aktarın. 30 dakika boyunca 225 rpm'de çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin.

30 dakika sonra, hücre karışımını steril tek kullanımlık bir reaktif haznesine dökün. Çok kanallı bir pipet kullanarak, daha önce hazırlanan kütüphane plazmid DNA'sını içeren yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 35 mikrolitre hücre karışımını aktarın. 96 oyuklu plakaları bir dakika boyunca 1000 rpm'de vorteksleyin.

Plakaları 30 dakika çalkalamadan 30 santigrat derecede inkübe edin. Plakaları üst üste koymayın, böylece ısı daha verimli bir şekilde aktarılabilir. 96 oyuklu plakaları 30 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve 1000 rpm'de 30 saniye karıştırın.

Her kuyucuğa 125 mikrolitre dönüşüm tamponu ekleyin ve ardından plakaları bir dakika boyunca 1000 rpm'de girdaplayın. Plakaları 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plakaları 15 dakika boyunca 42 santigrat derece inkübatöre yerleştirerek mayayı ısıtın.

Plakaları beş dakika boyunca 3000 xG'de santrifüjleyin. Plakaları bir çöp kutusu üzerinde ters çevirerek ve tamponu plakalardan zorla boşaltarak dönüşüm tamponunu kuyulardan çıkarın. Plakaların üzerindeki sıvıyı çıkarmak için ters çevrilmiş plakaları temiz bir kağıt havlu üzerinde hızlıca kurulayın.

Hücreleri, her bir oyuğa, kütüphane plazmidi üzerindeki seçilebilir işaretleyiciye karşılık gelen 200 mikrolitre minimum bırakma ortamı ekleyerek durulayın. Burada sentetik ura eksi ortam kullanılır. Plakaları beş dakika boyunca 3000 xG'de santrifüjleyin.

Süpernatanı daha önce gösterildiği gibi bir çöp kutusunun üzerine çıkarın. Her kuyucuğa% 2 glikoz içeren 160 mikrolitre minimal ura eksi ortam ekleyin ve plakaları bir dakika boyunca 1000 rpm'de girdaplayın. Plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede çalkalamadan inkübe edin.

48 saat sonra, her kuyucuğun dibinde bir tane dönüştürülmüş maya peleti görünmelidir. Sıvı bir dağıtıcı kullanarak, yeni bir 96 oyuklu plaka setinin her bir oyuğuna glikoz içeren 100 mikrolitre ura eksi orta ekleyin. Dönüştürülmüş mayayı içeren plakaları 1000 rpm'de 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Steril bir plastik 96 pimli çoğaltıcı kullanarak, pimleri dönüştürülmüş mayayı içeren kuyucuklara yerleştirin ve ardından bunları ortamla doldurulmuş yeni plakaların karşılık gelen kuyucuklarına aşılayın. Yeni plakaları 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, başarılı bir şekilde dönüştürülmüş maya içeren her oyuğun dibinde bir maya peleti görünmelidir.

Bu maya suşlarını gliserol stokları olarak kurtarmak için, her oyuğa 50 mikrolitre %50 gliserol ekleyin, plakaları 1000 rpm'de 30 saniye vorteksleyin, plakaları alüminyum folyo ile kapatın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. Kütüphane suşlarını gliserol stoğundan canlandırmak için, 96 oyuklu plakaları eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın, alüminyum folyoyu çıkarın ve mayanın oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika çözülmesine izin verin. Maya çözüldükten sonra, gliserol stoklarını 96 oyuklu plakalarda% 2 glikoz içeren 160 mikrolitre taze ura eksi ortama aşılamak için steril bir plastik 96 pimli çoğaltıcı kullanın ve 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Kütüphane suşları kullanıldıktan hemen sonra, plakaları kapatın ve eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri koyun. Kütüphane suşlarının çözüldüğü gün, sorgu mayası suşunu 50 mililitre YPD'ye aşılayın ve gece boyunca 250 rpm'de çalkalanarak 30 santigrat derecede büyütün. Ertesi sabah, sorgu mayası türünü steril tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına dökün ve 160 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 96 mikrolitre sorgu suşunu alın.

Sıvı dağıtıcıyı kullanarak, YPD ortamının oyuğu başına 160 mikrolitreyi 96 oyuklu plakalara dağıtın. Sorgu suşunu ve kütüphane suş plakalarını içeren 96 oyuklu plakaları kısaca girdaplayın ve ardından kütüphane suşlarını sorgu suşu ile aşılanmış YPD plakalarına aktarmak için steril bir 96 pinli çoğaltıcı kullanın. YPD plakalarını 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

24 saat sonra, her kuyucuğun dibinde bir maya topağı görünecektir. 96 oyuklu plakaları, sorgu suşundaki plazmit üzerindeki seçilebilir belirteçlere karşılık gelen %2 Rafinoz içeren minimum droupout ortamı ile ve ayrıca kitaplık plazmidi ile doldurun. Mayayı YPD çiftleşme kültürlerinden seçici ortama aktarmak için steril bir 96 pinli çoğaltıcı kullanın.

96 oyuklu plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bu ortamda sadece çiftleşmiş ve diploid hücreler oluşturmuş ve bu nedenle hem sorgu plazmidini hem de kütüphane plazmidini içeren maya hücreleri büyüyebilecektir. Seçici ortam içeren Rafinozda 48 saatlik büyümeden sonra, diploid hücreler içeren kuyucukların dibinde bir peletin göründüğünü gözlemleyin.

96 oyuklu plakaları bir dakika boyunca 1000 rpm'de vorteksleyin. Mayayı% 2 galaktoz ve% 2 agar içeren ura-his-droupout plakalarına ve% 2 glikoz ve% 2 agar içeren ura-his-droupout plakalarına dörtlü olarak agar plakalarında tespit etmek için robotik bir lekeleme makinesi kullanın. Lekelendikten sonra, agar plakalarının kurumasını bekleyin ve ardından dört gün boyunca 30 santigrat derecelik bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin.

Her 24 saatte bir, mayanın büyümesini kaydetmek için agar plakalarının fotoğrafını çekin. ALS ile ilişkili protein FUS'un toksisitesi ilk olarak diploid mayada incelenmiştir. FUS'u indükleyen galaktoz içeren agar plakası ile belirtildiği gibi, FUS toksisitesi hem diplod hem de haploid mayada tutarlıdır.

Daha önce transformasyon tabanlı bir yöntemden FUS toksisitesinin baskılayıcıları olarak tanımlanan beş gen, çiftleşme yöntemi ile test edildi. Birinci şerit, iki boş vektörle dönüştürülmüş bir kontrol mayası türüdür. İkinci şerit, FUS ekspresyonunun çok toksik olduğu boş bir vektöre sahip diploid FUS maya türüdür.

Üç ila yedi şerit, FUS eksprese eden diploid mayanın yanı sıra bir baskılama geni gösterir. Beş genin tümü, diploid mayadaki FUS'un toksisitesini kurtarır ve bu da çiftleşme yönteminin etkili olduğunu gösterir. Bu çiftleşmeye dayalı yöntem daha sonra 940 genin aşırı ekspresyon kütüphanesi taramasına uygulandı.

Ve bir temsili plakanın fotoğrafı gösterilir. FUS ve kütüphane genlerinin eksprese edildiği galaktoz plakasında belirtildiği gibi, FUS diplod maya hücresi için toksikti. Yeşil kare ile gösterilen kütüphane geni, FUS toksisitesini kurtardı.

Kırmızı kare ile gösterilen kütüphane geni toksisiteyi arttırırken. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 120 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tarama için kullanılan fenotipin haploid çiftleşme tipine bağlı olmadığını önceden kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, mayadaki hastalıkla ilişkili proteinlerin toksisitesini kurtaran aşırı ekspresyon üzerine genetik faktörlerin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörodejeneratif hastalık alanındaki araştırmacıların, maya modelinde hastalıkla ilişkili proteinlerin sitotoksisite mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açabilir. Bu prosedürü takiben, kurtarmanın spesifik olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için beta galaktosidaz testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.