Name: Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin, maya çiftleşmesiyle aşırı ekspresyon taraması yaparak nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesini inceleyin. Bu yöntem, genetik faktörleri ve hücresel süreçleri hızla keşfetmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz üyeleri Ju laboratuvar ve Zhong laboratuvar ve finansal destek Wright State Üniversitesi'nden düşünceli tartışmalarla için müteşekkir.

Not: burada açıklanan protokol on 96-şey levha bulunan Kütüphane plazmid eleme için tasarlanmıştır ancak ölçeklendirilebilir yukarı ya da buna göre aşağı. Protokol bütün kütüphane tarama tamamlamak için yinelenmesi gerekir. Genellikle, tarama Kütüphane genlerin 10 plaka karşı her zaman rahat 1 kişi tarafından ele alınabilir.
1. 96-şey Maya dönüştürme için hazırlık
Not: Bu adım olarak daha önce açıklanan7,10yapılıyor.
<ol><li>Aliquot 5 µL (yaklaşık 50-100 ng), plazmid DNA bir yuvarlak alt 96-şey plaka her kuyuya dizilmiş plazmid kitaplıktan. Not: Bir örnek, böyle bir kütüphane bir Maya gen overexpression Kütüphane10olacaktır.</li>
	<li>Maya pepton Dekstroz (YPD) 500 mL şişe haploit Maya soy W303α bir kolonisi (2-3 mm çapında) ile medyada 150 mL aşılamak. Onları gecede 30 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi sabah, gecede kültür OD600 ölçmek ve Maya kültür OD600 seyreltik = 0.1 inç (ilâ) 2 U YPD. Kültür OD600 ulaşıncaya kadar bu (200 devir/dakika) sallayarak ile 30 ° c ~ 5 h için kuluçkaya 0.4-0.6 =.</li>
</ol>2. Maya dönüştürme
<ol><li>8 steril 250 ml'lik santrifüj şişe dolum ve onları 3000 x g 10 dakika süreyle de oda sıcaklığında centrifuging tarafından Maya kültür dökün süpernatant Pelet aksatmadan hasat. Not: oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımları uygulayın.</li>
	<li>Maya steril distile H2O. ile yıkayın Bunun için 100 mL steril H2O her santrifüj şişe ve girdap eklemek hücre Pelet resuspend için. 2 şişe ve onlara 3000 x g 5 dakika süreyle süpernatant dökün santrifüj içine yıkanmış hücreleri birleştirin.</li>
	<li>Her şişe 100 ml 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA), hücrelerde yıkama ve onları 3000 x g 5 dk. Pour süpernatant kapalı için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Centrifuging, somon sperm DNA (10 mg/mL) bir blok ısıtıcı 3 dakikadır kullanarak 100 ° C'de 5 mL kaynatın ve sonra buz üzerinde cool.</li>
	<li>Hücre Pelet 25 ml 0.1 M LiOAc/1XTE her şişe resuspend, resuspended hücreleri birleştirmek ve 150 mL şişe aktarmak. Önceden soğutulmuş somon sperm DNA 5 mL ekleyin ve 30 ° C'de (225 rpm) için 30 dk sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre karışımı bir steril tek kullanımlık reaktif rezervuar dökün ve bir çok kanallı pipet kullanarak, cep karışımı 35 µL Kütüphane plazmid DNA içeren yuvarlak alt 96-şey plaka her şey için transfer. Girdap 96-şey plaka plaka vortexer 1 dk 1000 rpm kullanarak. Plakalar için 30 ° C'de 30 dk sallayarak olmadan kuluçkaya. Not: ısı daha verimli bir şekilde transfer edebilirsiniz yüzden plakaları, yığın değil. Biz vortexing 96-şey tabak 1000 devirde wells dışarı dökmek için sıvı neden olmaz, ancak güvenli girdap hız-meli var olmak sınav belgili tanımlık adım gerçekleştirmeden önce bulduk.</li>
	<li>Bir şişesi 200 mL % 40 ' PEG3350 son bir konsantrasyon, % 10 DMSO ve 0.1 M LiOAc içeren dönüştürme arabelleği hazırlayın. Dönüştürme arabelleği kullanımdan hemen önce hazırlamak ve sallayarak iyice karıştırın.</li>
	<li>30 ° C kuluçka makinesi üzerinden kaldır 96-şey plakaları ve mix onları için 30 s 1000 devirde plaka vortexer kullanarak. 125 µL dönüştürme arabelleği her şey ve sonra girdap plakalar için 1 dk 1000 devir / dakikada ekleyin.</li>
	<li>Plakalar için 30 dk 30 ° C'de kuluçkaya ve sonra şok Maya için 15 dk 42 ° C kuluçka tabakları koyarak ısı. Not: plakaları yığını değil.</li>
	<li>Plakalar için 3000 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi. Dönüştürme tampon plakaları üzerinde atık kutusu ters çevirme ve zorla plakaları arabelleğinden damping kuyulardan çıkarın. Hızlı bir şekilde ters tabak tabak üstünde herhangi bir sıvı kaldırmak için temiz kağıt havlu üzerinde leke.</li>
	<li>Hücreleri en az çıkarma orta seçilebilir işaretçiyi üzerinde Kütüphane plazmid karşılık gelen bir tabak 200 µL ekleyerek durulayın. Not: Biz sentetik bir Ura orta kullanılır.</li>
	<li>Plakalar için 3000 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve bir atık bin adım 2.10 olduğu gibi üzerinde süpernatant kaldırın.</li>
	<li>En az Ura-orta içeren % 2 glikoz 160 µL ekleyin. Girdap plakalar için 1 dk 1000 rpm ve onları 48 h 30 ° C'de kuluçkaya sallayarak olmadan. 48 saat sonra bir Pelet dönüştürülmüş Maya her şey alt kısmında görünür olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Sıvı Sabunluk kullanarak 100 µL Ura-medya içeren glikoz 96-şey tabak yeni bir dizi her kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>Tabak 30 1000 rpm (Kimden adım 2.13) Maya dönüştürülmüş içeren steril plastik 96-pin Çoğalıcı kullanarak s., pimleri dönüştürülmüş Maya içeren kuyu yerleştirin ve sonra onları yeni plakaların wells ilgili aşılamak girdap medya ile dolu. Yeni plakalar için 24 h 30 ° C'de kuluçkaya. Not: Eğer 10 plakaları ile çalışma, Orta da kullanarak el ile çok kanallı pipetler reçete.</li>
	<li>24 saat sonra Maya Pelet başarıyla dönüştürülen Maya içeren her şey alt kısmında görünür olmalıdır. Bu maya suşları gliserol stokları kaydetmek için her şey için % 50 gliserol 50 µL eklemek girdap tabak 30 s 1000 rpm, bant mühürleme ile plakalarının ve bunları-80 ° C'de dondurmak Not: Yukarıdaki adımları yalnızca bir kez yapılması gerekir. Gelecek gösterimleri aynı Kütüphane tek kullanımlık reaktif rezervuar karşı farklı Maya modellerin gliserol stokları başlatmak ve hemen--dan belgili tanımlık merdiven aşağı devam edin.</li>
</ol>3. Kütüphane genler ve sorgu Maya içeren hücreler arasında çiftleşme
<ol><li>Kütüphane suşları gliserol stoktan canlandırmak için-80 ° C dondurucu, sızdırmazlık bandı ve izin Maya için yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında çözülmeye kaldır çöpten 96-şey plakaları alın.</li>
	<li>Maya çözdürülen steril plastik 96-pin Çoğalıcı gliserol hisse senetleri için taze Ura-medya içeren % 2 glikoz 96-şey tabak içinde 160 µL aşılamak ve hemen Kütüphane suşlar kullanılır sonra onları 24 h için 30 ° C'de kuluçkaya kılabilmesi için , bant mühürleme ile plakalarının ve-80 ° C dondurucu dönmelerini.</li>
	<li>Aynı gün kütüphane suşları (W303α) çözdürülen, sorgu Maya zorlanma aşılamak (burada, W303a FUS) 50 mL YPD için ve bir gecede 30 ° C'de 250 devir / dakikada sallayarak ile büyür.</li>
	<li>Ertesi sabah, sorgu Maya zorlanma bir steril tek kullanımlık reaktif rezervuar ve her şey bir çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey plaka için sorgu yük aliquot 160 µL dökün.</li>
	<li>Sıvı Sabunluk kullanarak, YPD medya 160 µL on 96-şey plakaların her kuyuya dağıtmak. Bu tabakları daha sonra sorgu Maya zorlanma Kütüphane Maya ile çiftleşme için kullanın.</li>
	<li>Kısaca girdap sorgu zorlanma ve sonra kullanın sorgu aktarmak için steril bir 96-pin Çoğalıcı içeren 96-şey plaka YPD plakayı süzün.</li>
	<li>Kısaca girdap Kütüphane plakaları strain ve her kütüphane zorlanma plaka için yeni bir steril 96-pin Çoğalıcı sorgu gerilme ile aşılanmış YPD plakaları Kütüphane suşları aktarmak için kullanın. Not: Gliserol hücrelerde birden çok erime-donma döngüsünden sonra canlılığı kaybetmek. Kütüphane suşları uzun süreli depolama (-80 ° C dondurucu) en kısa zamanda dönen Kütüphane kalitesi iyi tutmak ve gelecekte kullanılmak üzere hazır. Bakımı düzgün, gliserol stok donmuş ve en az 10 kez çözdürülen. A çalışma kopya ve gliserol hisse senedi yedek kopyalarını tutmak da önerilir. Çalışan hisse senedi çalışmıyor, hemen kopya yedek kopyasından yeni bir çalışma.</li>
	<li>YPD plakayı 24 h bir Pelet Maya her kuyunun içinde 24 saat sonra görünür olacağını not için 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>% 2 raffinose, karşılık gelen sorgu zorlanma plazmid yanı sıra Kütüphane plazmid (Örneğin, burada Ura - onun-) seçilebilir işaretleri içeren bir en az çıkarma orta ile dolgu 96-şey plakalar.</li>
	<li>Maya kültürleri seçici basına çiftleşme YPD aktarmak için steril bir 96-pin çoğaltıcısını kullanması. 96-şey plakaları için 48 h 30 ° C'de kuluçkaya; Sadece şeklindeki hücreleri Maya ve kurulan diploid hücre ve bu nedenle, her iki sorgu plazmid içerir ve Kütüphane plazmid bu medyada büyümek mümkün olacak. 2 gün sonra bir Pelet kuyu dibinde görünür olduğunu gözlemlemek.</li>
</ol>4. tahlil lekelenme
<ol><li>
Raffinose içeren seçmeli medya büyüme 48 saat sonra Maya ağar kaplamalar üzerinde spot.
	<ol>
<li>2 setleri açık polistren levhalar, bir içeren % 2 galaktoz ve diğer içeren % 2 glikoz kullanarak %2 agar içeren Ura-His-çıkarma hazırlayın.</li>
		<li>Girdap 96-şey plakalar için 1000 rpm, 1 dk sonra Maya %2 galaktoz ve %2 agar (FUS ile Kütüphane gen indüklenir) içeren Ura-His-çıkarma plakaları ve % 2 glikoz ve %2 agar (FUS ile Kütüphane gen içeren Ura-His-çıkarma plakaları spot hangi tarafından her kültürde de fark quadruplicate agar levha üzerine bir robot edindiği makine kullanarak baskı) (yani, 1 kültüründe de fark agar plaka üzerinde 4 noktalar).</li>
		<li>Sonra lekelenme, Kuru ve sonra baş aşağı 30 ° C kuluçka makinesine koyun ağar kaplamalar izin. Ağar kaplamalar her 24 h içinde sorgu zorlanma toksisite kurtarıldı daha hızlı/daha mantar büyüme kaydetmek için veya sorgu zorlanma toksisite şiddetlenir yavaş/daha az büyüme kaydetmek için fotoğraf. Tabakları için 4 gün kuluçkaya. Not: Her kültürde de ağar kaplamalar 1'e 1, bir önceki dönüşümü tabanlı Yöntem10' da gösterildii gibi lekeli olabilir. Ancak, 1-için-burada lekelenme (elverişli bir konuma sahip robot edindiği makine kullanarak ayarlamak) 4 yanlış pozitif sayısını azaltarak tahlil sağlamlığı önemli ölçüde artırır. Pozitif sayısı yalnızca otelde aynı dan tüm 4 kolonileri göstermek de benzer bir fenotip kabul edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14657499">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, plazmid overexpression ekran Maya plazmid Kütüphane Maya modeli tanıtmak için çiftleşme kullanarak gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu yaklaşımı kullanarak, birden fazla Maya modeli nörodejeneratif hastalık protein toksisite Maya bir plazmid kitaplıkla dönüştürdü aynı koleksiyonunu kullanarak gösterimi. Dönüşüm zahmetli süreci sadece sonra hangi yüksek verimli Maya çiftleşme plazmid kitaplığı sorgu yük tanıtmak için kullanılan bir kez yapılması gerekir. Bu iletişim kuralı medya ve spot maya kültürleri...

Tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae hücresel süreçler doğrudan insan hastalıkları ile ilgili anlamak için temel bilimsel araştırma1 ' de yaygın olarak kullanılmıştır. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve amyotrofik dahil olmak üzere en yaygın nörodejeneratif hastalıklar için bağlı olanlar gibi insan hastalık ilişkili proteinler eğitim için Ayrıca, bu bir model organizma kullanılmıştır Lateral skleroz (ALS)2. Maya modelin bir avantajı ile Genom geniş perde böylece onların toksisite mekanizmasının içine fikir veren proteinler, hastalığı ile ilgili toksisitesi ile ilgili hücresel yolları tanımlamak için gerçekleştirileceği kolaylığıdır. Böyle bir ekran içinde her dizilmiş bir kütüphanede 5.500 Maya genlerin hangi genlerin overexpressed zaman toksisite değiştirebilirsiniz tanımlamak için bir Maya modeli olarak dönüştürülür bir overexpression kitaplık ekranı denir. Proteinlerin huntingtin Huntington hastalığı3, α-synuclein Parkinson hastalığı4,5 için için de dahil olmak üzere birden çok nörodejeneratif hastalık ilişkili, Maya modellerinde bu tarama yöntemi başarıyla uygulandı , Aβ Alzheimer hastalığı6ve FUS ve TDP-43 ALS7,8,9. Genellikle bir yüksek-den geçerek şekilde10dakika sonra yapılır iken, ekranın en emek yoğun adım tek tek dizilmiş kitaplıktan 5.500 Maya genler dönüştürüyor. Bu adım her zaman tarama tekrarlanır gerçekleştirilmesi gerekir ve ne zaman yeni kurulan Maya manken belirlenmesi gerekiyor. Bu görevi yerine getirmek için daha verimli bir yol bulmak önemlidir.
Maya hücreleri haploit ve diploit formlarında stabil bulunabilir. İki haploit hücreleri, türü çiftleşme türleri çiftleşme karşısında bir ve her çiftleşme α. haploit hücreleri yazın üretmek ve için yalnızca ters çiftleşme türü hücreleri yanıt kendi belirli çiftleşme feromon salgılar. Bu arasında çiftleşme sağlar bir ve α hücreleri istikrarlı diploit hücreleri, bir/α üretmek için. Bu işlem kendiliğinden ve yüksek verimli11yaşında. Biz plazmid Kütüphane tanıtmak S. cerevisiae bu benzersiz yaşam döngüsünün yararlanabilirsiniz. Daha ayrıntılı olarak, her gen dizilmiş plazmid kütüphanede bir çiftleşme türü, yani, α hücre haploit hücreleri dönüştürülür. Kütüphane genleri içeren bu hücreler sonra gliserol stok dizilmiş 96-iyi biçimde depolanır. Taranması gereken her Maya model için Kütüphane genleri içeren Maya hücreleri gliserol stoktan çözdürülen ve tarama ters çiftleşme türü, yani, çiftleşme ilgi Maya modeli ile çiftleşme yoluyla yapılabilir bir. Maya iki gen getirmek birlikte çiftleşme kullanarak bu fikri yeni bir şey değil. İki-hibrid tarama, hangi bir yem oluşturmak (yani, Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon) bir çiftleşme yazıyla birlikte dizilmiş kitaplıktan bir av yapısı ile çiftleşme aracılığıyla getirilir yüksek üretilen iş Maya içinde başarıyla uygulandı 12. ancak, bu strateji asla her zaman geleneksel dönüşüm yöntemleri kullandım overexpression Kütüphane gösterimleri uygulanmıştır.
Bizim Laboratuvar Maya manken ALS ilişkili protein FUS7' nin daha önce kurulmuş. Dönüşüm yöntemi kullanarak overexpression Kütüphane tarama yoluyla overexpressed zaman FUS toksisite kurtarmak beş Maya genlerin (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1ve VHR1) keşfetti. Bu bulgular bağımsız olarak başka bir grup8tarafından benzer bir çalışma ile teyit edildi. hUPF1, ECM32, insan bir homolog daha sonra toksisite birincil nöronal hücre13 ' te ve ALS14 de hayvan modelinde bastırmak için gösterildi. Bu beş genlerin ilke kanıtı olarak kullanarak, çiftleşme tarafından FUS Maya modeli tanıtıldı zaman tüm beş genler benzer şekilde FUS toksisite kurtarmak göstermektedir. Maya hücreleri Kütüphane genleri içeren kalıcı olarak saklanan gliserol stokta ve gerektiğinde yeniden canlandırdı beri bu çiftleşme tabanlı yöntem dönüştürme karşı taranması için Kütüphane ihtiyacı her zaman zaman alan adım kaldırır. Çiftleşme herhangi plazmid bir dönüşüm dahil yüksek verimli olduğundan, bu strateji arıtma ve dönüşümü, bir büyük plazmid Kütüphane ile ilgili maliyet de önemli ölçüde azaltır. FUS Maya modeli karşı eleme bir kitaplığı başarıyla bu yöntem uygulanır.
Çiftleşme tabanlı tarama prosedürü kısaca Şekil 1' de anlatılan. Başlangıçta, dizilmiş plazmid kitaplık türü α her şey bir 96-şey plaka belirli kitaplık plazmid ile dönüştürülmüş Maya içeren bir yüksek-den geçerek Maya dönüştürme iletişim kuralı kullanılarak çiftleşme haploit Maya süzün içine aktarılır. Bu koleksiyon dönüştürülmüş Maya çözdürülen ve kullanım için daha sonra canlanan bir gliserol stok olarak kaydedilir. İlgi bu durumda FUS toksisitesi, Maya model haploit Maya gerilme zıt eşleşme türü ile oluşturulan gerekir (türü çiftleşme bir). Steril 96-pin Çoğalıcılar kullanarak bir yüksek-den geçerek şekilde FUS zorlanma ve maya suşları plazmid kitaplığı içeren zengin medya içeren 96-şey plakaları için transfer ve mate için izin. Çiftleşme, her küçük bir birimden takip iyi çiftleşme kültürünün 96-şey plakalar sentetik çıkarma medyada her iki FUS içeren hangi sadece diploit Maya içeren aktarılmasına ve Kütüphane genler büyüyebilir. Bir robot edindiği makine sonra Maya kültür üzerine ağar kaplamalar ve daha nerede FUS ve Kütüphane genlerin ifadesi indüklenen her kuyudan aktarmak için kullanılır.  Ayrıca, Maya kültür nerede FUS ve Kütüphane genler değil ifade edilir ağar kaplamalar denetlemek için fark edilir. Ağar kaplamalar üzerinde büyüme kurtarma veya FUS toksisite azdırmak genlerin tespit edilecektir.

<table><tbody><tr><td>somon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD et suyu</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası (RPI)</td> <td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granül Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D - (+) - Glikoz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası (RPI)</td> <td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D - (+) - Galaktoz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası (RPI)</td> <td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D - (+) - Rafinoz Pentahidrat</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası (RPI)</td> <td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik Ura- bırakma ortamı</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Maya amino asit bırakma takviyesi -Histidin / - Urasil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Amino Asitler ve Amonyum Sülfat Araştırma Ürünleri içermeyen Maya Azot Bazı</td><td>Uluslararası (RPI)</td> <td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lityum asetat, susuz</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 3350 (PEG-3350)</td> <td>Spektrum Kimyasalı&nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Çoğaltıcı&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 kuyu tahlil plakası, kapaklı yuvarlak alt</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>işlenmemiş, steril</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Research plus Çok Kanallı Pipet</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul hacim</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp Dijital Kuru Banyolar/Blok Isıtıcılar</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Santrifüj</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Santrifüj</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Çok Modlu Dağıtıcı</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>Şarkıcı Enstrümanları</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

maya overexpression çiftleşme tabanlı kütüphane tarama

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Mayası yaygın insan hastalıkları ile ilişkili proteinler eğitim bir model olarak kullanılmıştır. Genom genelindeki genetik tarama Maya çalışmalarda yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Nörodejeneratif hastalık ilişkili proteinler Maya bir dizi ifade sitotoksisite ve toplama oluşumu, bu bozuklukları olan hastalarda görülen bulguları recapitulating neden olur. Burada, bir Maya model değiştiriciler, toksisite için amyotrofik Lateral skleroz ilişkili protein FUS süzmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Dönüştürme kullanmak yerine, bu yeni tarama platform plazmid dizilmiş bir kütüphane Maya modeli tanıtmak için Maya çiftleşme üzerinde dayanır. Çiftleşme yöntemi iki açık avantajları vardır: Birincisi, yüksek verimli; İkinci olarak, önceden dönüştürülmüş dizilmiş kütüphanede plazmidleri, bir gliserol hisse senedi olarak uzun vadeli ve diğer ekranların Maya modeline dönüştürme adım emek yoğun olmadan hızlı bir şekilde uygulanan her zaman saklanır. Biz nasıl bu yöntem başarıyla kullanılabileceğini göstermek için ekran FUS toksisite değiştirmek genler.

ALS ilişkili protein FUS, bir RNA/DNA bağlayıcı protein daha önce haploit Maya7,8' incelenmiştir. Genetik kullanarak tarama dönüşüm tabanlı yöntemi FUS toksisite bastırmak birkaç Maya genler keşfetti. Bir Maya genlerin insan homolog daha sonra birincil nöronal hücre ve fare modeli ALS13toksisite bastırma etkili olduğu gösterilmiştir. Burada, overexpression Kütüphane tarama etkili çiftleşme tarafından gerçek...

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık alanında, hastalıkla ilişkili proteinlerin toksisitesini hangi genetik faktörlerin ve yolların düzenlediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, maya modellerini geniş bir kütüphane genleri koleksiyonuna karşı taramak için yüksek verimli maya çiftleşme işleminin kullanılmasıdır. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesi hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer stres koşullarının toleransı gibi mayadaki diğer hücresel süreçlerin incelenmesine de uygulanabilir.Bu prosedüre, dizili bir plazmit kütüphanesinden yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakalara plazmit DNA'nın oyuğu başına beş mikrolitre alikot ederek başlayın. Plakaları dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, 150 mililitre maya pepton dekstroz veya YPD ortamını 500 mililitrelik bir şişeye haploid maya suşu W303 Alpha'nın bir kolonisi ile aşılayın.Kültürü gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD600'ünü ölçtükten sonra, kültürü iki litre YPD'de 0.1'lik bir OD600'e seyreltin. Kültür 0,4 ila 0,6 arasında bir OD600'e ulaşana kadar yaklaşık beş saat boyunca 200 rpm'de çal

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan &gt; 1000 TFs tek denemede.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Öğrenin, maya çiftleşmesiyle aşırı ekspresyon taraması yaparak nörodejeneratif hastalık proteinlerinin toksisitesini inceleyin. Bu yöntem, genetik faktörleri ve hücresel süreçleri hızla keşfetmenizi sağlar.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Daha fazla video keşfet