Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Bu klonlama ve dönüştürme prosedürünün genel amacı, CRISPR Vektörlerini verimli bir şekilde üretmek ve fonksiyonel genomik çalışmalarda kullanılabilecek mutant domates köklerini devre dışı bırakmaktır. Bu yöntem, bitki genomiği alanında yararlı bir araçtır, çünkü çeşitli kök işlemlerinde kullanılabilecek çok sayıda nakavt mutant üretebilir. Bu tekniğin ana avantajı, klonlama prosedürünün tek bir adımda gerçekleştirilebilmesi ve grup materyallerinin sadece birkaç hafta içinde elde edilebilmesidir.

İlk olarak, DNA montajı için gerekli olan beş asal ve üç asal 20 nükleotid dizisi ile çevrili hedef motiflerin GN19 kısmını içerecek şekilde RNA veya gRNA oligolarını tasarlayın. Restriksiyon enzimi Spe1 ile bir ila beş mikro gram P201N caznine plazmidini iki saat boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Sindirimi üreticinin talimatlarına göre kolon saflaştırdıktan sonra, 15 mikrolitre 10 milimolar Trs HCL'de tekrar süspanse edin.

UV Spektrofotometrisi ile DNA miktarını ölçün. İki saat boyunca 25 santigrat derecede bir kısıtlama enzimi Swa1 ile ikinci bir sindirim gerçekleştirin. Tam sindirimi doğrulamak için sıfır nokta yüzde sekiz agaroz jel üzerinde 100 ila 200 nanogram kontrol edin.

Doğru sindirilmiş bir plazmit, 14.313 baz çiftinde tek bir banda sahip olacaktır. Medicago truncatula'yı PCR amplifiye etmek için, disk gRNA mekik plazmidinden altı promotör ve iskele DNA'sı kullanın. Yüksek kaliteli bir polimerazda Swa1 ve Mtu6F ve MTU6R astarını ve Spe1 iskele R'de F iskelesini kullanın.

Amplifikasyonu doğrulamak için yüzde bir agaroz jel üzerinde üç mikrolitre PCR ürünü alikuatını görselleştirin. MTU6 amplikonu 377 baz çiftidir ve iskele amplikonu 106 baz çiftidir. Sütun, kalan PCR ürünlerini üreticinin talimatlarına göre saflaştırın.

Daha önce olduğu gibi UV Spektofotometrisi ile ölçün ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, tüm gRNA oligo tüpünü laboratuvar sınıfı suda 100 mikromolar kısma yeniden süspanse edin. 500 mikrolitre 1xNEB tampon iki nokta bir içine bir mikrolitre oligo ekleyin ve iyice karıştırın.

50 santigrat derecede tutmak için ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici programlayın. 100 nanogram doğrusallaştırılmış vektörü, 50 nanogram MtU6 promotörünü, 12 nanogram İskeleyi ve bir mikrolitre seyreltilmiş gRNA oligosunu suda beş mikrolitrelik bir nihai hacme birleştirin. Beş mikrolitre 2X yüksek kaliteli DNA Assembly Mastermix ekleyin.

İyice karıştırın ve döndürün. Reaksiyonu 50 santigrat derece termocycler'da 60 dakika inkübe edin. 50 santigrat derecede bir saatin ardından, reaksiyonu buzun üzerine yerleştirin ve ardından standart teknikleri kullanarak yetkin E.Coli hücrelerini dönüştürmek için iki mikrolitre kullanın.

Dönüşümü mililitre başına 50 miligram Kanamisin ile desteklenmiş LB Agar üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. StUb3p 218R ve 1Sce1R primer ile PCR kullanarak kolonileri tarayın. Kalan DNA montaj reaksiyonunun bir kısmını bir ila beş su ile seyreltin ve koloni taraması için pozitif bir kontrol olarak bir mikrolitre kullanın.

Ayrıca, ekleme gerektirmeyen kontrol olarak bir nanogram dairesel P201N kasnin plazmidi ekleyin. Protokolün yazılı kısmında yer alan parametreleri kullanarak PCR amplifikasyonundan sonra, PCR ürününü yüzde bir agaroz jeli üzerinde görselleştirin. Doğru eklemeler bantlı 725 baz çiftine sahiptir ve kesici uçsuz vektörler 310 baz çifti bandına sahip olacaktır.

LB Can50 sıvı kültürlerinde gece boyunca 37 santigrat derecede pozitif koloniler büyütün. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmitleri saflaştırın. Sanger, saflaştırılmış plazmitleri StuB3P218R primer ile sıraladıktan sonra, klonlama sırasında herhangi bir hata oluşmadığından emin olmak için kromatogramları MtU6 promotörü, Hedef ve iskele dizilerine hizalayın.

EcoR5 ve Sti1 ile bir mikrogram plazmidi sindirerek tanısal bir sindirim gerçekleştirin. Sıfır nokta sekiz agaroz jeli üzerinde görüntülendiğinde, bu bantlama pıtırtısı görülmelidir. Son olarak, 50 mikrolitre elektroyetkin hücreye bir mikrolitre plazmit preparatı ekleyerek ve bir mililimiter küvette elektroporatörlük yaparak plazmitleri Agrobacterium rhizogenes suşu ARqua1'e dönüştürün.

Yaklaşık 500 mikrolitre SOC Media ekleyin ve iki saat boyunca 28 santigrat derecede çalkalayın. Daha sonra LB Can50 plakalarının üzerine koyun ve iki gün boyunca 28 santigrat derecede büyütün. İşlemin bu bölümüne, domates tohumlarını yüzde 20 ev tipi çamaşır suyunda 15 dakika boyunca sürekli karıştırarak sterilize ederek başlayın.

Daha sonra tohumları laminer bir akış başlığına aktarın. Çamaşır suyunu çıkarın ve steril laboratuvar kalitesinde suda üç kez yıkayın. Yarım MS Media içeren bir GA7 kutusuna 30 tohum koyun.

Karanlıkta yaklaşık iki gün çimlenmesine izin verin. Tohumlar filizlendikten sonra, GA7 kutularını dönüşümden bir gün önce ışığa çıkarın, A.rhizogenes kültürlerini Can50 içeren katı LB üzerine sürün ve gece boyunca 28 santigrat derecede büyütün. Dönüşüm gününde, 50 mililitre yarım MS'ye 25 mikrolitre Asetosiringon eklemek için laminer akış başlığında çalışın ve her kültür tüpüne altı mililitre dökün.

A.rhizogenes hücrelerini plakadan kazımak için bükülmüş 200 mikrolitrelik bir uç kullanın ve altı mililitre yarım MS sıvısında yeniden süspanse edin. Hücreleri tamamen yeniden süspanse etmek için tüpü girdaplayın. Her vektörden hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, bir mililitre hücre alın ve optik yoğunluğu 600 nanometrelik sabit bir dalga boyunda ölçün.

Steril bir filtre kağıdı ile bir petri kabına iki mililitre yarım MS sıvı ekleyin. Fidelerden kotiledonları çıkarın ve nemli filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Tüm kotiledonlar toplandıktan sonra, kotiledonların en uzak bir santimetresini kesin ve iki kesik uçlu kotiledon parçaları elde edin.

Eski bitkileri A.rhizogenes çözeltilerine ekleyin ve karıştırın. Ara sıra ters çevirerek 20 dakika inkübe edin. A.rhizogenes inkübasyonu sırasında, her yapı dönüşümü için bir petri kabına bir parça filtre kağıdı ekleyin.

Ayrıca, laminer akış başlığında antibiyotiksiz yarım MS katı ortamı kurumaya ayarlayın. A.rhizogenes solüsyonundan kotiledonları çıkarmak için steril forseps kullanın ve kuru filtre kağıdına yerleştirin. Bir sonraki dönüşüme geçerken dokuların kurumamasını sağlamak için bir petri kabı kapağıyla örtün.

Daha sonra, filtre kağıdındaki kotiledonları kurulayın ve abaksiyal tarafı yarım MS ortamına kadar aktarın. Plakaları cerrahi bantla sarın ve iki gün boyunca karanlıkta oda sıcaklığında birlikte yetiştirin. Birlikte ekimden sonra, kotiledonları abaksiyal tarafı yukarı bakacak şekilde takviye edilmiş bir yarım MS ortamına aktarın.

Cerrahi bantla sarın. Kültürleri floresan ışıklar altında 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ile oda sıcaklığında koruyun. Bir nokta beş ila iki hafta sonra, kotiledonlardan en az iki santimetre uzunluğundaki kökleri çıkarmak için steril forseps ve neşter kullanın ve Ticarcillon / Clavulanate Acid ve Kanamisin ile takviye edilmiş bir yarım MS ortamına aktarın.

On ila 15 kökü tek bir plakaya aktarın. Kök uçlarının konumunu bir işaretleyici ile işaretleyin. Cerrahi bantla sarın ve kültür odasında muhafaza edin.

Bir hafta sonra, seçici besiyerinde dönüşüm köklerinin büyüdüğü görülür. Tercih edilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullanarak DNA ekstraksiyonu için dönüştürülmüş köklerin bir alt örneğini hasat edin. Dönüşümden 11 gün sonra kotiledonlardan çıkan tüylü kökler görülebilir.

Kökler Ticarcillon / Clavulanate Acid üzerinde seçilir ve Kanamisin yaklaşık bir hafta boyunca MS Besiyerinin yarısı ile desteklenir. Gri çubuklar, kaplama sırasında kök uçlarının konumunu gösterir. Bu, dört farklı tüylü kök olayında iki farklı gen hedefine sahip DNA mutasyonlarını belirlemek için PCR ürünlerinin klonlanması ve dizilenmesine bir örnektir.

Gri kutu GN20 GG hedef dizisini ve delta mutasyon tipini gösterir. Belirtilen mutasyona sahip klonların sayısı sağda gösterilmiştir. Bu, DNA mutasyonlarını belirlemek için bir poliakrilamid jel örneğidir.

Büyük delesyonlar ve heterdubleks bantlar, hedef dizilerde DNA mutasyonlarının varlığını gösterir. 12 bağımsız olaydan altısı, delta sembolü ile gösterildiği gibi mutant olarak puanlandı. WT, vahşi tür denetimini ve NT, şablon yok denetimini gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tek bir haftada onlarca ila yüzlerce CRISPR vektörü üretilebilir ve trendülat grubu materyalleri birkaç hafta içinde elde edilebilir. Bu prosedürü denerken, herhangi bir kalıntı Agrobacterium'un büyümesini uzaklaştırmak ve engellemek önemlidir. Agrobacterium'un aşırı büyümesi, herhangi bir kök materyalini inhibe edecek ve öldürecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA montajı kullanılarak CRISPR vektörlerinin nasıl oluşturulacağını ve bu vektörlerin tüylü bir kök model sistemi ve domates kullanılarak nasıl test edileceğini iyi anlamış olmalısınız.