Name: In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin fare fallop tüpünde CRISPR ile somatik genom mühendisliği. Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon kullanarak kanser başlangıcını immünkompetan ortamda çalışın. Bu yöntem spesifik fare hatlarına ihtiyaç duymadan esnek hedefleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Katie Teng ve Dr. Matthew J. Ford'a temsili sonuçlar ve protokol optimizasyonu üretmek için kullanılan plazmidleri sağladıkları için teşekkür eder. K.H., Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS) doktora bursu, Donnor Vakfı, Delta Kappa Gama Dünyası Bursu, Üreme ve Geliştirme Araştırma Merkezi (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin ve Alexander McFee lisansüstü öğrencilikleri tarafından desteklenmiştir.

Hayvanlar, tip II biyogüvenlik kabini içeren özel bir odada bulunan filtre üstlü statik mikroizolasyon kafeslerine yerleştirildi. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve McGill Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi Hayvan Bakım Komitesi (AUP #7843) tarafından onaylandı.
1. Mikroenjeksiyon iğne hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki programa sahip bir mikropipet çektirici kullanarak bir cam kılcal boruyu keskin bir noktaya çekin: P = 500, Isı = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.</li>
	<li>Bir çift konik ultra ince uçlu forseps kullanarak, Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi bir açıklık oluşturmak için diseksiyon mikroskobu altında çekilen kılcal tüpün sivri ucunu kırpın. Açıklığın çok büyük olmadığından emin olun, çünkü bu yumurta kanalına zarar verir ve yavaş enjeksiyonu önler.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig01.jpg"> Resim 1: Mikroenjeksiyon iğnesi hazırlama. (A,B) Bir açıklık (B) oluşturmak için kesilen sivri uçlu (A) çekilmiş kılcal boru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. İntraperitoneal enjeksiyon için anestezinin hazırlanması
<ol><li>Ameliyat gününde filtrelenmiş, seyreltilmiş avertin hazırlayın. Avertin (2,2,2-tribromoetanol) stok çözeltisi, tert-amil alkol içinde 1,6 g/mL konsantrasyonda kuvvetli bir şekilde karıştırılarak hazırlanır ve karanlıkta saklanır.</li>
	<li>Avertin stok çözeltisini% 1.25 v / v izotonik salin ile bir duman davlumbaz içinde 20 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltilmiş vertiği vorteks edin ve 0,22 μm steril bir filtreden geçirin. Karanlıkta kalın.</li>
</ol>3. Ameliyat alanının hazırlanması
<ol><li>Ameliyat alanı özel steril bir ortam, tercihen temiz bir tezgah veya biyogüvenlik kabini olmalıdır. Steril cerrahi ekipmanı, mikroskop, mikromanipülatör ve elektroporatörü gerektiği gibi düzenleyin. Bunun bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Isıtma yastığını/diskini ısıtın ve temiz, tam donanımlı bir kafesin altına yerleştirin. Bu kafes, ameliyattan sonra fareleri barındırmak için kullanılacaktır.</li>
	<li>Steril bir petri kabına steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) dökün. Emici kağıdı yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutlarında kareler halinde kesmek için bir çift temiz makas kullanın. Bu emici kağıt parçalarını ıslatmak için 1x PBS'ye bırakın.</li>
</ol>4. Enjeksiyon için çözelti ve iğnenin hazırlanması
<ol><li>Enjeksiyon solüsyonunu ameliyat günü hazırlayın. DNA / RNA / RNP'leri filtrelenmiş tripan mavisi ile her biri 200 ng / μL ve sırasıyla% 5'lik minimum nihai konsantrasyona kadar karıştırın. Enjeksiyondan önce oda sıcaklığında saklayın. NOT: Kullanmadan önce 0 tripan mavisi almak için 1 mL şırınga kullanın ve 0,22 μm steril filtreden süzün.</li>
	<li>Bundan böyle mikroenjeksiyon iğnesi olarak adlandırılan çekilmiş kılcal iğneyi, manyetik bir montaj ile stabilize edilmiş kelepçe montaj mikromanipülatörüne takın (kurulum Şekil 2B'de gösterilmiştir).</li>
	<li>Enjeksiyon çözeltisinin 2 μL'lik pipetini steril bir Petri kabına yerleştirin. Mikroskop altında gözlemlerken, mikromanipülatöre bağlı hava basınçlı şırıngayı kullanarak bu çözeltinin 1-2 μL'sini yavaşça mikroenjeksiyon iğnesine alın. Kabarcıklardan kaçının / mikroenjeksiyon iğnesine kabarcıklar alın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig02.jpg"> Şekil 2: Ameliyat alanı hazırlığı . (A) Temiz bir tezgah içinde ameliyat alanı kurulumu. (B) Sağ elini kullanan bir birey için diseksiyon mikroskobu ve mikromanipülatör kurulumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Kadın üreme sisteminin açığa çıkarılması
<ol><li>6-8 haftalık bir dişi fareye, filtrelenmiş, seyreltilmiş avertin (anestezik) intraperitoneal olarak 0.25-0.5 mg / g dozunda anestezi uygulayın. Bunu takiben, karprofen (preemptif analjezik) deri altından 5 mg / kg'lık bir dozda uygulayın. NOT: Anestezik olarak kullanılabilecek diğer alternatifler izofluran veya ketamin / ksilazindir.</li>
	<li>Emici kağıdı temiz, ısıtılmış bir ped/disk üzerine yerleştirin. Ardından, anestezi uygulanmış fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bu ısıtılmış emici kağıda yerleştirin. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın. NOT: Elinizin arkasıyla test ederek ısıtma yastığının/diskinin hafifçe dokunulacak kadar sıcak olduğunu onaylayın.</li>
	<li>Anestezi uygulanan farenin ayak parmağını bir çift forseps ile sıkıştırarak derin anestezik arrest için test edin. Prospektif insizyon yerinin etrafındaki sırt kürkünü çıkarın ( Şekil 3A'da gösterilen yer) ve çıplak cildi antiseptik ile silin.</li>
	<li>Çıplak cildi sıkıştırmak için bir çift düz künt forseps kullanın ve bir çift steril keskin künt makas kullanarak vücut orta çizgisi boyunca 1 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun. Kesi etrafındaki alanı antiseptik ile temizleyin.</li>
	<li>Bir çift steril Adson forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Daha sonra, bir çift steril kavisli tırtıklı forseps kullanarak, cildi orta hat insizyonundan başlayarak ve yanal olarak hareket ederek vücut duvarından yavaşça ayırın.</li>
	<li>Yağ yastığını böbreğin altına yerleştirin. Bir çift steril düz künt forseps kullanarak, vücut duvarını doğrudan yağ yastığının üzerine sıkıştırın. Kan damarlarından kaçınmaya özen göstererek, bir çift steril keskin sivri uçlu diseksiyon makası kullanarak vücut duvarında küçük bir kesi oluşturun.</li>
	<li>Vücut duvarını düz künt forsepslerle sıkıştırırken, insizyona bir çift steril künt kavisli forseps yerleştirin ve vücut duvarında oluşturulan kesiyi genişletin.</li>
	<li>Görünür yağ yastığını künt kavisli forseps ile tutun ve yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu ortaya çıkarmak için delikten dışarı çekin.</li>
	<li>Üreme sistemini açıkta tutmak için, yağ yastığını Şekil 3B'de gösterildiği gibi steril bir bulldog kelepçesi ile kelepçeleyin.</li>
</ol>6. In vivo yumurta kanalı enjeksiyonu ve elektroporasyonu
<ol><li>Isıtılmış emici kağıdı ve anestezi uygulanmış fareyi, diseksiyon mikroskobu sahnesine maruz kalan üreme sistemi ile dikkatlice yerleştirin, böylece yol gözlemlenebilir. Mikroskop altında gözlemlenen görünümün bir örneği Şekil 3B'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Mikromanipülatörü ayarlayın, böylece çözelti içeren enjeksiyon iğnesi mikroskop altında da gözlemlenebilir.</li>
	<li>Bir çift steril konik ultra ince uç forseps kullanarak, enjekte edilecek yumurta kanalı bölgesini sabit tutun. Enjekte edilecek bölge mikroenjeksiyon iğnesinin yönüne uygun olmalıdır. NOT: Gerekirse, yolu yavaşça en uygun konuma getirmek / hareket ettirmek için yağ yastığını ve üreme sistemini sabitleyen bulldog kelepçesini kullanın.</li>
	<li>Mikromanipülatörü mikroenjeksiyon iğnesiyle yumurta kanalını delecek şekilde ayarlayın, aynı anda konik ultra ince uç forsepslerini kullanarak yumurta kanalını iğneye besleyin. Yumurtalık kanalına yerleştirildiğini doğrulamak için mikroenjeksiyon iğnesini yavaşça hareket ettirin. NOT: Birden fazla delinmeyi ve enjeksiyon çözeltisinin sızmasını önlemek için mikroenjeksiyon iğnesini sarmal yumurta kanalının dönüm noktası yerine düz bir segmente yerleştirin.</li>
	<li>Mavi çözeltinin hareketini ve mikroskop altında yumurta kanalı lümeninin genişlemesini gözlemlerken, yumurta kanalına yavaşça 1 μL'ye kadar çözelti enjekte edin. Lümenin içine herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin. 0 tripan mavisi enjekte edilen yumurta kanallarının temsili görüntüleri Şekil 3C,D'de gösterilmiştir.</li>
	<li>İğneyi yumurta kanalından çıkarın. Hedeflenecek alanı, steril 1x PBS'ye batırılmış bir parça emici kağıtla örtün (adım 3.3'ten itibaren).</li>
	<li>Önceden ıslatılmış kağıdı ve hedeflenecek alanı/bölgeyi bir çift elektrot cımbızıyla (hedeflenecek bölgenin boyutuna bağlı olarak 1 mm, 3 mm veya 5 mm) kavrayın ve darbe jeneratörü/elektroporatör üzerindeki bu ayarları kullanarak elektroporasyon yapmadan önce gövdeden çekin: 30 V, üç darbe, 1 s aralık, 50 ms darbe uzunluğu, tek kutuplu. NOT: Elektrotlar arasındaki mesafe, elektrotların yumurta kanalını deforme etmeden hedeflenen bölgeye kenetlenebileceği şekilde ayarlanmalıdır. Önerilen mesafe yaklaşık 1 mm'dir.</li>
	<li>Elektroporasyondan sonra, emici kağıdı çıkarın ve fareyi (ısıtılmış emici kağıt altındayken) tekrar bir ısı yastığına yerleştirin. Bulldog kelepçesini açın ve açıkta kalan üreme sistemini vücut duvarının altına dikkatlice geri itin. Diğer taraftaki üreme sistemini ortaya çıkarmak için bölüm 5'i tekrarlayın. NOT: Elektroporasyon, lümen çözelti ile doldurulduğu sürece fare östrus aşamasından bağımsız olarak başarılıdır.</li>
	<li>Açıkta kalan kanalı, kurumasını önlemek için steril 1x PBS'ye batırılmış emici kağıtla örtün, ardından 4.2 ve 4.3 adımlarını tekrarlayarak mikroenjeksiyon iğnesini ikinci enjeksiyon için hazırlayın. NOT: Mikroenjeksiyon iğnesini gerektiği gibi değiştirin. Gerektiğinde steril 1x PBS uygulayarak maruz kalan dokunun kurumasını önleyin.</li>
	<li>Yumurta kanalını karşı tarafa enjekte etmek ve elektroporat etmek için yukarıdaki adımları tekrarlayın. NOT: Göz kayganlaştırıcısını ameliyat sırasında ve sonrasında gerektiği gibi tekrar uygulayın.</li>
	<li>Her iki yumurta kanalı da elektroporate edildikten ve vücut duvarının altına geri yerleştirildikten sonra, dorsal insizyon bölgesini dikiş veya zımbalayın. Dikiş için, ipek örgülü dikişlerin iğnesini kavramak için bir hemostat kullanın (3/8 daire; ölçer: 5-0; iğne boyutu: 18 mm; iplik uzunluğu: 75 cm). Bir çift steril kavisli tırtıklı forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun, ardından yarayı kapatmak için dikişi manipüle etmek için hemostatı kullanın.</li>
	<li>Fareyi ısıtılmış bir pedin/diskin üzerine yerleştirilmiş temiz bir kafese taşıyın (adım 3.2'den itibaren) ve fare etkin olana kadar izleyin.</li>
	<li>Sonraki 3 gün boyunca her 24 saatte bir deri altından 5 mg / kg karprofen uygulayın ve sonraki 10 gün boyunca izleyin.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig03.jpg"> Şekil 3: Kadın üreme sistemine maruz kalma ve mikroenjeksiyon. (A) Rosa-LSLtdDomates faresinin dorsal tarafındaki orta hat insizyonunun yeri (sarı çizgi olarak gösterilir). (B) Kadın üreme sistemine maruz kalma. Yağ yastığı, yolu sabitlemek ve açıkta tutmak için steril bir bulldog kelepçesi kullanılarak kelepçelendi. (C,D) İn vivo yumurta kanalı enjeksiyonunun temsili görüntüleri. Distal ampulla (AMP etiketli) içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirildi ve sistem açıkta kalırken yumurta kanalı lümenine filtrelenmiş% 100 tripan mavisi enjekte edildi (C). Disseke edilmiş bir yumurta kanalının temsili görüntüsü, enjekte edilen tripan mavisi çözeltisinin distal ve proksimal oviduct lümeni (D) boyunca dağıldığını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oviduct%3A+A+key+organ+for+the+success+of+early+reproductive+events%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Frontiers%22%5BJournal%5D)">The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events.</a> Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).</li>
<li>Li, S., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct%3A+roles+in+fertilization+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oviduct: roles in fertilization and early embryo development.</a> The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).</li>
<li>Briceag, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fallopian+tubes--literature+review+of+anatomy+and+etiology+in+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine+and+Life%22%5BJournal%5D)">Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility.</a> Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).</li>
<li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca%3BTp53%3BPten+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature Communications. 8 (1), 1093(2017).</li>
<li>Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+serous+cancer+precursors+in+fallopian+tube+epithelium+of+BRCA1%2F2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers.</a> Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).</li>
<li>Soong, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+lineage+continuity+between+early+serous+proliferations+%28ESPs%29+in+the+Fallopian+tube+and+disseminated+high-grade+serous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas.</a> The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pliancy+and+the+multistep+process+of+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis.</a> Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).</li>
<li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).</li>
<li>Teng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+high-grade+serous+ovarian+carcinoma+using+a+combination+of+in+vivo+fallopian+tube+electroporation+and+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., Yamanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mouse+oviduct+epithelial+cells+using+in+vivo+electroporation+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation.</a> Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).</li>
<li>Maresch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+pancreatic+genome+engineering+and+cancer+induction+by+transfection-based+CRISPR%2FCas9+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice.</a> Nature Communications. 7, 10770(2016).</li>
<li>Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+design+and+execution+of+CRISPR+in+vivo+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens.</a> Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lineage+segregation+between+epiblast+and+primitive+endoderm+in+mouse+blastocysts+through+the+Grb2-MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway.</a> Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analyses+of+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma.</a> Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu ayrıntılı protokoldeki önemli adımlar, DNA / RNA / RNP çözeltisinin yumurta kanalı lümenine mikroenjeksiyonu ve elektroporasyon kuvvetinin ve alanının kontrolüdür. Mikroenjeksiyon sırasında DNA/RNA/RNP solüsyonu sızıntısı istenmeyen bölgelerin/hücrelerin transfeksiyonuna neden olabilir. Tutarlı ve verimli elektroporasyon için, yumurta kanalı lümeninin çözelti ile doldurulması tercih edilir (Şekil 3C, D). Bunun nedeni, elektroporasyon alanının esas olarak elektrot boyutu ve yerleşimi ile kontrol edilmesidir. Zayıf elektroporasyon, elektropore hücrelerin sayısını azaltır ve sert elektroporasyon, istenmeyen hücrelerin elektroporasyonuna neden olabilir veya doku yapısını bozabilir. Elektropora hücrelerin sayısı, DNA / RNA / RNP çözelti konsantrasyonu veya elektroporasyon parametreleri ayarlanarak değiştirilebilir. Bununla birlikte, elektroporasyon sırasında yüksek voltajlar / ısı üretimi dokuya zarar verebileceğinden, bu parametreler canlı / anestezi altındaki farelerde kullanılmadan önce test edilmelidir. Son olarak, bu prosedürün zorlu doğası nedeniyle, bu ameliyatı canlı / anestezi uygulanmış farelere yapmadan önce ölü fareler üzerinde trakta maruz kalma ve mikroenjeksiyon uygulanması önerilir.
Kanser başlangıcında birden fazla genin rol oynadığı kabul edilmektedir, bu nedenle bu olayı özetlemek, birkaç genin çoklu allelik modifikasyonunu gerektirir. Ek olarak, tüm hücrelerin onkojenik mutasyonlara eşit derecede duyarlı olmadığı da bilinmektedir9. Bu nedenle kanser modellemesi, onkojenik hakaretlerin sıkı kontrolünü sağlamak için belirli Cre fare hatları gerektirir. Bununla birlikte, kullanılabilirlikleri ve özgüllükleri, hedeflenmemiş dokulardaki etkiler ve ölümcüllük19 dahil olmak üzere çeşitli zorluklara neden olmaktadır. Ayrıca, geleneksel G-GEMM'ler bakım için yüksek maliyetlere neden olur ve fare hattı oluşturma için zaman gerektirir. CRISPR / Cas9 genom düzenleme teknolojisinin geliştirilmesi ve spesifik somatik hücrelere gen iletiminin iyileştirilmesi, bu sorunların üstesinden gelmemizi sağlamıştır. Bu protokolde, belirli fare hatlarına mutlak ihtiyaç duymadan, kanser modellemesi için kullanılabilecek somatik genom manipülasyonu için bir DNA / RNA / RNP dağıtım yöntemi sunuyoruz12. Lümen içine DNA/RNA/RNP solüsyonları enjekte edilerek ve elektroporasyon bazlı doğum için farklı boyutlarda cımbız tipi elektrotlar kullanılarak, fare yumurtalık kanalı mukozal epitelinin kısıtlı alanları hedeflenmiştir (Şekil 4A-F). Bu, fallop tüpünün distal ucundan kaynaklanan HGSC'lerin başlatılmasının modellenmesinde özellikle yararlıdır.
Sunulan mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyon yöntemi, lümen ile dokuları / organları hedeflemek için çok yönlüdür. Organ parankiminin de bu yöntem kullanılarak hedeflenebilirolması 14. Lentiviral ve adenoviral sistemler gibi viral dağıtım yaklaşımları da benzer amaçlar için kullanılabilir. Bununla birlikte, elektroporasyonun viral dağıtım yaklaşımlarına göre avantajları şunlardır: 1) tek hücrelere çoklu plazmid verilmesi, 2) kesici uç boyutu15 üzerinde herhangi bir kısıtlama olmaması ve 3) alanın ve teslimat zamanlamasının kolay kontrolü. Ayrıca, kökene özgü destekleyiciler kullanılarak hedefleme özgüllüğü geliştirilebilir. Bu, viral ambalajlamadaki sınır nedeniyle viral sistemlerde bazen zordur.
Elektroporasyonun doğası gibi, elektroporasyonlu epitel hücreleri sağlıklı, düzenlenmemiş hücrelerle rastgele serpiştirilir (Şekil 4G). Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş ve değiştirilmemiş hücrelerdeki bu mozaisizm, immünokompetan bir mikro ortamda erken kanser başlangıcının sporadik doğasını özetlediği için kanser başlangıcını incelemek için avantajlı olabilir. Elektropora hücrelerin frekansı, DNA / RNA / RNP çözelti konsantrasyonları ve / veya elektroporasyon parametreleri değiştirilerek ayarlanabilir. Sunulan protokolle birlikte CRISPR-Cas aracılı gen düzenlemesini kullanarak, birden fazla geni taramak ve hedeflenen genlerde heterojen mutasyon / allelik kombinasyon kalıpları oluşturmak kolaydır; Bu, HGSC20,21 gibi önemli sayıda genomik değişiklikle ortaya çıkan kanserlerin modellenmesinde özellikle yararlıdır. Ayrıca, kanser progresyonu sırasında hedeflenen genleri sıralayarak, immünkompetan farelerde tümörlerin ve metastazların in vivo klonal evrimini takip etmek mümkündür12.

Farelerde yumurta kanalı olarak adlandırılan fallop tüpü, uterusu yumurtalıklara bağlayan boru şeklinde bir yapıdır. Memeli üremesinde önemli bir rol oynar, iç döllenme ve preimplantasyon gelişimi için ortam sağlar 1,2. Önemine rağmen, kısmen bu organla ilgili herhangi bir infertilite sorununu aşan in vitro fertilizasyon tekniklerinin gelişmesi nedeniyle işlevi ve homeostazı hakkında çok az şey bilinmektedir3. Bununla birlikte, over karsinomlarının yaklaşık %75'ini ve buna bağlı ölümlerin %85'ini oluşturan agresif bir over kanseri histotipi olan yüksek dereceli seröz over karsinomunun (HGSC) prekanseröz lezyonlarınındistal fallop tüpü epiteli ile sınırlı olduğu kabul edilmiştir 5,6,7,8 . Bu, vücudumuzdaki tüm hücrelerin onkojenik hakaretlere eşit derecede duyarlı olmadığını, bunun yerine her doku / organdaki yalnızca benzersiz / duyarlı hücrelerin kanserde menşe hücre haline geldiğini gösterir - hücresel esneklik9 olarak adlandırılır. Bu doğrultuda, yumurtalığa bitişik olarak bulunan distal fallop tüpünün epitel hücrelerinin, tüpün geri kalanından farklı olduğu gösterilmiştir10,11. Bu nedenle, yumurta kanalındaki tüm hücreleri hedef alan geleneksel HGSC fare modelleri, insan durumunu özetlemez. Yakın tarihli bir çalışmada, distal fare yumurtalık kanalı12,13'teki dört tümör baskılayıcı geni mutasyona uğratarak HGSC'yi başarılı bir şekilde indüklemek için CRISPR aracılı genom düzenleme, in vivo oviduct elektroporasyonu ve Cre tabanlı soy izlemenin bir kombinasyonunu kullandık. Bu yazıda, fare oviduct mukozal epitelini hedef alan bu mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyon prosedürünü açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.
Bu yöntemin birkaç avantajı vardır. Organ parankimleri14 dahil olmak üzere diğer dokuları / organları hedeflemek için uyarlanabilir. Benzer doku / organa özgü hedefleme elde etmek için lentiviral ve adenoviral sistemler gibi diğer in vivo gen dağıtım yaklaşımları kullanılabilse de, hedefleme alanı, elektroporasyon tabanlı dağıtım için farklı boyutlarda cımbız tipi elektrotlar kullanılarak daha kolay ayarlanır. DNA / RNA / ribonükleoproteinlerin (RNP'ler) konsantrasyonuna, elektroporasyon parametrelerine ve elektrotların boyutuna bağlı olarak, elektropora hücrelerin sayısı değiştirilebilir. Ayrıca, Germline genetiği değiştirilmiş fare modellerine (G-GEMM'ler) mutlak ihtiyaç duymadan, Cas9 ekspresyonu için promotorlarla birlikte kullanıldığında spesifik hücre tipleri hedeflenebilir. Ek olarak, viral dağıtım sistemlerinden farklı olarak, elektroporasyon, tek hücrelere çoklu plazmid verilmesine ve insert DNA boyutu15'te daha az kısıtlamaya izin verir. Gen mutasyonlarının in vivo taraması, bu yüksek esneklik nedeniyle göreceli olarak kolaylıkla da yapılabilir. Ayrıca, elektroporate hücreler, bu yöntem Tdtomato veya Confetti16,17 gibi Cre muhabir hatlarıyla birlikte kullanıldığında izlenebilir veya izlenebilir.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; M Steril Filtre Ünitesi&nbsp;</td><td>LifeGene</td><td>SF0.22PES</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Terumo Medical Corportation</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>1 mm cımbız tipi elektrotlar</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P1 <tr><td>3 mm cımbız tipi elektrotlar</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P3 <tr><td>30G x 1/2 İğne</td><td>BD</td><td>305106</td><td>İğne, enjekte edilebilir anestezik veya analjezik kullanıldığında 1 mL şırıngaya takılır.</td></tr><tr><td>Adson forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-000-451</td><td></td></tr><tr><td>Hava basınçlı şırınga</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>Mikromanipülatöre bağlı; Şekil 2B'de gösterildiği gibi</td></tr> <tr><td></td><td>Analjezik</td> <td>-</td> <td>Carprofen, doz: 5mg / kg.</td></tr><tr><td>Antiseptik</td><td>Kardinal Sağlık</td><td>OMEL0000017</td><td>Baxedin: %70 izopropil alkol içinde %2 klorheksidin</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol) - Anestezik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kelepçe montajlı mikromanipülatör</td><td>AD Instruments</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli tırtıklı forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0696845</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Üst ışık için ekli KL 200 LED, Şekil 2B'de ışık kaynağı olarak etiketlenmiştir.</td></tr><tr><td>Göz kayganlaştırıcı</td><td></td> <td>Alcon-Systane</td> <td>merhem (Kayganlaştırıcı göz merhemi)</td></tr><tr><td>Cam kılcal iğneler</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100&ndash; 50-10</td><td>Dış çap: 1 mm, iç çap: 0,5 mm, uzunluk: 10 cm</td></tr><tr><td>Hartman kanama durdurucular</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-711</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı/diski&nbsp;</td><td>-</td><td></td> <td>Bu protokolde SnuggleSafe Pet Bed Mikrodalga Isıtma Yastığı kullanılmıştır. 2-5 dakika mikrodalgada pişirin ve eldivenli elinizin arkasıyla test edin.</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör için Manyetik Montaj</td><td>AD Instruments</td><td>MB-B</td><td>Enjeksiyon sırasında kelepçe montajlı mikromanipülatörü sabit ve dik tutmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Mikro bulldog kelepçesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-230</td><td>3 cm</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>P-97 Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirmesi. Kullanılan program: P = 500, Isı = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>263991</td><td>Otoklavlı/steril cam taşlar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PD8117</td><td>10X PBS, DI su ile 1X'e seyreltildi. Kullanmadan önce otoklavlayın.&nbsp;</td></tr><tr><td>Darbe üreteci/Elektroporatör</td><td>BEX CO., LTD</td><td>CUY21 EDIT II</td><td>Elektroporasyon ayarları: 30 V, 3 darbe, 1 s aralık, P. uzunluk = 50 ms, unipolar</td></tr><tr><td>Rosa-LSLtdDomates fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>7914</td><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td></tr><tr><td>Keskin-künt diseksiyon makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>28251</td><td></td></tr><tr><td>Keskin uçlu diseksiyon makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDI130</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Makinesi</td> <td>-</td><td></td> <td>Tüy dökücü krem de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>İpek örgülü sütürler</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td>3/8 daire, ölçü: 5-0, iğne boyutu: 18 mm, iplik uzunluğu: 75 cm. Zımba teli de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Konik ultra ince uçlu forseps&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>İnce emici kağıt</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>7050</td><td>0.22 ve mikro kullanılarak filtrelenmiş; Mikroenjeksiyon için kullanmadan önce m steril filtre.</td></tr></tbody></table>

in vivo mikroenjeksiyon ve elektroporasyon kullanan somatik genom mühendisliği fare modelleri

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetiği değiştirilmiş fare modelleri (G-GEMM'ler), gelişim, homeostaz ve hastalıkta in vivo gen fonksiyonu hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, koloni oluşturma ve bakımı ile ilgili zaman ve maliyet yüksektir. CRISPR aracılı genom düzenlemesindeki son gelişmeler, ilgilenilen hücreyi / dokuyu / organı doğrudan hedefleyerek somatik GEMM'lerin (S-GEMM'ler) üretilmesine izin vermiştir.
İnsanlarda yumurta kanalı veya fallop tüpü, en yaygın yumurtalık kanseri, yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomlarının (HGSC'ler) menşe dokusu olarak kabul edilir. HGSC'ler, yumurtalığa bitişik olarak bulunan uterusa distal fallop tüpü bölgesinde başlar, ancak proksimal fallop tüpü değildir. Bununla birlikte, HGSC'nin geleneksel fare modelleri tüm yumurta kanalını hedefler ve bu nedenle insan durumunu özetlemez. Bu çalışmada, yumurta kanalı boyunca kısıtlı bölgelerdeki mukozal epitel hücrelerini hedeflemek için yumurta kanalı lümenine DNA, RNA veya ribonükleoprotein (RNP) çözeltisi mikroenjeksiyonu ve in vivo elektroporasyon yöntemi sunulmaktadır. Kanser modellemesi için bu yöntemin çeşitli avantajları vardır, örneğin 1) elektroporasyon alanını / dokusunu / organını ve bölgesini hedeflemede yüksek adaptasyon, 2) Cas9 ekspresyonu için spesifik promotörlerle birlikte kullanıldığında hedeflenen hücre tiplerinde yüksek esneklik (hücresel esneklik), 3) elektropora hücrelerin sayısında yüksek esneklik (nispeten düşük frekans), 4) spesifik bir fare çizgisi gerekmez (immünokompetan hastalık modellemesi), 5) gen mutasyonu kombinasyonunda yüksek esneklik ve 6) bir Cre muhabir hattı ile kombinasyon halinde kullanıldığında elektropora hücreleri izleme olasılığı. Böylece, bu uygun maliyetli yöntem insan kanseri başlangıcını özetler.

Şekil 1 ve Şekil 2, fare yumurtalık kanalının in vivo mikroenjeksiyonu ve elektroporasyonu için sırasıyla mikroenjeksiyon iğnesi hazırlığı ve cerrahi alan kurulumunu göstermektedir. Ameliyat sırasında anestezi uygulanan Rosa-LSLtdDomates (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 farenin sırt derisinde (Şekil 3A) ve vücut duvarında yapılan kesilerle kadın üreme sistemi açığa çıkarıldı. Bir bulldog kelepçesi, açıkta ve sabitlenmiş halde tutmak için kanalın üzerindeki yağ yastığına kelepçelendi (Şekil 3B). 400 ng/μL konsantrasyonda PCS2 CreNLS plazmidleri18 içeren enjeksiyon çözeltisi, sarmal yumurta kanalının ampullasına (AMP etiketli) enjekte edildi ve yumurta kanalı lümeni boyunca dağılmasına izin verildi (Şekil 3C, D). Bu makalede temsili sonuçlar üretmek için PCS2 CreNLS plazmidleri kullanılmasına rağmen, tarif edilen yöntem, fare yumurtalık kanalında CRISPR / Cas aracılı gen düzenlemesi için enjeksiyon çözeltisinde kolayca değiştirilebilir DNA / RNA / RNP'lerle kullanılabilir. Daha sonra, 1 mm veya 3 mm cımbız tipi elektrotlar, distal yumurta kanalı elektroporasyon bazlı dağıtım için elektrotlar arasında olacak şekilde konumlandırıldı.
Yumurtalıklar ameliyattan 4 gün sonra toplandı ve elektroporasyon özgüllüğünü görselleştirmek için mezosalpinks çıkarılarak gerildi. 1 mm veya 3 mm cımbız tipi elektrotlar kullanılarak, TdDomates ile etiketlenmiş hedeflenen alan distal oviduct epiteli ile sınırlandırılmıştır (Şekil 4A,D). Bu hedeflenen alanın boyutu, farklı boyutlardaki elektrotlar kullanılarak daha da kontrol edildi. 3 mm cımbız tipi elektrotlar kullanarak, 1 mm cımbız tipi elektrotlar kullanarak yalnızca en distal uç olan INF'yi (Şekil 4E, F) hedeflemeye kıyasla, AMP'nin çok daha geniş bir alanını (Şekil 4B, C) hedefledik. Bu hasat edilen yumurta kanalları sabitlendi, bir sakkaroz gradyanı ile muamele edildi ve ayrıntılı analizler için bir kriyostat kullanılarak bölümlere ayrıldı. Kesitler sırasıyla Hoescht 33342 ve Phalloidin ile çekirdekleri ve hücre iskeletini boyamak için boyandı, daha sonra nokta taramalı bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Hedeflenen bölgede, TdDomates ile işaretlenmiş elektropore hücreler, elektropore olmayan (TdTomato-ve) hücreler arasında rastgele dağıtıldı (Şekil 4G). Ek olarak, elektropora hücreler mukozal epitel ile sınırlıydı ve altta yatan stromal veya kas tabakasında bulunamadı (Şekil 4G, H). Son olarak, CRISPR-Cas aracılı gen düzenlemesini doğrulamak için, TdTomato+ve hücreleri, DNA izolasyonu ve MiSeq dizilimi12 için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile izole edilebilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig04.jpg"> Şekil 4: Ameliyattan 4 gün sonra yumurtalık epitel hücrelerinin başarılı in vivo enjeksiyon ve elektroporasyonunun doğrulanması. (A-C) 3 mm boyutlu cımbız tipi elektrotlar kullanılarak elektroporasyon. Elektroporasyon özgüllüğünün (A) daha iyi görselleştirilmesi için mezosalpinks çıkarılarak yumurta kanalı açıldı. TdDomates ekspresyonu ile tanımlanan elektroporasyon alanı, AMP (B, C) etiketli distal oviduct ile sınırlıydı. (D-F) 1 mm boyutlu cımbız tipi elektrotlar kullanılarak elektroporasyon. Elektroporasyon özgüllüğünün (D) daha iyi görselleştirilmesi için mezosalpinks çıkarılarak yumurta kanalı açıldı. Elektroporasyon alanı, yumurta kanalının en distal ucu olan infundibulum (INF etiketli) ile sınırlıydı (E, F). (G,H) PCS2 CreNLS plazmidleri ile elektroporasyondan 4 gün sonra distal oviductun enine kesiti. Tddomates (G) ile etiketlenmiş elektropora hücreler epitel monokatmanı (H) ile sınırlandırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Sunulan protokol, fare yumurtalık kanalında genom manipülasyonu için oldukça esnek bir yöntemdir. İmmünkompetan ortamda düzenlenmemiş hücrelerle çevrili sporadik olarak mutasyona uğramış hücrelerin oluşumuna izin verir. Bu, kanser başlangıcını incelemek için avantajlıdır.Bu tekniğin temel avantajı, bir fare çizgisine mutlak ihtiyaç duymadan, kolayca değiştirilebilir mutasyon kombinasyonları setleriyle ilgilenilen bir organı, alanı, bölgeyi veya hücre tipini hedeflemede yüksek uyarlanabilirlik sağlamasıdır. Bu yöntem, lümenli organlarda ve organ parankiminde kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Başlamak için, bir mikropipet çektirici kullanarak bir cam kılcal boruyu keskin bir noktaya çekin.Bir çift konik, ultra ince uçlu forseps kullanarak, bir açıklık oluşturmak için diseksiyon mikroskobu altında çekilen kılcal tüpün sivri ucunu kesin. Açıklığın çok büyük olmadığından emin olun, çünkü yumurta kanalına zarar verir ve yavaş enjeksiyonu önler. Daha sonra, steril cerrahi ekipmanı, mikroskop, mikromanipülatör ve elektroporatörü temiz, steril bir tezgahta veya biyogüvenlik kabininin içinde düzenleyin.Isıtma yastığını bir disk üzerinde ısıtın ve temiz, tam donanımlı bir kafesin altına yerleştirin. Steril 1X PBS'yi bir Petri kabına dökün. Bir çift temiz makas kullanarak, emici kağıdı birer birer santimetre kareler halinde kesin.Islatmak için bunları PBS'ye bırakın. Daha sonra, çekilen kılcal iğneyi, manyetik bir montajla stabilize edilmiş kelepçe montajlı mikromanipülatöre takın. Enjeksiyon çözeltisinin iki mikrolitresini steril bir Petri kabına pipetin.Mikroskop altında gözlemlerken, mikromanipülatöre bağlı hava basınçlı şırıngayı kullanarak enjeksiyon çözeltisinin bir ila iki mikrolitresini yavaşça mikroenjeksiyon iğnesine alın. İğnede kabarcıklar almaktan kaçının. Altı ila sekiz haftalık bir dişi fareyi uyuşturduktan ve karprofeni deri altından uyguladıktan sonra, fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtılmış emici kağıda yerleştirin.Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın. Ayak parmağını bir çift forseps ile sıkıştırarak anestezik arresti doğruladıktan sonra, olası insizyon bölgesinin etrafındaki sırt kürkünü çıkarın ve çıplak cildi antiseptik ile silin. Çıplak cildi sıkıştırmak için bir çift düz, künt forseps kullanın ve bir çift steril makas kullanarak vücut orta çizgisi boyunca bir santimetre uzunluğunda bir kesi oluşturun.Bir çift steril Adson forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Daha sonra, bir çift steril, kavisli, tırtıklı forseps kullanarak, cildi orta hat insizyonundan başlayarak ve yanal olarak hareket ederek vücut duvarından yavaşça ayırın. Yağ yastığını böbreğin altına yerleştirdikten sonra, vücut duvarını doğrudan yağ yastığının üzerine sıkıştırmak için bir çift steril, düz, künt forseps kullanın.Kan damarlarından kaçınmaya özen göstererek bir çift steril, keskin, sivri uçlu diseksiyon makası kullanarak vücut duvarında küçük bir kesi oluşturun. Vücut duvarını düz, künt, forseps ile sıkıştırırken, insizyona bir çift steril, künt, kavisli forseps yerleştirin ve vücut duvarında oluşturulan kesiyi genişletin. Görünür yağ yastığını künt, kavisli, forseps ile tutun ve yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu ortaya çıkarmak için delikten dışarı çekin.Yağ yastığını steril bir bulldog kelepçesiyle sıkıştırarak üreme izini açıkta tutun. Anestezi uygulanan fareyi, diseksiyon mikroskobunun sahnesine maruz kalan üreme izi ile dikkatlice yerleştirin. Mikromanipülatörü, çözelti ile enjeksiyon iğnesi mikroskop altında gözlenecek şekilde ayarlayın.Daha sonra yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu kolayca gözlemlemek için mikroskobu manipüle edin. Bir çift steril, konik, ultra ince uçlu forseps kullanarak, enjekte edilecek yumurta kanalı bölgesini tutun. Bölge mikroenjeksiyon iğnesinin yönü ile aynı hizada olmalıdır.Mikromanipülatörü mikroenjeksiyon iğnesiyle yumurta kanalını delecek şekilde ayarlayın, aynı anda konik, ultra ince uçlu forsepsleri kullanarak yumurta kanalını iğneye besleyin. Yumurtalık kanalına yerleştirildiğini doğrulamak için mikroenjeksiyon iğnesini yavaşça hareket ettirin. Mavi çözeltinin hareketini ve yumurta kanalı lümeninin genişlemesini gözlemlerken, enjeksiyon çözeltisinin bir mikrolitresini ve% 5 filtrelenmiş tripan mavisini yavaşça yumurta kanalına enjekte edin.Lümenin içine herhangi bir kabarcık sokmaktan kaçının. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yumurta kanalından çıkarın ve hedeflenecek alanı PBS'ye önceden batırılmış bir emici kağıt parçası ile örtün. Önceden ıslatılmış kağıdı ve hedeflenecek alanı bir çift elektrot cımbızıyla kavrayın ve vücuttan uzaklaştırın.Bir saniyelik aralıklarla 50 milisaniye boyunca 30 voltta üç tek kutuplu darbe kullanarak hedef bölgeyi elektroporlayın. Elektroporasyondan sonra, emici kağıdı çıkarın ve fareyi tekrar ısıtma yastığına yerleştirin. Bulldog kelepçesini açın ve açıkta kalan üreme izini vücut duvarının altına dikkatlice geri itin.Her iki yumurta kanalı da elektropoize edildikten ve vücut duvarının altına geri yerleştirildikten sonra, iğneyi kavramak için bir iğne tutucu kullanın. Bir çift steril, kavisli, tırtıklı forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Ardından, dikişi manipüle etmek ve yarayı kapatmak için iğne tutucuyu kullanın.Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilmiş temiz bir kafese taşıyın ve fare aktif olana kadar izleyin. Üç veya bir milimetrelik cımbız tipi elektrotlar kullanılarak elektroporasyon üzerine, TdDomates ile etiketlenmiş hedeflenen alan distal oviduct epiteli ile sınırlandırıldı. Üç milimetrelik cımbız tipi elektrotlarla, bir milimetrelik cımbız tipi elektrotlar kullanılarak sadece distal en uç olan infundibulum'u hedeflemeye kıyasla ampullaların çok daha geniş bir alanı hedeflenmiştir.Hedeflenen bölgede, TdDomates ile işaretlenmiş elektropore hücreler, elektropore olmayan hücreler arasında rastgele dağıtıldı. Ek olarak, elektropore hücreler mukozal epitel ile sınırlıydı ve altta yatan stromal veya kas tabakasında gözlenmedi. CRISPR aracılı genom düzenlemesini doğrulamak için, floresan hücre, DNA izolasyonu ve dizilimi için FACS sıralama ile izole edilebilir.Bu, hedeflenen alellerin sıklığını ölçmemize, primer tümörün in vivo koronal evrimini ve immünokompetan ortamda metastazı takip etmek için numune arasındaki benzersiz iletişimi izlememize olanak tanır.

somatic-genome-engineered-mouse-models-using-vivo-microinjection

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA'sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Oviductal Nükleik Asitler Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme  (I-GONAD) yönteminin etkinliği, donör dişilerden zigot toplanmasını ve yalancı hamile kadınlara aktarılmasını gerektiren geleneksel mikroenjeksiyon ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 ile indüklenen mutasyonları kromozom 6'daki ROSA26 lokusuna sokarak etkinliğini gösterir.

Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

Öğrenin fare fallop tüpünde CRISPR ile somatik genom mühendisliği. Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon kullanarak kanser başlangıcını immünkompetan ortamda çalışın. Bu yöntem spesifik fare hatlarına ihtiyaç duymadan esnek hedefleme sağlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Daha fazla video keşfet