In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

Sunulan protokol, fare yumurtalık kanalında genom manipülasyonu için oldukça esnek bir yöntemdir. İmmünkompetan ortamda düzenlenmemiş hücrelerle çevrili sporadik olarak mutasyona uğramış hücrelerin oluşumuna izin verir. Bu, kanser başlangıcını incelemek için avantajlıdır.

Bu tekniğin temel avantajı, bir fare çizgisine mutlak ihtiyaç duymadan, kolayca değiştirilebilir mutasyon kombinasyonları setleriyle ilgilenilen bir organı, alanı, bölgeyi veya hücre tipini hedeflemede yüksek uyarlanabilirlik sağlamasıdır. Bu yöntem, lümenli organlarda ve organ parankiminde kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Başlamak için, bir mikropipet çektirici kullanarak bir cam kılcal boruyu keskin bir noktaya çekin.

Bir çift konik, ultra ince uçlu forseps kullanarak, bir açıklık oluşturmak için diseksiyon mikroskobu altında çekilen kılcal tüpün sivri ucunu kesin. Açıklığın çok büyük olmadığından emin olun, çünkü yumurta kanalına zarar verir ve yavaş enjeksiyonu önler. Daha sonra, steril cerrahi ekipmanı, mikroskop, mikromanipülatör ve elektroporatörü temiz, steril bir tezgahta veya biyogüvenlik kabininin içinde düzenleyin.

Isıtma yastığını bir disk üzerinde ısıtın ve temiz, tam donanımlı bir kafesin altına yerleştirin. Steril 1X PBS'yi bir Petri kabına dökün. Bir çift temiz makas kullanarak, emici kağıdı birer birer santimetre kareler halinde kesin.

Islatmak için bunları PBS'ye bırakın. Daha sonra, çekilen kılcal iğneyi, manyetik bir montajla stabilize edilmiş kelepçe montajlı mikromanipülatöre takın. Enjeksiyon çözeltisinin iki mikrolitresini steril bir Petri kabına pipetin.

Mikroskop altında gözlemlerken, mikromanipülatöre bağlı hava basınçlı şırıngayı kullanarak enjeksiyon çözeltisinin bir ila iki mikrolitresini yavaşça mikroenjeksiyon iğnesine alın. İğnede kabarcıklar almaktan kaçının. Altı ila sekiz haftalık bir dişi fareyi uyuşturduktan ve karprofeni deri altından uyguladıktan sonra, fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtılmış emici kağıda yerleştirin.

Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın. Ayak parmağını bir çift forseps ile sıkıştırarak anestezik arresti doğruladıktan sonra, olası insizyon bölgesinin etrafındaki sırt kürkünü çıkarın ve çıplak cildi antiseptik ile silin. Çıplak cildi sıkıştırmak için bir çift düz, künt forseps kullanın ve bir çift steril makas kullanarak vücut orta çizgisi boyunca bir santimetre uzunluğunda bir kesi oluşturun.

Bir çift steril Adson forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Daha sonra, bir çift steril, kavisli, tırtıklı forseps kullanarak, cildi orta hat insizyonundan başlayarak ve yanal olarak hareket ederek vücut duvarından yavaşça ayırın. Yağ yastığını böbreğin altına yerleştirdikten sonra, vücut duvarını doğrudan yağ yastığının üzerine sıkıştırmak için bir çift steril, düz, künt forseps kullanın.

Kan damarlarından kaçınmaya özen göstererek bir çift steril, keskin, sivri uçlu diseksiyon makası kullanarak vücut duvarında küçük bir kesi oluşturun. Vücut duvarını düz, künt, forseps ile sıkıştırırken, insizyona bir çift steril, künt, kavisli forseps yerleştirin ve vücut duvarında oluşturulan kesiyi genişletin. Görünür yağ yastığını künt, kavisli, forseps ile tutun ve yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu ortaya çıkarmak için delikten dışarı çekin.

Yağ yastığını steril bir bulldog kelepçesiyle sıkıştırarak üreme izini açıkta tutun. Anestezi uygulanan fareyi, diseksiyon mikroskobunun sahnesine maruz kalan üreme izi ile dikkatlice yerleştirin. Mikromanipülatörü, çözelti ile enjeksiyon iğnesi mikroskop altında gözlenecek şekilde ayarlayın.

Daha sonra yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu kolayca gözlemlemek için mikroskobu manipüle edin. Bir çift steril, konik, ultra ince uçlu forseps kullanarak, enjekte edilecek yumurta kanalı bölgesini tutun. Bölge mikroenjeksiyon iğnesinin yönü ile aynı hizada olmalıdır.

Mikromanipülatörü mikroenjeksiyon iğnesiyle yumurta kanalını delecek şekilde ayarlayın, aynı anda konik, ultra ince uçlu forsepsleri kullanarak yumurta kanalını iğneye besleyin. Yumurtalık kanalına yerleştirildiğini doğrulamak için mikroenjeksiyon iğnesini yavaşça hareket ettirin. Mavi çözeltinin hareketini ve yumurta kanalı lümeninin genişlemesini gözlemlerken, enjeksiyon çözeltisinin bir mikrolitresini ve% 5 filtrelenmiş tripan mavisini yavaşça yumurta kanalına enjekte edin.

Lümenin içine herhangi bir kabarcık sokmaktan kaçının. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yumurta kanalından çıkarın ve hedeflenecek alanı PBS'ye önceden batırılmış bir emici kağıt parçası ile örtün. Önceden ıslatılmış kağıdı ve hedeflenecek alanı bir çift elektrot cımbızıyla kavrayın ve vücuttan uzaklaştırın.

Bir saniyelik aralıklarla 50 milisaniye boyunca 30 voltta üç tek kutuplu darbe kullanarak hedef bölgeyi elektroporlayın. Elektroporasyondan sonra, emici kağıdı çıkarın ve fareyi tekrar ısıtma yastığına yerleştirin. Bulldog kelepçesini açın ve açıkta kalan üreme izini vücut duvarının altına dikkatlice geri itin.

Her iki yumurta kanalı da elektropoize edildikten ve vücut duvarının altına geri yerleştirildikten sonra, iğneyi kavramak için bir iğne tutucu kullanın. Bir çift steril, kavisli, tırtıklı forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Ardından, dikişi manipüle etmek ve yarayı kapatmak için iğne tutucuyu kullanın.

Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilmiş temiz bir kafese taşıyın ve fare aktif olana kadar izleyin. Üç veya bir milimetrelik cımbız tipi elektrotlar kullanılarak elektroporasyon üzerine, TdDomates ile etiketlenmiş hedeflenen alan distal oviduct epiteli ile sınırlandırıldı. Üç milimetrelik cımbız tipi elektrotlarla, bir milimetrelik cımbız tipi elektrotlar kullanılarak sadece distal en uç olan infundibulum'u hedeflemeye kıyasla ampullaların çok daha geniş bir alanı hedeflenmiştir.

Hedeflenen bölgede, TdDomates ile işaretlenmiş elektropore hücreler, elektropore olmayan hücreler arasında rastgele dağıtıldı. Ek olarak, elektropore hücreler mukozal epitel ile sınırlıydı ve altta yatan stromal veya kas tabakasında gözlenmedi. CRISPR aracılı genom düzenlemesini doğrulamak için, floresan hücre, DNA izolasyonu ve dizilimi için FACS sıralama ile izole edilebilir.

Bu, hedeflenen alellerin sıklığını ölçmemize, primer tümörün in vivo koronal evrimini ve immünokompetan ortamda metastazı takip etmek için numune arasındaki benzersiz iletişimi izlememize olanak tanır.