Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit veya EAE modelinin genel amacı, multipl skleroz gelişiminin altında yatan potansiyel moleküler mekanizmaların incelenmesini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, multipl skleroz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, bağışıklık hücreleri hastalığın hangi aşamasında merkezi sinir sistemine sızar? Bu tekniğin temel avantajı, EAE modelinin, demiyelinizasyon ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu gibi multipl sklerozun birçok temel özelliğini taklit etmesidir.

Bu tekniğin etkileri multipl skleroz tedavisine kadar uzanır, çünkü bu yöntemle test edilen ilaçlar bu hastalık için zaten onaylanmıştır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, EAE'yi indüklerken dikkate alınması gereken kapsamlı koşullar olduğu için mücadele edeceklerdir. Fareler stressiz bir ortamda tutulmalı ve boğmaca toksini taze olarak hazırlanmalıdır.

Bu yöntemin resmi olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü lenf düğümlerinin izolasyonu ve omuriliğin çıkarılmasının tek başına tanımlama ile öğrenilmesi zordur. 10 ila 13 haftalık dişi farelere 200 mikrogram miyelin oligodendrosit glikoproteini enjekte ederek başlayın. 400 mikrogram mycobacterium tuberculosis içeren 200 mikrolitre tam Freund adjuvanında emülsifiye edilmiştir.

Hemen ve 24 saat sonra, intraperitoneal olarak farelere 200 mikrolitre PBS'de 0.2 mikrogram boğmaca toksini enjekte edin. Farelerin, klinik semptomların gelişmesini önleyebilecek stresi indüklemek için EAE indüksiyonundan önce hem işleme hem de deneysel ortama adapte edilmiş olması önemlidir. Enjeksiyondan bir hafta sonra, fareleri tabloda tarif edildiği gibi klinik semptomlar açısından günlük olarak inceleyin.

EAE'nin neden olduğu lenf nodu bağışıklık hücresi popülasyonunu değerlendirmek için, indüksiyon sonrası uygun zaman noktasında, insizyon alanını %80 izopropanol ile ıslatın ve kalça bölgesi üzerindeki cildi dikkatlice çıkarın. Forseps kullanarak, kasık lenf düğümünü yağ dokusundan dikkatlice çıkarın. Ardından düğümü tartın ve numuneyi PBS'ye buz üzerine yerleştirin.

Omurilik hücrelerini analiz etmek için, hayvanın sırtını izopropanol ile ıslatın ve omurgayı uzunlamasına bir kesim yapmak için bir neşter kullanın. Sonra cildi çıkarın ve omurganın bel kısmını inceleyerek arka bacakları innerve edin. Omuriliği çıkarmak için omurgayı PBS dolgulu bir şırınga ile yıkayın.

Bel kordonunun yaklaşık 1 / 3'ünü çıkardıktan sonra, omurga parçasını tartın ve dokuyu PBS'de buz üzerinde saklayın. Splenik bağışıklık hücresi popülasyonunu analiz etmek için, karnın alt kısmına erişmek için dokuyu açın. Daha sonra dalağı çıkarın ve dokunun yaklaşık 1 / 8'ini kesin.

Dalak parçasını tartın ve dokuyu PBS'de buz üzerinde saklayın. Daha sonra, dokunun geri kalanını 50 mililitrelik bir tüp üzerinde 70 mikronluk bir elek boyunca yumuşatmak için iki mL'lik bir şırıngadan pistonu kullanın, ardından süzgecin beş mililitrelik bir PBS yıkamasını izleyin. Filtrelenmiş hücreleri santrifüjleyin.

Peleti 500 mikrolitre hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, peleti PBS'de 100 mikrolitre% 0.2 BSA içinde yeniden süspanse edin ve hücrelere iki mikrolitre Fc reseptörü bir bloke edici tampon ekleyin.

Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika geçirdikten sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika daha 13 mikrolitre antikor kokteyli ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de en az iki kez yıkayın ve son peleti 500 mikrolitre taze PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri buz üzerindeki bir akış sitometri tüpüne aktarın.

Son olarak, numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, akış sitometrisi ölçümünden hemen önce, mutlak hücre sayımlarını belirlemek için hücrelere 30 mikrolitre akış sitometrik mutlak sayım standardı ekleyin. Ardından numuneleri akış sitometresinde analiz edin. Bu şekilde gösterildiği gibi, EAE indüksiyonunun akut fazı sırasında lenf düğümleri içindeki tüm bağışıklık hücresi popülasyonlarında geçici bir artış gözlenir.

Bununla birlikte, dalakta sadece makrofajlar, B hücreleri, T hücreleri ve nötrofiller artmış bir infiltrasyon gösterir. Kanda, tüm bağışıklık hücresi popülasyonları, hastalığın akut fazı sırasında lomber omurilikte benzer bir hastalığa bağlı artışa karşılık gelen klinik öncesi faz sırasında periferik dolaşımlarında geçici bir artış gösterir, monosit popülasyonu hariç, muhtemelen omuriliğe girdikten sonra makrofajlara farklılaşır. Burada, farklı hücre popülasyonlarının değerlendirilmesi için geçit stratejisi gösterilmektedir.

Hücre sayısı, mutlak hücre sayısını yansıtan, analiz edilen doku veya kan hacmi miktarı ile ilgilidir. Lenf düğümlerinde klinik öncesi dönemde IL-23 mRNA ekspresyonu artarken, IL-6 ekspresyonu hastalığa bağlı olarak artar. Dalakta IL-6 ve IL-23 ekspresyonu klinik öncesi fazda artarken, IL-1 beta mRNA ekspresyonu hastalığın başlangıcına kadar etkilenmez.

Kanda, sadece TNF-alfa mRNA'nın ekspresyonu yukarı regüle edilir ve hastalığa bağımlı bir şekildedir. Lomber omurilikte, akut faz sırasında TNF-alfa, IL-1 beta ve interferon gama indüklenirken, IL-6 sadece hastalığın başlangıç fazında yukarı regüle edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, EAE modeli, müteakip hücre izolasyonu ve etki analizi, uygun şekilde gerçekleştirilirse on fare için sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, mRNA ekspresyon analizinin sonuçlarını doğrulamak için Western Blot veya ELISA gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, multipl skleroz alanındaki araştırmacıların merkezi sinir sistemindeki demiyelinizasyon mekanizmasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, EAE modelini nasıl indükleyeceğinizi ve tekrarlanabilir akış sitometrisi sonuçları elde etmek için bağışıklık hücrelerini nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Tam Freund adjuvanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlem yapılırken farenin derisini kaldırmak ve şırınganın tam cilt penetrasyonunu sağlamak gibi önlemler alınmalıdır.