Name: Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin deneysel otoimmün ensefalomyelit indüksiyonunu ve bağışıklık hücrelerinin çeşitli dokulardaki dağılımını farelerde. Akış sitometrisi ve PCR ile multipl skleroz mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Else Kröner-Fresenius Vakfı (EKFS) Araştırma Eğitim Grubu Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) ve Hessen Eyaleti'nin "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" tarafından desteklenmiştir.

ETİK TABLOSU: Bizim deneysel prosedürler Regierungspräsidium Darmstadt (Almanya) Etik Komitesi tarafından onaylanmış Ulusal ve Avrupa düzenlemelerine teyit edilmiştir. Tüm çabalar hayvan acı en aza indirmek ve kullanılan hayvanların sayısını azaltmak için yapılmıştır. 1. EAE Modeli <ol><li> EAE modeli indüksiyonu <ol><li> EAE uyarılması için 10 ila 13 haftalık dişi 129S4 / SvJae x C57BL / 6 fareleri kullanın. </li><li> Üst içine farelere subkutan enjeksiyon verin ve ensefalitojenik MOG 35, bel - 400 ug Mycobacterium tuberculosis içeren 200 ul komple Freund`s adjuvan (CFA) emülsifiye 55 (miyelin oligodendrosit glikoprotein) peptid (200 ug). Not: negatif olmayan hastalık yapıcı sham kontrol olarak, aynı hacimde, aynı yoldan, Mycobacterium tuberculosis ihtiva eden tam olmayan Freund katkı maddesi kullanılabilir. </li><li> Thereafter ve tekrar 24 saat sonra, fareler (200 ul fosfat tamponlu tuzlu su, PBS içinde seyreltilmiş, toplam 0.2 ug), boğmaca toksininin intraperitoneal verir. sağlıklı hayvanlar ile hastalıklı karşılaştırma yapabilmek için, kontrol grubu olarak tedavi görmeyen farelere kullanın. Not: 200 EAE uyarılması da mümkündür - 300 ug MOG 35-55 peptidi, 300 - CFA içinde Mycobacterium tuberculosis, 500 ug ve 0.2 - enjeksiyon başına 0.2 ml - 0.3 ug pertussis toksin 0.1 hacminde. </li><li> fareler klinik semptomlar günlük, enjeksiyondan sonra bir hafta Schulabschluss başlayarak (adım 1.2.1 bakınız) Not: Hastalık başlama gün farklı deneylerde değişir, ancak laboratuarımızda koşullar altında, bu gün 11 civarındadır ve bu nedenle, burada gün 14 3 gün hastalığın başlangıcından sonra, olarak tanımlanır. Mevcut çalışmadaki tüm fareler, klinik semptomlar geliştirmiştir. </li></ol></li><li> Farelerin Puanlama <ol><li> aşağıdaki gibi klinik skorlar tarafından klinik belirtiler sınıflandırır:0) hiçbir işaret, kuyruk 0.5) distal felci, 1) kuyruk tam felç, 1.5) gevşek kuyruk ve arka bacaklarda hafif güçsüzlük, 2) gevşek kuyruk ve arka bacaklarda şiddetli halsizlik, 2.5) gevşek kuyruk ve felç bir arka bacak, 3) gevşek kuyruk ve her iki arka ayakları felç, arka bacaklarda ve bir ön bacak zayıflığı hem 3.5) paralizi (bu puanı elde fareler) yerel etik kurallara uygun olarak, ötenazi uygulandı. </li></ol></li></ol> Sitometrisi Analizi Tek Hücre 2. Hazırlık Not: Antikor karışımı 1 ul CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0.5 ul CD11b-eFluor605, 0.5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 ul CD3 PE-CF594, CD4 V500, 0.5 ul CD11c oluşmaktadır -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 ve 1 ul Ly6G-APC-Cy7. Not: Eğer kan, lenf düğümü, dalak ve omuriliği alırsak aşağıdaki şekilde prosedür: Fareler derinden isofl bir kombinasyonu ile anestezi edilirURANE ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) (dakika başına karbojen içinde% 2). Sonraki, Toraks açmak bir Intracardial sopayla kan kaldırmak ve soğuk PBS ile intrakardiyak fareler serpmek. Sonra dalak tarafından takip lenf düğümleri ve nihayet omuriliği çıkarın. Eğer intrakardiyak fareler serpmek gerek yoksa o zaman boyun çıkık ile derin anestezi altında fareler euthanize. <ol><li> splenositlerin izole edilmesi <ol><li> izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın. </li><li> % 80 izopropanol ile ıslak kesi alanı makas kullanarak, kıllar ile herhangi bir kirlenmeyi önlemek ve daha derin dokulara delmeden, uzunlamasına toraks açın. </li><li> Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek. Not: dalak göğüs kafesine altında sol superior kadranda yer almaktadır. Dalak incelenmesi gereken yalnızca, bu organın retai için perfüzyon önce kaldırılmış olabilirilgi N, tüm hücre tipleri. </li><li> dalak çıkarın ve yaklaşık 1/8 kesti ve tartın. Buz üzerinde PBS içerisinde örnek saklayın. </li><li> 2 ml şırınga pistonu kullanarak, (50 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirilen) 70 mikron elekten dalak doku sıkın. </li><li> 5 ml PBS ile örgü yıkayın. 3 dakika boyunca 1.800 xg&#39;de santrifüj. çözüm yokedici 500 ul pelletini. Not: Bu aşamada, daha sonra, alternatif bir FACS analizi yöntemi boncuk (bölüm 3) kullanmaz kullanılırsa, eğer farklı hücre sayısı için gerekli olabilir. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inkübe ve 500 ul PBS ilave edin. Oda sıcaklığında 650 xg (RT) 6 dakika santrifüjlenir. </li><li> 500 ul PBS ile yıkama adımı yineleyin. 100 ul% 0.2 sığır serum albümini (BSA) hücre pelletini, Süpernatant atılır / PBS, 2 ul Fc reseptörü-1 (FcRI) bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 13 ul bir eklemetibody Karışım karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g&#39;de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. süpernatant atın. Not: Üreticinin boyama işlemi, tek bir yıkama önerir, ancak arka plan boyaması ek bir azalma, isteğe bağlı olarak yıkama aşamasından, bir ya da iki kez daha tekrarlanarak elde edilebilir. </li><li> (Potansiyel hücre topaklanma azaltmak için protein ayırma veya muhtemelen çalışan tampon) ve tüp flow sitometri transfer hücre 500 ul PBS içinde pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> Lenf nod hücrelerinin izolasyonu <ol><li> izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın. </li><li> % 80 izopropanol ile ıslak kesi alanı ve makas kullanılarak boyuna toraks açın. Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek. </li><li> kasık lenf nodu izole etmek, dikkatli hi bölgesinde cilt kaldırmakp ve forseps ile yağ dokusunun dikkatlice lenf düğümü seçin. kasık lenf düğümü tartılır ve buz üzerinde PBS içerisinde örnek saklayın. Not: Biz çalışmaları nedeniyle O`Connor ark kasık lenf nodları kullanılır. aktive edilmiş monositler, makrofajlar, nötrofiller ve T-hücrelerinin yüksek değerleri, tüm EAE indüksiyon 24 sonra, kasık lenf düğümleri içinde mevcut olduğu görülmüştür. </li><li> 2 ml şırınga pistonu kullanarak (50 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirilen) 70 mikron elekten lenf nodu sıkın. </li><li> 5 ml PBS ile örgü yıkayın. 8 dakika boyunca 2.400 xg&#39;de santrifüj. 100 ul% 0.2 BSA / PBS içinde hücre pelletini, 2 ul FcRI bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g&#39;de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatantı atın 300 ul PBS içinde hücre pelletini (ya da, uygun bir çalışma tamponu) tekrar süspansiyon ve transferbir akış sitometrisi tüpüne. </li></ol></li><li> kan hücrelerinin izolasyonu <ol><li> (EDTA ile stabilize edilmiş) 50 ul kan 50 ul 20 mM HEPES ilave edin ve solüsyonu yokedici 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe ve 500 ul PBS ilave edin. Oda sıcaklığında 650 x g&#39;de 6 dakika santrifüjlenir. Süpernatantı atın ve yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 100 ul% 0.2 BSA / PBS içinde hücre pelletini, 2 ul FcRI bloke tampon eklemek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g&#39;de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. Süpernatantı atın 300 ul PBS içinde hücre pelletini ve tüp flow sitometri aktarın. </li></ol></li><li> spinal kord hücrelerinin izolasyonu <ol><li> izofluran (dakika başına karbojen içinde% 2) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir kombinasyonu ile fareler anestezi uygulayın. </li><li> Islak kesi% 80 izopropanol ile alan ve uzunlamasına toraks açınmakas kullanılarak. Soğuk PBS pH 7.0 23 intrakardiyak fareler serpmek. </li><li> arkasındaki kesi alanı ıslatın ve tekrar bir neşter ile uzunlamasına kesim yapmak ve cilt kaldırmak. </li><li> (Arka bacaklarda innerve) omurganın bel kısmını kesip omuriliği ayıklamak için PBS dolu şırınga ile yıkayın. Lomber kablosunun yaklaşık 1/3 kesip bu tartmak ve buz üzerinde PBS örnek saklayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 500 ul hücre dekolmanı çözümü ve HBSS ekleyin (1: 1). , 3 mg / ml kolajenaz A ve 1 birim / mL DNase I ekleme kadar tekrar aşağı pipetleme hücreleri decollate 400 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: Eğer tercih edilirse, hücre süspansiyonu arka otofloresan An azaltır ve böylece, ölçüm akış sitometrisi duyarlılığını artırmak olabilir yoğunluk gradyan santrifüjü ile miyelin ve hücre artıklarının kontamine silinebilirkazanılmış gereken olayların sayısını d (bakınız bölüm 3.5). </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 1 mi,% 10 fetal dana serumu (FCS), pelet tekrar süspansiyon / Dulbecco Minimum Essential Medium (DMEM) ve tekrarlanabilir aşağı pipetleme yeniden hücreleri decollate. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin. Yıkama adımı yineleyin. </li><li> 1 ml PBS içinde hücre pelletini ve 2 ml şırınga pistonu kullanarak (50 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirilir), 70 mikron gözenekli bir elekten omurilik sıkın. </li><li> 4 mL PBS ile örgü yıkayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın 100 ul% 0.2 BSA içinde, hücre pelletini / PBS, 2 ul FcRI bloke reaktif ekleme ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 13 mcL antikor karışımı ilave karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe oda sıcaklığında 650 x g&#39;de 6 dakika boyunca 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatantı atın hücre Pelle tekrar süspansiyon500 ul PBS içinde T (ya da, uygun bir çalışma tamponu) ve borunun akış sitometrisi aktarın. </li></ol></li></ol> 3. Akım Sitometrisi Analizi <ol><li> Olesch ve ark., 25 tarif edildiği gibi uygun konsantrasyonlarını belirlemek için önceden tüm antikorlar titre edilir. </li><li> üreticinin talimatlarına göre çok renkli tazminat matrisleri oluşturmak için tek renkli tazminat antikor yakalama tazminat boncuk kullanın. </li><li> Günlük üreticinin talimatlarına göre belirli boncuklar kullanılarak alet kalibrasyonu kontrol edin. </li><li> Doğrudan ölçüm flow sitometri önce hücrelere 30 ul akım sitometri mutlak sayım standardını eklemek mutlak hücre sayılarını belirlemek için (izolasyon için bölüm 2.1, 2.2, 2.3, 2.4). Bunun yerine sayma boncuklar kullanarak hücreleri sayılabilir. </li><li> Bir sitometresi bir akış içine örnekleri (500.000 olayları: 100.000 olaylar, omurilik, dalak, lenf bezi ve kan hücreleri) toplayınnd belirli akış sitometri yazılımını kullanarak analiz eder. <ol><li> Akış sitometri yazılımını açın ve düğme &quot;örnekleri eklemek&quot; tuşuna basarak FC&#39;ler 3,0 dosyaları ekleyin. </li><li> çift ​​tıklayarak eklenen dosyayı açın. x ve y ekseni için kanallar ayarlayın. Ilgi hücre popülasyonlarının bir kapı oluşturmak seçmek için (Şekil 4). </li></ol></li></ol> 4. Kantitatif PCR Analizi <ol><li> cDNA içine mRNA izolasyonu ve transkripsiyonu <ol><li> Fenol-kloroform ile lomber spinal kord (1/3), dalak (1/8) ve inguinal lenf düğümleri mRNA Özü ve etanol 26 ile hızlandırabilir. <ol><li> Bunun için, 10 dakika süre ile inkübe 1 mi guanidinyum tiosianat-fenol karışımı içinde dokuyu homojenleştirin. 200 ul kloroform eklenir ve 10 dakika boyunca tekrar inkübe edin. </li><li> Santrifüj adımının (4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 18,000 x g), üst akıcı faz yıkama 500 ul izopropanol ve santrifüj (4 ° C&#39;de 8 dakika boyunca 18,000 x g ile° C). </li><li> 500 ul etanol ile bir santrifüjleme aşama (4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 18,000 x g) işleminden sonra, pelet yıkanır, vakum konsantratör pelet (30 ° C&#39;de 5 dakika) kurutun. Daha sonra, 30 ul su içinde pelletini. </li></ol></li><li> Kan mRNA çıkarmak için santrifüj 500 ul EDTA stabilize kan (300 xg 10 dakika, 4 ° C). <ol><li> , Ince beyaz tabaka al beyaz kan hücreleri içeren ve çözelti (150 mM NH4CI, 100 mM NaHCO 3, 0.1 mM Na-EDTA, pH 7.4) lize 1 ml seyreltin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, 6 dakika boyunca 650 xg&#39;de hücreleri santrifüj ve daha sonra PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak, beyaz kan hücreleri (lökosit) mRNA ekstrakte edin. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına göre rasgele heksamerler içeren cDNA sentezi için bir kit kullanılarak cDNA sentez gerçekleştirir. CDN 200 ng mRNA kullanınBir sentez. </li></ol></li><li> nicel PCR <ol><li> Belirli bir mRNA&#39;nın miktarının nicelleştirilmesi için, 1 ul cDNA, 1 uM ileri / geri primeri ve üretici talimatlarına 27 göre olan boya bağlayıcı bir fluoresan DNA kullanımı. Primer setleri için diziler için Tablo 1&#39;e bakınız. IL-1 p, CT-değerleri ölçün, IL-6, IL-23, kantitatif PCR sistemi kullanılarak IFNy, TNFa ve PPIA (peptidil prolil izomeraz). </li><li> Göreceli mRNA ifadesi karşılaştırmalı BT (çevrim eşik) yöntemini 27 kullanmak belirlemek. <ol><li> (Önceki çalışmalarda Barthelmes ve ark., 28, Schiffmann ve ark., 29, Schiffmann tarif edildiği gibi, bu için, hedef genden PPIA ortalama CT-değeri çıkarılarak PPIA ekspresyon seviyeleri, hedef genlerin CT-değerlerini normalize ve ark., 30). Daha sonra, ACt-değerlerini normalize hangi kullanarak, sözde ΔΔCT-değerlerini hesaplamakmuamele edilmemiş farelerin hedef genlerin ekspresyonu seviyesine EAE farelerden hedef genlerin yeniden EAE farelerde ACt-değeri tedavi edilmeyen farelerdeki ortalama ACt değer çıkarılarak. </li><li> Hedef genin göreceli mRNA ifadesini elde etmek için, aşağıdaki formülü kullanarak oranını hesaplamak: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Her astar özgünlüğünü test edin. % 2 agaroz jeli 31 kullanarak amplifiye fragman boyutunu belirler. Parçası boyutu Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol>

MJP, Xellia ve Leo Pharmaceuticals'ın danışmanıdır.

Burada anlatılan EAE modeli MS bir model olarak çok dikkat çeken ve rutin MS 32 için terapötik stratejilerin test kullanılır. Fare hastalık MS&#39;in birçok klinik ve histolojik özellikleri sergiler ve nöronal antijenlere otoimmünite indüksiyon kaynaklanır. miyelin antijenlerine sensitizasyon CNS, kan-beyin bariyeri bozukluğu ve böylece, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile ilişkilidir. Bulgularımız, bağışıklık hücreleri, akut fazda lenf nodlarında geçici artış olduğunu göstermektedir. Dalak T hücreleri ve B ...

Multipl skleroz (MS) ve karşılık gelen bir hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), merkezi sinir sisteminde (CNS) otoimmün nöroenflamasyon değişiklikleri göstermektedir. Erken aktif MS ve &#39;EAE lezyonlar infiltre bağışıklık hücrelerinin varlığı ile karakterize edilir. Etiolojisi bilinmemektedir, ancak yaygın reaktif T hücrelerinin aracılık ettiği miyelin yıkımına dahil kabul edilir. Bu oto-reaktif T-hücreleri, dolaşım B hücreleri, monositler ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücreleri çekmek pro-enflamatuar sitokinler ve kemokinleri salgılar. Monositler makrofajlar içine ayırt. reaktif T hücresi tarafından salgılanan interferon gamma (IFNy) pro-enflamatuar makrofajlar içine makrofajları polarizes. oligodendrositlere apoptozu teşvik pro-inflamatuar makrofajlar bırakma sitokinler ve reaktif oksijen türleri. oligodendrosit ölüm demiyelinizasyon yol açar. Bundan başka, B hücreleri, p ayırtsonuçta miyelin bozulması ile sonuçlanan lasma hücreleri ve miyelin kılıf karşı bırakma otoantikorlar. Miyelin kaybı akson ve nöronların bozulması ve böylece MS 1 temel özelliklerini temsil CNS&#39;de lezyon sitelerinin oluşumuna yol açar. Çevresinde, T hücreleri ve B hücreleri, lenf nodüllerinde aktive edilir, bu dalakta çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşım içinden yer değiştirmektedir. Monosit ve nötrofillerin kemik iliğinde çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşımla göç de. kana veya MSS içine kan kemik iliği, dalak ve lenf düğümleri lökosit ekstravazasyon kemokin ve kemokin reseptörlerinin aracılık ettiği lökositler ve endotel arasındaki moleküler etkileşimler de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır çok aşamalı bir süreçtir. çeşitli hücre tipleri tarafından kemokinlerin üretimini bağışıklık reaksiyonunun ne indüklenebilirDaha sonra enflamasyon 2,3 siteye bağışıklık hücrelerini toplayan, tümör nekroz faktörü-a (TNFa), IFNy ve interlökin-6 (IL-6) gibi sitokinlerle n. Bağışıklık hücreleri enflamatuar sitesine hücre tipine ve taşıma yolunun bağlı olarak, kendi yüzeyi üzerinde kemokin reseptörlerinin bir alt sunulmaktadır. Bu nedenle, CXCR2, CCR1 ve CXCR1, kemik iliği ve kanda 4 olgun nötrofiller üzerinde tanımlı ve onun ligandlan, CXCL2, CCL5 ya CXCL6 bağlanması sırasıyla, nötrofil aktive eder ve daha sonra hücre göçü endotele yapışıklıklarını teşvik eder ve dokulara 5-9 içine. CCL2 ve CCL20 sırasıyla CCR2 11 ve CCR6 12 ifade monositler ve Th1 / Th17 hücreleri 10, çekmek. T hücreleri, monositler ve makrofajlar dahil olmak üzere, 13 farklı hücre tipleri tarafından eksprese CCR1 ve CCR5, CCI3, CCL5 ve CCL7 bağlanan ve MS 14 sırasında yukarı düzenlenen edilir. CXCR3 T hücreleri üzerinde ifade edilir ve CCL9, CCL10 bağlanır veCCL11 15. MS tedavisinde bir ana strateji bağışıklık hücrelerinin azalması veya merkezi sinir sistemi içine bağışıklık hücre infiltrasyonu önlenmesidir. Bu nedenle, belirli bir kemokin reseptörlerinin blokajı EAE de araştırılmıştır. Antagonizma veya CCR1 16, CCR2 17 genetik silme, CCR7 18 veya CXCR2 19 düşmanlık veya CCR1 20 genetik silinmesi ise, CCR5 20 veya CXCR3 21 patolojiye azaltmak vermedi, EAE patoloji azaltır. Bu nedenle, lökositler üzerinde belirli kemokin reseptörlerinin ifadesi MSS içine ikincisi infiltrasyonu için çok önemlidir ve EAE seyrini belirler. Infiltre bağışıklık hücreleri, sırayla, enflamatuar süreç veya nöron 22 parçalanmasını teşvik, TNFa, IL-6 ve IL-1 gibi sitokinler, serbest, immün hücrelerin tüketiminin MS hastalar için etkili bir tedavi stratejisidir. Ayrıca, otomatikReaktif Th1 hücreleri sırayla TNFa, IL-1 ve IL-23 serbest bırakmak için makrofajları uyarır IFNy, bırakın. Bu yazıda EAE, immün hücre dağılımı ve EAE farelerde çeşitli dokularda sitokin seviyeleri (mRNA) belirlenmesi indüklenmesini tarif etmektedir. Hücreler son CNS&#39;de lezyon oluşumuna yol enflamatuar süreçlerin bir zamana bağlı bir genel bakış sağlamak amacıyla, hastalığın seyri sırasında farklı zaman noktalarında izole edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500 Dizi Tespit Sistemi&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, ABD</td><td></td><td>kantitatif PCR sistemi</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Münih, Almanya</td><td>A6964</td><td>hücre ayırma çözeltisi</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Almanya</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605 eBioscience</td><td>, Frankfurt, Almanya</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>552843</td><td>kompanzasyon boncukları</td></tr><tr><td>Kollajenaz A</td><td>Sigma Aldrich Münih, Almanya</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Sitometrik mutlak sayım standardı&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Almanya</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Sitometre Kurulumu ve İzleme boncukları&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Münih, Almanya</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kiti</td><td>Hooke Laboratuvarları, Lawrence, ABD</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-CY7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Almanya</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>İlk İplikçik cDNA Sentez kiti&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Almanya</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc reseptörü-1 bloke edici tampon&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometrik mutlak sayım standardı</td><td>Polyscience, Eppelheim, Almanya</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, ABD</td><td></td><td>akış sitometri yazılımı</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td>akış sitometresi</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solüsyonu&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Almanya</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Almanya</td><td>K0221</td><td>floresan DNA bağlayıcı boya&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>74104</td><td>RNA ekstraksiyon kiti</td></tr></tbody></table>

Çeşitli dokularda bağışıklık hücreleri hastalık bağımlı dağıtım fareler ve değerlendirilmesi deneysel otoimmün ensefalomyelitli indüksiyon

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multipl skleroz, bilişsel, motor bozukluğu ile sonuçlanan santral sinir sistemi (CNS) lezyon formasyonu ile karakterize bir enflamatuar otoimmün hastalık, olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca, CNS&#39;de lezyon oluşması, motor hasar ile karakterizedir ve otoimmün ve enflamatuar reaksiyonların etkili olduğu için, deneysel otoimmün ensafalomiyelitis (EAE), MS için yararlı bir hayvan modelidir. EAE modelleri bir miyelin oligodendrosit proteini farede (MOG) 35-55 türetilmiş bir peptit ile indüklenir. EAE fareler ilerleyici bir hastalık seyrini gelişir. Bu ders, üç aşamaya ayrılır: preklinik faz (gün 0-9), hastalık başlangıcı (gün 10 - 11) ve akut faz (gün 12 - 14). MS ve &#39;EAE CNS infiltre otoreaktif T-hücreleri tarafından indüklenir. Bu T hücreleri, daha bağışıklık hücrelerinin işe neden kemokinler ve sitokinler salgılarlar. Omurilik d nedenle, immün hücre dağılımıÜç hastalık evrelerini uring araştırılmıştır. T hücreleri, B hücreleri ve monositler aktivasyonu / çoğalması / toplama başladığı hastalığın zaman noktası vurgulamak için, lenf düğümleri, dalak ve kan immün hücre dağılımı da değerlendirildi. Ayrıca, üç hastalık aşamalarında çeşitli sitokinlerin (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) seviyeleri, hastalığın enflamatuar süreçleri hakkında bilgi edinmek için, tespit edilmiştir. Sonuç olarak, veri EAE patoloji sırasında bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel profilinin bir bakış sağlar.

Şekil 1, bu makalede açıklanan farklı yöntemler şematik bir bakış verir. 1) Fare MOG 35-55 antijen enjeksiyonu almak ve 10.7 ± 0.3 gün 28 sonra ilk klinik belirtiler gelişir. EAE farelerin bir temsilci hastalık kursu. Şekil 1&#39;de 2) Çeşitli dokular (dalak, lenf düğümleri, bel omurilik) gösterilir ve kan preklinik faz (Günlük 2 gün 4 sırasında farklı zaman noktalarında kontrolü ve EAE fareler elde...

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit veya EAE modelinin genel amacı, multipl sklerozun gelişiminin altında yatan potansiyel moleküler mekanizmaların incelenmesini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, bağışıklık hücrelerinin merkezi sinir sistemine hastalığın hangi aşamasında sızdığı gibi, multipl skleroz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, EAE modelinin demiyelinizasyon ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu gibi multipl sklerozun birçok ana özelliğini taklit etmesidir.Bu tekniğin etkileri, bu yöntemle test edilen ilaçların bu hastalık için halihazırda onaylanmış olması nedeniyle multipl skleroz tedavisine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, EAE indüklenirken dikkate alınması gereken kapsamlı koşullar olduğu için zorluk yaşayabilirler. Fareler stressiz bir ortamda tutulmalı ve pertusis toksini taze olarak hazırlanmalıdır.Lenf nodlarının izolesi ve spinal kordun çıkarılması yalnızca betimlemelerle öğrenilmesi zor işlemler olduğundan, bu yöntemin resmi gösterimi kritik önem taşımaktadır. İşleme, 10 ila 13 haftalık dişi farelere, 400 micrograms mycobacterium tuberculosis içeren 200 microliters komple Freund adjuvanı içinde emülsifiye edilmiş 200 micrograms myelin oligodendrocyte glycoprotein'in deri altına enjekte edilmesiyle başlayın.Hemen ve 24 saat sonra, farelere 200 µL PBS içerisinde 0.2 µg pertusis toksini intraperitonal olarak enjekte edin. Klinik semptomların gelişimini engelleyebilecek stresin oluşmaması için, EAE indüksiyonu öncesinde farelerin hem tutulmaya hem de deney ortamına adapte edilmiş olması esastır. Enjeksiyondan bir hafta sonra, fareleri tabloda açıklandığı şekilde klinik semptomlar açısından günlük olarak inceleyin.EAE tarafından indüklenen lenf düğümü immün hücre popülasyonunu değerlendirmek için, indüksiyon sonrası uygun zaman noktasında, insizyon bölgesini %80 isopropanol ile ıslatın ve kalça bölgesindeki deriyi dikkatlice kaldırın. Pens kullanarak inguinal lenf düğümünü yağ dokusundan dikkatlice ayırın. Ardından düğümü tartın ve örneği buz üzerinde PBS içine yerleştirin.Omurilik hücrelerini analiz etmek için hayvanın sırtını izopropanol ile ıslatın ve omurga boyunca boylamsal bir kesi yapmak için neşter kullanın. Ardından deriyi kaldırın ve arka ekstremiteleri innerve eden omurganın lomber kısmını diseke edin. Omuriliği çıkarmak için omurgayı PBS dolu bir şırıngayla yıkayın.Lumbar kordun yaklaşık 1/3'ü çıkarıldıktan sonra, spinal fragmanı tartın ve dokuyu buz üzerinde PBS içinde saklayın. Splenik immün hücre popülasyonunu analiz etmek için, abdomenin alt kısmına erişmek amacıyla dokuyu açın. Ardından, dalağı çıkarın ve dokunun yaklaşık 1/8'ini kesin.Dalak fragmanını tartın ve dokuyu buz üzerinde PBS içerisinde saklayın. Ardından, geri kalan dokuyu 50 mililitrelik bir tüp üzerindeki 70 mikronluk ağ süzgeçten geçirerek ezmek için iki mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın ve ardından süzgeci beş mililitre PBS ile yıkayın. Filtrelenen hücreleri santrifüj edin.Pelleti 500 µL hücre lizis tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika beklettikten sonra, hücreleri 500 µL PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamanın ardından pelleti 100 µL PBS içinde %0,2 BSA'da yeniden süspande edin ve hücrelere iki µL Fc reseptör bloklama tamponu ekleyin.Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika beklettikten sonra, hücreleri 13 µL antikor kokteyli ile oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika daha işaretleyin. İnkübasyonun sonunda hücreleri en az iki kez 500 µL PBS ile yıkayın ve son peleti 500 µL taze PBS içinde tekrar süspande edin. Ardından hücreleri buz üzerinde bir akış sitometrisi tüpüne aktarın.Son olarak, örnekleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, akış sitometrisi ölçümünden hemen önce, mutlak hücre sayılarını belirlemek amacıyla hücrelere 30 microliters akış sitometrik mutlak sayım standardı ekleyin. Ardından örnekleri akış sitometresinde analiz edin. Bu şeklin gösterdiği gibi, EAE indüksiyonunun akut fazı sırasında lenf düğümlerindeki tüm immün hücre popülasyonlarında geçici bir artış gözlemlenir.Ancak dalakta sadece makrofajlar, B hücreleri, T hücreleri ve nötrofillerde artmış bir infiltrasyon görülmektedir. Kanda, monosit popülasyonu hariç tüm immün hücre popülasyonları, klinik öncesi evre sırasında periferik dolaşımlarında geçici bir artış göstermektedir; bu durum, hastalığın akut evresinde lumbar spinal kordda görülen benzer bir hastalığa bağlı artışa karşılık gelmektedir. Monositlerin ise muhtemelen spinal korda girdikten sonra makrofajlara farklılaştığı düşünülmektedir. Burada, farklı hücre popülasyonlarının değerlendirilmesi için kullanılan gating stratejisi gösterilmiştir.Hücre sayıları, analiz edilen doku miktarı veya kan hacmi ile ilişkilidir ve mutlak hücre sayısını yansıtır. Lenf nodlarında, klinik öncesi aşamada IL-23 mRNA ekspresyonu artarken, IL-6 ekspresyonu hastalığa bağlı olarak artış gösterir. Dalakta ise klinik öncesi aşamada IL-6 ve IL-23 ekspresyonu artmakta, buna karşın IL-1 beta mRNA ekspresyonu hastalığın başlangıcına kadar etkilenmemektedir.Kanda, yalnızca TNF-alpha mRNA ekspresyonu hastalık bağımlı bir şekilde artış göstermektedir. Bel omurilikte, akut faz sırasında TNF-alpha, IL-1 beta ve interferon gamma indüklenirken, IL-6 yalnızca hastalığın başlangıç fazında artış göstermektedir. EAE modeli, ardından gelen hücre izolasyonu ve etkilerin analizi, uygun şekilde gerçekleştirildikleri takdirde on fare için sekiz saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, mRNA ekspresyon analizi sonuçlarını doğrulamak için Western Blot veya ELISA gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, multipl skleroz alanındaki araştırmacıların merkezi sinir sistemindeki demiyelinizasyon mekanizmasını incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, EAE modelinin nasıl indükleneceği ve tekrarlanabilir akış sitometrisi sonuçları elde etmek için immün hücrelerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Tam Freund adjuvanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür uygulanırken farenin derisini kaldırmak ve şırınganın deriye tamamen nüfuz ettiğinden emin olmak gibi önlemler alınmalıdır.

induction-experimental-autoimmune-encephalomyelitis-mice-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.

İndüksiyon ve Kronik Relaps Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Klinik Puanlama

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Bu protokol, deneysel otoimmün ensefalomiyelit için farmakolojik tedavilerin, immün hücre infiltrasyonunun baskılanmasının bir sonucu olarak CNS koruması gösterip göstermediğinin veya immün hücre infiltrasyonunun saldırısı sırasında nöroprotektif olup olmadığının nasıl belirleneceğini açıklar.

Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Öğrenin deneysel otoimmün ensefalomyelit indüksiyonunu ve bağışıklık hücrelerinin çeşitli dokulardaki dağılımını farelerde. Akış sitometrisi ve PCR ile multipl skleroz mekanizmalarını araştırın.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon (Video) | JoVE Journal

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Daha fazla video keşfet