Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, elektron mikroskobu için önceden gömme immün boyama ve doku işlemeden önce Alzheimer hastalığı fare modellerinden beyin bölümlerindeki beta-amiloid plaklarını tanımlamaktır. Bu yöntem, mikroglial hücrenin amiloid beta parsellerinin yakınındaki sinapsis ile etkileşimi gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen bölgelerde ve katmanlarda amiloid beta grafikleri içeren beyin dokusu kesitlerinin önceden taranmasına izin vermesidir.

Bu yöntem Alzheimer hastalığına uygulanabildiği gibi, amiloidozun mevcut olduğu diğer hastalıklara veya dokulara da uygulanabilir. İlk olarak, mililitre metoksi X04 bileşiği çözeltisi başına beş miligram hazırlayın. Bir mirco terazisi kullanarak, metoksi X04'ün beş miligramını ağırlıklandırın.

Bir davlumbaz altında, metoksi X04'ü 100 mikrolitre DMSO içinde çözün ve berrak, yeşilimsi bir çözelti elde edilene kadar karıştırın. Karıştırırken art arda 450 mikrolitre propilen glikol ve 450 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin. Çözeltiyi gece boyunca dört santigrat derecede karıştırın.

Ertesi gün sarımsı yeşil bir emülsiyon görülmelidir. Metoksi X04'ü enjekte ettikten sonra, vücut ağırlığının kilogramı başına 10 miligramlık bir doz ekleyin ve hayvanı onaylanan yöntemlere göre istenen zaman noktasında kurban edin, para ormaldehit ile sabitlenmiş beyni soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, keskin bir tıraş bıçağı kullanarak, koku soğancığını çıkarın ve beyni, prosedürü hızlandırmak için hepsi aynı anda bölümlere ayrılabilen, yaklaşık olarak eşit yükseklikte iki ila üç parçaya bölün

Beyin dokusu parçalarını, tepsiye sabitlenmiş numune plakasına yapıştırın. Düzgün kesim yüzeyinin numune plakasına sıkıca yapıştığından emin olun. Tüm beyin yüzeyi tamamen suya batırana kadar tepsiye PBS solüsyonu ekleyin.

Tepsiyi vibratomun içine yerleştirin ve vibratomun ayarlarını 50 mikron kalınlığında bölümler elde edecek şekilde ayarlayın. Kesmeye başlayın ve tarama yapıyorsanız, bölümleri hemen ince bir boya fırçası kullanarak PBS'ye aktarın. Alternatif olarak, bölümler 20 santigrat derecede saklamak için kriyo korumalı çözelti içeren cam şişelere yerleştirilebilir.

Stereotaksik bir fare beyin atlasının yardımıyla, ilgilenilen bölgeyi içeren beyin bölümlerini seçin ve her bölümü 24 oyuklu bir kültür plakasının kuyusuna kriyoprotektan içine yerleştirin. Ardından, bir mikroskop lamına bir damla PBS eklemek için tek kullanımlık bir pipet kullanın ve ardından bölümü damlacığın üzerine yerleştirin. Metoksi X04 etiketli a-beta plakları içeren bölgeleri belirlemek için bölümü floresan mikroskobu altında inceleyin.

Mikroskop tablasını hareket ettirmeden, ilgilenilen bölgelerin görüntülerini hem parlak alanda hem de floresan modunda yakalayın. Plakayı doku bölümünün yapısal bölgesiyle ilişkilendirmek için her görüntü her iki alanda da aynı bölgeyi göstermelidir. Çekilen görüntüleri hayvan numarasına göre kaydedin ve adlandırın.

Ayrıca plakadaki kuyu numarasını ve çekilen resimlerin alanını kaydedin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra bölümü belirlenen kuyuya geri yerleştirin. Bölümlerin kurumasını önlemek için aynı prosedürü kullanarak sıradaki bir sonraki bölümü inceleyin.

Görüntüleri hizalamak için, aynı yatırım getirisi için parlak alan ve UV alanı görüntülerini ImageJ'de açın. Ardından, iki görüntünün kenarlarını hizalamak için MosaicJ eklentisini kullanın. Hizalanmış ve birleştirilmiş görüntüyü, kuyu numarasına göre belirli bir hayvanın numarasıyla birlikte bir klasöre kaydedin.

İlgilenilen bölgedeki plakları tanımlamak ve lokalize etmek için aynı hayvanın farklı bölümlerinden alınan görüntüleri birleştirin. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, incelenen bölümleri 20 santigrat derecede saklayın, immünoboyama veya daha ileri işlemler gerçekleştirilene kadar kriyoprotektan içeren 24 oyuklu bir kültür plakasıdır. İlk olarak, bir cam şişede fosfat tamponunda% 1 osmiyum tetroksit çözeltisi hazırlayın.

Osmiyum tetroksit ışığa duyarlı olduğundan, çözeltiyi ışıktan korumak için cam şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Fosfat tamponunda yıkadıktan sonra, tamponu bölümlerden çıkarın ve ince bir boya fırçası kullanarak düz bir şekilde yayın. Osmiyum tetroksit eklemeden hemen önce bölümleri düzleştirdiğinizden emin olun, çünkü bölümlerdeki herhangi bir kıvrım kalıcı hale gelecektir ve osmiyum fiksasyonu sonrası dokuyu düzleştirmeye çalışmak yalnızca bölümleri kıracaktır.

Bölüm daldırılana kadar bölümlere her seferinde bir damla osmiyum tetroksit eklemek için bir transfer pipeti kullanın. Bölümleri ışıktan korumak için kuyuyu alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında plastik reçineyi tek kullanımlık bir beherde hazırlayın.

Bileşenleri sırayla birleştirin ve homojen bir renk elde edilene kadar 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın. Hazırlanan karışımı alüminyum tartı kaplarına aktarın. Bunlar, susuz kaldıklarında doku kesitlerini alacaklardır.

Kuluçka süresi geçtikten sonra, bölümleri her biri iki dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında kurutun. Susuz kalmış bölümleri 24 oyuklu kültür plakasından 20 mililitrelik cam şişelere aktarın. Ardından, kalan etanolü çıkarmak için bölümleri her seferinde iki dakika boyunca üç kez propilen okside batırın.

Daha sonra, bölümleri propilen oksit çözeltisinden plastik reçineye aktarmak için bükülmüş bir cam pipet ucu veya ince bir boya fırçası kullanın ve oda sıcaklığında sızma için gece boyunca bırakın. Sızmadan sonra, numuneleri içeren alüminyum tartım kaplarını 10 ila 15 dakika boyunca 50 ila 60 santigrat derece fırına koyun. Bölümleri poliklorotrifloroetilen film tabakalarına gömmek için, önce bölüme ince bir reçine tabakası boyamak için ince bir boya fırçası kullanın.

Ardından, dokunun bir bölümünü her seferinde bir alüminyum tartı kabından PCTFE film tabakasına taşıyın. Fazla reçineyi dokunun etrafından uzaklaştırın, rahatsız etmemeye dikkat edin. Tüm bölümleri bir tartım kabından PCTFE film tabakasına taşıdıktan sonra, iki tabaka arasında bir doku ve reçine sandviçi oluşturarak birincinin üzerine ikinci bir PCTFE tabakası yerleştirin.

Reçineyi bir inkübatörde üç gün boyunca 55 ila 60 santigrat derecede polimerize edin. Doku daha sonra ultra ince kesit alma ve ultrastrüktürel inceleme için hazırdır. Aşağıdaki görüntüler, parlak alan ve floresan modları kullanılarak bir hipokampal bölümün ikili görüntülemesini göstermektedir.

İlgilenilen bölgeler ve katmanlar parlak alan altında görselleştirilir. A-beta plakları, 340 ila 380 nanometre aralığında bir UV filtresi kullanılarak başarılı bir şekilde lokalize edilir. Bu görüntü, IBA1 için immün boyamayı önceden yerleştirmeden önce bir hipokampal bölümü göstermektedir.

Görünür bir plak, noktalı çizgi ile özetlenmiştir. Bu görüntü, IBA1 için önceden gömme immün boyama ve transmisyon elektron mikroskobu için işlemden sonra aynı bölümü göstermektedir. Noktalı bir çizgi ile çevrelenmiş plakların, elektron mikroskobu için doku işlemesi sırasında hala görünür olduğunu unutmayın.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol uygun şekilde yürütülürse bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, numunelerin kalitesini etkileyecek kontaminasyon ve diğer yapısal bozulma olasılığını azaltmak için her adımın titizlikle yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Osmiyum ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemler almalısınız.

Deneyinizin sonunda tesisinizin yönergelerine uygun olarak kullandıktan sonra attığınızdan emin olun.