Name: Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin, kızılötesi floresan boya-etiketli oligonükleotidler kullanarak elektroforetik hareketlilik kaydırma testi ile protein-DNA etkileşimlerini güvenli ve radyoaktif olmayan yöntemle nasıl tespit edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Alfred P. Sloan Araştırma Bursu (CFC'ye) ve NIH R01 hibesi (5R01GM098026-05'ten C.-F.C.'ye) tarafından desteklenmiştir. Gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemine erişim için David Crowe'a teşekkür ederiz.

Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir. 1. Jel Hazırlanması <ol><li> mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın. <ol><li> Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD 2 O 20.2 mi. NOT: Akrilamid zararlı ve toksik uygun kişisel koruyucu ekipman ile anlaştım. </li&gt; </ol></li><li> hemen jel çözümü Cast. Polimerizasyon sonra, şeffaf plastik wrap 0.5x TBE önceden ıslatılmış jeller sarın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Kızılötesi floresan boya işaretli problar 2. hazırlanması Not: hazırlama, depolama, ve deneyler sırasında uzak mümkün olduğu kadar hafif kızılötesi fluoresan boya etiketli oligonükleotidler tutun. <ol><li> Tasarım ve sipariş oligonükleotidler. <ol><li> ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın. Not: LIM-4 / SOX-2 sonda uzun oligonükleotid dizisi TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC olup. Uzun oligonükleotidler SAYFA veya HPLC saflaştırma gerekmez. </li><li> 5 &#39;ucunda (5&#39;Dye) ve 37 ° C&#39;nin üzerinde bir erime sıcaklığı, kızılötesi floresan boya modifikasyonuna ~ 14-mer tamamlayıcı kısa oligonükleotidlerin tasarımlanması. NOT: Kısa oligonükleotid dizisi LIM-4 / SOX-2 prob 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG olduğunu. 5&#39;Dye etiketli Kısa oligonükleotitlerin asgari sentezi ölçeği 100 nM&#39;dir. Bu nedenle, oligonükleotidler, HPLC saflaştırma gerektirir. </li></ol></li><li> 100 uM nihai konsantrasyona kadar; (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 TE) 1x Tris-EDTA tampon maddesi içinde yeniden süspanse oligonükleotitler. </li><li> Tavlama Kısa (5&#39;Dye) ve Uzun oligonükleotidler. <ol><li> 0.6 5&#39;Dye-Kısa bir oligo (100 uM) uL, uzun oligo (100 uM), 1.2 ul, sodyum 28.2 uL klorür-tris-EDTA tampon maddesi (karıştırın STE: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 1 mM EDTA), bir 1.5 ml bir tüp içinde. </li><li> 5 dakika boyunca kaynayan suda tüp yerleştirin. ısı kaynağı kapatın ve tavlı oligos karanlıkta O / N serin suyu sağlar. </li></ol></li><li> iki şeritli DNA probları yapmak için Klenow DNA polimeraz ile tavlanmış 5&#39;Dye-kısa / uzun oligo 5 &#39;çıkıntısını doldurmak. <ol><li> karıştırılarak reaksiyon hazırlanması5&#39;Dye etiketiyle tavlanmış uzun / kısa oligo 30 uL, 8.5 uL 10x Klenow tamponu, 10 mM dNTP 1.7 ul, 1.7 Klenow uL (3 &#39;-&gt; 5&#39; ekso-) (5 u / uL) ve 0.2 ml PCR tüpünde GKD 2 O 43.1 ul. </li><li> PCR makinesi içerisinde 37 ° C&#39;de 60 dakika kuluçkalayın. </li><li> PCR makinesi içinde 20 dakika süreyle 75 ° C&#39;de reaksiyona ısı devre dışı bırak durdurmak için 3.4 mcL 0.5 M EDTA ekleyin. </li></ol></li><li> 0.1 uM nihai konsantrasyon için STE doldurulmuş sondalar (0.7 uM) ile seyreltilir. </li><li> hazır olana kadar karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın oligos kullanmak için. Oligo Bu durumda, bir yıla kadar depolanabilir. NOT: Mutant bağlayıcı siteleri ile DNA probları oluşturmak için, uzun oligonükleotitlerin mutant sürümleri Klenow ile 5 &#39;çıkıntılar dolgu-in ardından 5&#39;Dye etiketli kısa oligonükleotid ile tavlanır. Bir iplikçik prob kızılötesi floresan ile etiketlenmiş olduğu gösterilmiştirboya boya ile işaretlenmiş, her iki şerit prob sadece% 30 yoğunluğa sahiptir. Sinyal yoğunluğu güçlendirilmelidir, her iki şerit uzun oligo 5 &#39;termini, kızılötesi floresan boyalar ile etiketlenmiş ve kızıl ötesi floresan boya etiketli problar yapmak için tavlanır. </li></ol> Etiketsiz / Soğuk Sondalar 3. Hazırlama (Yarışmacı) Not: tamamlayıcı diziler (Uzun ve Longr) Uzun oligonükleotidler kızılötesi floresan boya etiketli problar ile rekabet analizi için etiketsiz probları yapmak tavlanmıştır. <ol><li> 1.5 ml bir tüp içinde, 100 mikron uzunluğunda 20 uL, 100 uM Longr oligonükleotid 20 uL ve STE 60 uL karıştırın. </li><li> 5 dakika kaynar suda tüp yerleştirin ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligos gece boyunca soğumaya suyu sağlar. </li></ol> 4. Bağlanma reaksiyonu ve elektroforez <ol><li> 50 uL karıştırılarak 5x bağlama tamponu, 1 mL hazırlanması60 ° C; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 M NaCI, 10 uL; 1 M KCl, MgCl2 1 M 5 uL 200 uL, 0.5 M EDTA, 10 uL, pH 8.0; 1 M DTT 5 uL; GKD 2 O 25, 10 mg / ml BSA uL ve 695 uL Not: 5x bağlama tamponu bölünüp -20 ° C&#39;de saklanabilir. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta, farklı transkripsiyon faktörleri bağlama tamponu farklı modifikasyonlara sahip olmasıdır. </li><li> Sağ bağlama reaksiyonları kurmadan önce, 30 80 V amonyum persülfat tüm izlerini silmek için +% 2.5 gliserol 0.5x TBE% 5 yerli poliakrilamid jel önceden işletilen - 60 dk veya geçerli artık zamanla değişir kadar. </li><li> 20 uL nihai hacimde bağlanma reaksiyonuna ayarlayın. <ol><li> 4 5x bağlama tamponu uL, 80 karıştırın - saflaştırılmış protein A 200 ng (örneğin,% 50 gliserol, SOX-2), 0.1 uM Boya ile konjüge edilmiş prob 1 pL (son konsentration: 5 nM) ve GKD 2 O </li><li> İsteğe bağlı: Soğuk sonda rakipler gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda soğuk prob (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vs.) ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: proteinler, A ve B arasındaki etkileşimi (örneğin, SOX-2 ve LIM-4) test edildiğinde, 80 ekleyin - saflaştırılmış protein B 200 ng (yani,% 50 gliserol içinde, LIM-4). </li><li> İsteğe bağlı: nükleer ekstre hazırlanması kullanılan doğrulanması için protein A spesifik bağlanma ise, protein A (örneğin, bir anti-6xHis, anti-FLAG, vs.) özel antikor ekleyin. </li><li> 15 dakika süreyle karanlıkta R / T&#39;de bir gece inkübe edin. </li></ol></li><li> jel üzerine bağlanma reaksiyonunun tüm yük ve istenen mesafeye 10 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol> 5. Görüntüleme NOT: Jel gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi ile cam plakalar doğrudan tarandı. Bu nedenle, jel daha çözülebilir ve tekrar tekrar taranan (Şekil 1C ve <stRong&gt; 2). öncelikle Western lekeleme için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi de jel taramak için test edilmiştir, ancak gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi iyi çözünürlüğe sahip jel tarama başardı. diğer yazılım paketleri kullanılabilir, ancak tarif edilen yöntem, belirli bir kızılötesi görüntüleme yazılımı özgüdür. <ol><li> GKD 2 O ile tarayıcı yatağı temizleyin ve taramadan önce iyice kurutun. jel cam plakalar silerek kurutun ve tarayıcı yatağı üzerinde jel içeren plakalar yerleştirin. </li><li> kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve &#39;Edinme&#39; sekmesine gidin. ince plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 1.5 mm. kalın levha (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 3,5 mm. ofset odak bağlıdırcam levha kalınlığı. </li><li> Jel tarayıcıya kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için &#39;Başlat&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> elektroforez tekrarlayın ve ayrıca gerektiğinde tarayın. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. Zaman radyoaktif EMSA ile bant...

EMSA ilgi konusu bir protein ve protein 1 potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. 32 P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin 2 veya digoksijenin (DIG) 3 (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri 4 SYBR yeşil boyama dahilya da jel 5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti. Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller 1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. Biotin-2 veya DIG-konjuge 3 DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans 6 tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı 4 gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluoresein 9 ve kızıl ötesi floresan boyalar 4-6 içerir. Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde 5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site 5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı. İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, 5 GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-25,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.

<table><tbody><tr><td>% 30 Akrilamid / Bis Çözeltisi, 37.5: 1&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Akrilamid zararlı ve toksiktir.</td></tr><tr><td>6x-HIS Epitop Tag Antikoru (HIS. H8)</td> <td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antikoru &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA) moleküler biyoloji sınıfı</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700 etiketli DNA Oligoları</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel DNA oligosu</td><td>Bunlar, el yazmasında "5'Boya etiketli veya kızılötesi floresan boya etiketli DNA oligoları" olarak anılmaktadır. Şirket, 5' IRDye etiketli DNA oligonükleotidlerini özel olarak sentezleyecek. Minimum gerektirir 100&nbsp; &mu; M ölçeği sentezi ve HPLC saflaştırması.</td></tr><tr><td>Klenow Parçası (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Dikey Elektroforez Hücresi&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>Bu, el yazmasında 'mini protein jel sistemi' olarak adlandırılmaktadır. Herhangi bir elektroforetik sistem, boyutu 25 cm x 25 cm'den küçük şeffaf cam plakalar olduğu sürece kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR Biyoteknoloji</td><td>Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td><td>Bu, el yazmasında 'gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi' olarak anılmaktadır.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Biotechnology Odyssey Fc Çift Modlu Görüntüleme Sistemi</td><td>Bu, el yazmasında 'öncelikle Batı lekeleri için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi' olarak anılmaktadır.</td></tr><tr><td>Image Studio yazılımı (sürüm 4.0)</td><td>LI-COR Biyoteknoloji</td><td>Image Studio yazılımı&nbsp;</td><td>Bu, el yazmasında 'özel bir görüntüleme yazılımı' olarak anılmaktadır.</td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Turuncu yükleme boyası</td><td></td><td></td><td>% 0.25 Turuncu G; % 30 Gliserol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Bağlayıcı Tampon</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl<alt>2</alt>; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &#956; g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

kızılötesi floresan boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak elektroforetik hareketlilik kaydırma testi için optimize protokol

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.

Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir. EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle, poli deoxyinosinic-deo...

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Bu deneyin genel amacı, radyoaktif olmayan problar kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hedef dizilerinin belirlenmesi gibi moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoaktif problar kullanmaya kıyasla kolay, güvenli ve zaman kazandıran bir alternatif olmasıdır.Bu prosedüre başlamak için, mini protein jel sistemi kullanarak 0,5x tris borat EDTA veya TBE ve %2,5 gliserol içeren yüzde beşlik doğal poliakrilamid jel hazırlayın. Dört jel için 30 mililitre jel çözeltisi hazırlamak amacıyla distile su, TBE, amonyum persülfat, TEMED, akrilamid bis ve gliserolü karıştırın. Jel çözeltisini hemen aktarın.Polimerizasyon sonrası, jelleri 0,5x TBE ile önceden ıslatılmış şeffaf plastik filmle sarın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Ardından, yaklaşık 51 mer uzunluğunda bir uzun oligonükleotit tasarlayın. Beş prime ucunda kızılötesi floresan boya modifikasyonu olan, yaklaşık 14 mer uzunluğunda tamamlayıcı kısa oligonükleotitler tasarlayın.Oligonükleotidler hazırlandıktan sonra, bunları 1x Tris-EDTA tamponunda 100 micromolar son konsantrasyona gelecek şekilde yeniden

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, hareketlilik kaymalı afinite kapiler elektroforezi ile protein-ligand etkileşimini analiz etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir proteinin çeşitli yüklü ligandlarla bağlanma davranışını karakterize etmek için kullanılabilir.

Hareketlilik Kayması Afinite Kapiler Elektroforezi: Protein-Ligand Komplekslerinin Diferansiyel Migrasyonuna Bağlı Olarak Numune-Ligand Etkileşimlerini Analiz Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Öğrenin, kızılötesi floresan boya-etiketli oligonükleotidler kullanarak elektroforetik hareketlilik kaydırma testi ile protein-DNA etkileşimlerini güvenli ve radyoaktif olmayan yöntemle nasıl tespit edeceğinizi.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol (Video) | JoVE Journal

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Daha fazla video keşfet