Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Bu testin genel amacı, radyoaktif olmayan problar kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hedef dizisinin belirlenmesi gibi moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoaktif probları kullanmaya göre kolay, güvenli ve zaman kazandıran bir alternatif olmasıdır.

Bu prosedüre başlamak için, bir mini protein jel sistemi kullanarak 0.5x tris borat EDTA veya TBE ve %2.5 gliserol içeren yüzde beş doğal poliakrilamid jel hazırlayın. Dört jel için 30 mililitre jel çözeltisi hazırlamak için damıtılmış su, TBE, amonyum persülfat, TEMED, akrilamid bis ve gliserolü karıştırın. Jel solüsyonunu hemen geçirin.

Polimerizasyondan sonra, jelleri 0.5x TBE ile önceden ıslatılmış şeffaf plastik sargıya sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Ardından, yaklaşık 51 mers için uzun bir oligonükleotid tasarlayın. Beş ana terminalde kızılötesi floresan boya modifikasyonu ile yaklaşık 14 mers için tamamlayıcı kısa oligonükleotidler tasarlayın.

Oligonükleotidler hazırlandıktan sonra, bunları 1x Tris-EDTA tamponunda 100 mikromolar nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Tavlama için, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.6 mikrolitre beş ana boya kısa oligonükleotid, 1.2 mikrolitre uzun oligonükleotid ve 28.2 mikrolitre sodyum klorür Tris-EDTA tamponunu karıştırın. Tüpü beş dakika kaynar suya koyun, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligonükleotidli suyun karanlıkta gece boyunca soğumasına izin verin.

Çift sarmallı DNA probları yapmak için, tavlanmış oligonükleotidlerin 30 mikrolitresini DNTP'ler, Klenow tamponu, Klenow beş ana boya etiketi ve 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünde çift damıtılmış su ile karıştırın. Karışımı bir PCR makinesinde 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Ardından, reaksiyonu durdurmak için 3,4 mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyin ve PCR makinesinde 20 dakika boyunca 75 santigrat derecede ısıtın.

Bunu takiben, doldurulmuş probları sodyum klorür Tris-EDTA tamponu ile 0.1 mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Oligonükleotidleri kullanıma hazır olana kadar karanlıkta eksi 20 santigrat derecede saklayın. Etiketlenmemiş probları hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpte 20 mikrolitre uzun oligonükleotid, 20 mikrolitre Long R oligonükleotid ve 60 mikrolitre sodyum klorür Tris-EDTA tamponunu karıştırın.

Tüpü beş dakika kaynar suya koyun, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligolarla birlikte suyun gece boyunca soğumasına izin verin. Tris HCl, Sodyum Klorür, Potasyum Klorür, Magnezyum Klorür, EDTA, DTT, BSA ve çift damıtılmış suyu karıştırarak bir mililitre 5x bağlayıcı tampon hazırlayın. Bağlanma reaksiyonlarını ayarlamadan önce, 80 voltta 30 dakika ila bir saat boyunca veya akım artık değişmeyene kadar tüm amonyum persülfat izlerini gidermek için %5 doğal poliakrilamid jeli 0.5x TBE ve %2.5 gliserol içinde önceden çalıştırın.

Daha sonra, dört mikrolitre 5x bağlayıcı tampon, 80 ila 200 nanogram saflaştırılmış protein A, bir mikrolitre 0.1 mikromolar boya konjuge prob ve çift damıtılmış su karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm bağlanma reaksiyonunu jel üzerine yükleyin ve jeli santimetre başına 10 voltta istenen mesafeye kadar çalıştırın.

Jeli mümkün olduğunca karanlıkta tutmak için jel aparatını alüminyum ile örtün. Kızılötesi görüntüleme sisteminin tarayıcı yatağını damıtılmış suyla temizleyin. Jeli içeren cam plakaları silerek kurulayın ve tarayıcı yatağına yerleştirin.

Kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve Al sekmesine tıklayın. Daha kalın plakalar için kanal için 700, yoğunluk için otomatik, çözünürlük için 84 mikrometre, kalite için orta ve odak ofseti için 3,5 milimetre ayarlarını kullanın. Jelin tarayıcıda kapladığı alanı seçin.

Son olarak, taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın. Elektroforezin ilerlemesi Turuncu G yükleme boyası ile görselleştirilebilirken, Bromofenol mavisi tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizine müdahale eder. Bağlanma reaksiyonuna dI-dC'nin eklenmesi, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2'nin beş ana boya DNA probu ile bağlanmasını ortadan kaldırdı.

LIM-4 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış LIM-4 mutantı ve SOX-2 soğuk probu, 6xHis-SOX-2'ye bağlanmak için kızılötesi floresan boya etiketli prob ile rekabet etmede vahşi tip soğuk prob kadar verimlidir. Bununla birlikte, SOX-2 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış LIM-4 ve SOX-2 mutant soğuk probunun rekabet verimliliği, 6xHis-SOX-2'ye bağlanmak için vahşi tip soğuk probdan çok daha düşüktür. SOX-2 DNA kompleksinin 6xHis ve bayrak epitopları kullanılarak yapılan süper kayma testleri, süper kaymalı bir SOX-2 DNA bandı ile sonuçlandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kızılötesi probları karanlıkta tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli bir DNA bağlanma dizisinin önemi gibi ek soruları yanıtlamak için CRISPR cas9 genom düzenleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, geliştirilmesinden sonra biyokimya alanındaki araştırmacıların çeşitli model organizmalarda protein-DNA etkileşimlerini keşfetmelerinin önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, radyoaktif olmayan DNA etiketlerini kullanarak protein-DNA etkileşimlerinin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Akrilamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.