Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Bu deneyin genel amacı, radyoaktif olmayan problar kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hedef dizilerinin belirlenmesi gibi moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoaktif problar kullanmaya kıyasla kolay, güvenli ve zaman kazandıran bir alternatif olmasıdır.

Bu prosedüre başlamak için, mini protein jel sistemi kullanarak 0,5x tris borat EDTA veya TBE ve %2,5 gliserol içeren yüzde beşlik doğal poliakrilamid jel hazırlayın. Dört jel için 30 mililitre jel çözeltisi hazırlamak amacıyla distile su, TBE, amonyum persülfat, TEMED, akrilamid bis ve gliserolü karıştırın. Jel çözeltisini hemen aktarın.

Polimerizasyon sonrası, jelleri 0,5x TBE ile önceden ıslatılmış şeffaf plastik filmle sarın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Ardından, yaklaşık 51 mer uzunluğunda bir uzun oligonükleotit tasarlayın. Beş prime ucunda kızılötesi floresan boya modifikasyonu olan, yaklaşık 14 mer uzunluğunda tamamlayıcı kısa oligonükleotitler tasarlayın.

Oligonükleotidler hazırlandıktan sonra, bunları 1x Tris-EDTA tamponunda 100 micromolar son konsantrasyona gelecek şekilde yeniden çözünür hale getirin. Tavlama için, 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 0,6 mikrolitre beş prime boyalı kısa oligonükleotid, 1,2 mikrolitre uzun oligonükleotid ve 28,2 mikrolitre sodyum klorür Tris-EDTA tamponunu karıştırın. Tüpü beş dakika boyunca kaynar suya yerleştirin, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligonükleotidlerin bulunduğu suyun karanlıkta gece boyunca soğumasını sağlayın.

Çift zincirli DNA probları hazırlamak için, tavlanmış oligonükleotidlerin 30 µL'sini; DNTP'ler, Klenow tamponu, Klenow 5' boya etiketi ve çift distile su ile 0,2 mL'lik bir PCR tüpünde karıştırın. Karışımı bir PCR cihazında 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, reaksiyonu durdurmak için 0,5 M EDTA'dan 3,4 µL ekleyin ve PCR cihazında 75 °C'de 20 dakika boyunca ısı ile inaktive edin.

Ardından, doldurulmuş probları sodyum klorür Tris-EDTA tamponu ile 0.1 micromolar son konsantrasyona kadar seyreltin. Oligonükleotitleri kullanıma hazır olana kadar eksi 20 degrees Celsius'ta karanlıkta saklayın. İşaretlenmemiş probları hazırlamak için, 1.5 milliliter'lik bir tüp içerisinde 20 microliter uzun oligonükleotit, 20 microliter Uzun R oligonükleotit ve 60 microliter sodyum klorür Tris-EDTA tamponu karıştırın.

Tüpü beş dakika boyunca kaynar suda bekletin, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligoların bulunduğu suyun gece boyunca soğumasına izin verin. Tris HCl, Sodyum Klorür, Potasyum Klorür, Magnezyum Klorür, EDTA, DTT, BSA ve çift distile suyu karıştırarak bir mililitre 5x bağlanma tamponu hazırlayın. Bağlanma reaksiyonlarını kurmadan önce, tüm amonyum persülfat kalıntılarını gidermek için %5 native poliakrilamid jeli 0,5x TBE ve %2,5 gliserol içinde 80 voltta 30 dakika ile bir saat arasında veya akım artık zamanla değişmeyene kadar ön çalıştırmaya tabi tutun.

Ardından, 4 µL 5x bağlanma tamponu, 80 ila 200 ng saflaştırılmış protein A, 1 µL 0,1 µM boya konjuge prob ve çift distile suyu karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bağlanma reaksiyonunun tamamını jele yükleyin ve jeli santimetrede 10 volt olacak şekilde istenen mesafeye kadar çalıştırın.

Jelin mümkün olduğunca karanlıkta kalması için jel düzeneğini alüminyum ile kaplayın. Bir kızılötesi görüntüleme sisteminin tarayıcı tablasını distile su ile temizleyin. Jeli içeren cam plakaları kurulayın ve tarayıcı tablasına yerleştirin.

Kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve Edinleme (Acquire) sekmesine tıklayın. Daha kalın plakalar için kanal için 700, yoğunluk için auto, çözünürlük için 84 mikrometre, kalite için medium ve odak kayması (focus offset) için 3,5 milimetre ayarlarını kullanın. Tarayıcı üzerinde jelin kapladığı alanı seçin.

Son olarak, taramayı başlatmak için Start'a tıklayın. Elektroforezin ilerlemesi Orange G yükleme boyası ile görselleştirilebilir; buna karşın Bromophenol blue tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizine müdahale eder. Bağlanma reaksiyonuna dI-dC eklenmesi, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2'nin beş prime boyalı DNA problarına bağlanmasını engellemiştir.

LIM-4 mutantı ve LIM-4 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış SOX-2 soğuk probu, 6xHis-SOX-2'ye bağlanma konusunda kızılötesi floresan boya ile işaretlenmiş prob ile rekabet etmede vahşi tip soğuk probu kadar etkilidir. Ancak, SOX-2 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış LIM-4 ve SOX-2 mutant soğuk probun 6xHis-SOX-2'ye bağlanmadaki rekabet verimliliği, vahşi tip soğuk probuna göre çok daha düşüktür. 6xHis ve flag epitopları kullanılarak yapılan SOX-2 DNA kompleksinin supershift analizleri, supershift edilmiş bir SOX-2 DNA bandı ile sonuçlanmıştır.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem iki ila dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, kızılötesi probların karanlıkta tutulmasının önemli olduğunu hatırlamak gerekir. Belirli bir DNA bağlanma dizisinin önemi gibi ek soruları yanıtlamak için, bu prosedürü takiben CRISPR cas9 genom düzenleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyokimya alanındaki araştırmacıların çeşitli model organizmalarda protein-DNA etkileşimlerini incelemesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, radyoaktif olmayan DNA etiketleri kullanarak protein-DNA etkileşimlerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Akrilamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.