Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol
29 Kasım 2016
Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.
Bu testin genel amacı, radyoaktif olmayan problar kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hedef dizisinin belirlenmesi gibi moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoaktif probları kullanmaya göre kolay, güvenli ve zaman kazandıran bir alternatif olmasıdır.
Bu prosedüre başlamak için, bir mini protein jel sistemi kullanarak 0.5x tris borat EDTA veya TBE ve %2.5 gliserol içeren yüzde beş doğal poliakrilamid jel hazırlayın. Dört jel için 30 mililitre jel çözeltisi hazırlamak için damıtılmış su, TBE, amonyum persülfat, TEMED, akrilamid bis ve gliserolü karıştırın. Jel solüsyonunu hemen geçirin.
Polimerizasyondan sonra, jelleri 0.5x TBE ile önceden ıslatılmış şeffaf plastik sargıya sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Ardından, yaklaşık 51 mers için uzun bir oligonükleotid tasarlayın. Beş ana terminalde kızılötesi floresan boya modifikasyonu ile yaklaşık 14 mers için tamamlayıcı kısa oligonükleotidler tasarlayın.
Oligonükleotidler hazırlandıktan sonra, bunları 1x Tris-EDTA tamponunda 100 mikromolar nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Tavlama için, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.6 mikrolitre beş ana boya kısa oligonükleotid, 1.2 mikrolitre uzun oligonükleotid ve 28.2 mikrolitre sodyum klorür Tris-EDTA tamponunu karıştırın. Tüpü beş dakika kaynar suya koyun, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligonükleotidli suyun karanlıkta gece boyunca soğumasına izin verin.
Çift sarmallı DNA probları yapmak için, tavlanmış oligonükleotidlerin 30 mikrolitresini DNTP'ler, Klenow tamponu, Klenow beş ana boya etiketi ve 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünde çift damıtılmış su ile karıştırın. Karışımı bir PCR makinesinde 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Ardından, reaksiyonu durdurmak için 3,4 mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyin ve PCR makinesinde 20 dakika boyunca 75 santigrat derecede ısıtın.
Bunu takiben, doldurulmuş probları sodyum klorür Tris-EDTA tamponu ile 0.1 mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Oligonükleotidleri kullanıma hazır olana kadar karanlıkta eksi 20 santigrat derecede saklayın. Etiketlenmemiş probları hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpte 20 mikrolitre uzun oligonükleotid, 20 mikrolitre Long R oligonükleotid ve 60 mikrolitre sodyum klorür Tris-EDTA tamponunu karıştırın.
Tüpü beş dakika kaynar suya koyun, ardından ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligolarla birlikte suyun gece boyunca soğumasına izin verin. Tris HCl, Sodyum Klorür, Potasyum Klorür, Magnezyum Klorür, EDTA, DTT, BSA ve çift damıtılmış suyu karıştırarak bir mililitre 5x bağlayıcı tampon hazırlayın. Bağlanma reaksiyonlarını ayarlamadan önce, 80 voltta 30 dakika ila bir saat boyunca veya akım artık değişmeyene kadar tüm amonyum persülfat izlerini gidermek için %5 doğal poliakrilamid jeli 0.5x TBE ve %2.5 gliserol içinde önceden çalıştırın.
Daha sonra, dört mikrolitre 5x bağlayıcı tampon, 80 ila 200 nanogram saflaştırılmış protein A, bir mikrolitre 0.1 mikromolar boya konjuge prob ve çift damıtılmış su karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm bağlanma reaksiyonunu jel üzerine yükleyin ve jeli santimetre başına 10 voltta istenen mesafeye kadar çalıştırın.
Jeli mümkün olduğunca karanlıkta tutmak için jel aparatını alüminyum ile örtün. Kızılötesi görüntüleme sisteminin tarayıcı yatağını damıtılmış suyla temizleyin. Jeli içeren cam plakaları silerek kurulayın ve tarayıcı yatağına yerleştirin.
Kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve Al sekmesine tıklayın. Daha kalın plakalar için kanal için 700, yoğunluk için otomatik, çözünürlük için 84 mikrometre, kalite için orta ve odak ofseti için 3,5 milimetre ayarlarını kullanın. Jelin tarayıcıda kapladığı alanı seçin.
Son olarak, taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın. Elektroforezin ilerlemesi Turuncu G yükleme boyası ile görselleştirilebilirken, Bromofenol mavisi tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizine müdahale eder. Bağlanma reaksiyonuna dI-dC'nin eklenmesi, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2'nin beş ana boya DNA probu ile bağlanmasını ortadan kaldırdı.
LIM-4 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış LIM-4 mutantı ve SOX-2 soğuk probu, 6xHis-SOX-2'ye bağlanmak için kızılötesi floresan boya etiketli prob ile rekabet etmede vahşi tip soğuk prob kadar verimlidir. Bununla birlikte, SOX-2 bağlanma bölgesinde mutasyona uğramış LIM-4 ve SOX-2 mutant soğuk probunun rekabet verimliliği, 6xHis-SOX-2'ye bağlanmak için vahşi tip soğuk probdan çok daha düşüktür. SOX-2 DNA kompleksinin 6xHis ve bayrak epitopları kullanılarak yapılan süper kayma testleri, süper kaymalı bir SOX-2 DNA bandı ile sonuçlandı.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kızılötesi probları karanlıkta tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli bir DNA bağlanma dizisinin önemi gibi ek soruları yanıtlamak için CRISPR cas9 genom düzenleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, geliştirilmesinden sonra biyokimya alanındaki araştırmacıların çeşitli model organizmalarda protein-DNA etkileşimlerini keşfetmelerinin önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, radyoaktif olmayan DNA etiketlerini kullanarak protein-DNA etkileşimlerinin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Akrilamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, saflaştırılmış SOX-2 proteinleri ve kızılötesi floresan boya etiketli DNA problarını kullanarak optimize edilmiş bir floresan Elektroforetik Mobilite Kayması Analizi (fEMSA) protokolü sunar. Yöntem, radyoaktif malzemeler kullanmadan protein-DNA etkileşimlerini tespit etmeyi amaçlamaktadır ve daha güvenli ve verimli bir alternatif sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Moleküler Biyoloji
- Biyokimya
- Protein-DNA Etkileşimleri
Arka Plan
- Elektroforetik Mobilite Kayması Analizleri (EMSA), protein-DNA etkileşimlerini incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel EMSA yöntemleri genellikle güvenlik riskleri taşıyan radyoaktif problara dayanır.
- Floresan problar, bu etkileşimleri tespit etmek için radyoaktif olmayan bir alternatif sunar.
- SOX-2, kök hücre biyolojisinde önemli bir proteindir ve DNA ile olan etkileşimi önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için daha güvenli, daha verimli bir protokol geliştirmek.
- Görselleştirme ve analiz için floresan problar kullanmak.
- Moleküler biyoloji ve biyokimya alanındaki araştırmacılara detaylı bir metodoloji sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Beş yüzdelik bir doğal poliakrilamid jelin hazırlanması.
- 0.5x tris borat EDTA (TBE) tamponunun kullanımı.
- İstikrar için jele gliserol dahil edilmesi.
- Jel çözeltisini oluşturmak için belirli reaktiflerin karıştırılması.
Ana Sonuçlar
- fEMSA protokolü protein-DNA etkileşimlerini başarıyla tespit eder.
- Floresan problar, güvenlik endişeleri olmadan net görselleştirme sağlar.
- Yöntem, geleneksel tekniklere kıyasla verimli ve zaman tasarrufludur.
- Sonuçlar, protokolün çeşitli biyolojik bağlamlarda uygulanabilirliğini gösterir.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş fEMSA protokolü, araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Radyoaktif olmayan yöntemler, moleküler çalışmalarda güvenliği ve verimliliği artırır.
- Bu yaklaşım, çeşitli proteinler ve DNA dizilerine uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, cost-effective detection of protein-DNA interactions using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides, eliminating radioactivity-related hazards and reducing assay turnaround time. It supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible binding data for transcription factors like SOX-2. The method enhances predictive confidence in lead identification workflows by delivering clear, analyzable electrophoretic shifts without radioisotope handling constraints.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcription factor-DNA binding specificity to validate therapeutic targets such as SOX-2 in neuronal differentiation pathways.
- Operational Value: Uses infrared fluorescent probes that allow direct visualization and quantification without autoradiography or phosphorimaging.
- Scientific Value: Detects altered binding affinity due to missense mutations (e.g., SOX-2G73E), supporting mechanistic insight into pathogenic variants.
- Operational Value: Eliminates radioactive waste disposal requirements, improving lab safety and reducing regulatory overhead.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-dependent binding curves to assess protein-DNA interaction kinetics and affinity under controlled conditions.
- Operational Value: Utilizes stable, infrared dye-labeled probes storable at −20°C, enabling batch preparation and reuse across multiple experiments.
- Scientific Value: Permits competition assays with unlabeled probes to determine binding specificity and identify effective disruptors.
- Operational Value: Compatible with standard native PAGE systems and infrared imagers, requiring no specialized electrophoresis equipment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes, such as olfactory neuron identity transformation, supporting translational relevance.
- Operational Value: Requires only purified protein and oligonucleotide inputs, making it adaptable to various disease-relevant systems.
- Scientific Value: Supershift assays using epitope-tagged proteins (e.g., 6xHis, flag) confirm complex identity, increasing data interpretability.
- Operational Value: Total assay time of 2–4 hours allows integration into medium-throughput screening cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The fEMSA method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and informing lead selection through mechanistic de-risking of protein-DNA interactions.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulator binding to cis-regulatory elements to clarify pathway activity and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding readouts that enable comparison of wild-type and mutant protein variants.
- Analytics: Generates electrophoretic shift patterns and competition data suitable for densitometric analysis and KD estimation.
- Translational Research: Connects binding defects to cellular phenotypes, aiding in biomarker-aligned target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing transcription factor-DNA interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by providing direct, visual evidence of sequence-specific binding.
- Operational Value: Reduces per-assay cost and time by avoiding radioactive probe synthesis, decay correction, and exposure delays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by minimizing false positives from nonspecific binding through rigorous controls.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with well-characterized mechanism of action at the DNA-binding level.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide annealing, fill-in reactions, and native gel electrophoresis.
- Depends on access to an infrared imaging system capable of 700 nm channel detection.
- Necessitates standardized binding buffer composition and protein purification quality for reproducible results.
- Requires dark handling of IR-labeled probes to prevent photodegradation and signal loss.
- Limited to nucleic acid-binding proteins; not suitable for RNA or protein-protein interaction studies without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Preparation of Gel, Infrared Fluorescent Dye-labeled Probes and Unlabeled Probes
4:49
Binding Reaction and Electrophoresis
6:37
Imaging
7:35
Results: Electrophoretic Mobility Shift Assays Using Purified Proteins and Dye-labeled DNA Probes
8:57
Conclusion
