Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem
August 28th, 2016
Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.
Merhaba, ben Cecile. Marsilya'daki LGBP'de çalışıyorum. Bu videoda anlatacağımız protokol, aktif olarak çevrilen mRNA'ları tanımlamak ve translasyon regülasyonunu incelemek için çeşitli bitki dokularından polizomları ve monozomları izole etmek için basit bir yöntemdir.
Örnek olarak, size altı günlük Arabidopsis thaliana fidelerinden polizomların izolasyonunu, ardından RNA'nın izolasyonunu ve sonuçların analizini göstereceğiz. Tohumları tabağa ekin ve iki gün dört derecede bırakın. Daha sonra bitkileri altı gün boyunca büyütün.
Fideyi hasat edin ve sıvı nitrojen içinde öğütün. Ağırlık 300 miligram bitki tozu ve 2.4 mililitre polizom tamponu ekleyin. Bitki parçalarını toplamak için santrifüjleyin ve süpernatanı bir sükroz gradyanının üstüne yükleyin.
Ultra santrifüj gradyanı daha sonra OD'nin sürekli okunması ile aşağıdan yukarıya doğru toplayın. Fraksiyonu bir polizoma, bir monozoma ve bir süpernatant fraksiyona çekin ve RNA'yı gece boyunca çökeltin. Ultra santrifüj, peleti yeniden süspanse edin ve sonraki analiz için RNA'yı çıkarın. Polizom profillemesi yapmadan birkaç gün önce sükroz gradyanını hazırlayın.
% 50, 35 ve% 20 sükroz çözeltisi hazırlayın ve dört derecede tutun. % 50 sükroz tabakasını dökün. Eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun.
Altı saat sonra, %35'lik katmanı ekleyin ve gece boyunca eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun. İlk% 20'lik katmanı dökün ve dondurun. Deney günü, gerekli sayıda gradyanı dondurucudan çıkarın.
Son %20'lik sükroz katmanını ekleyin ve gradyanların soğuk bir odada çözülmesine izin verin. Taze topladığımız bitkinin örneğini hazırlayın. Burada Arabidopsis thaliana'nın altı günlük fidelerini kullanıyoruz.
Sıvı nitrojen donmuş bitkileri hasat edin ve iyice öğütün. Ağırlık: 300 miligram bitki tozu. Hızlı bir şekilde 2,4 mililitre taze polizom tamponu ekleyin ve homojenize edin.
Çözeltiyi iki adet 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin. Sitozolik ekstraktı santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyin.
Bitki parçalarından kaçınmaya dikkat edin. Bir sonraki adımda profili bozarlardı. Süpernatanı, gradyanı bozmadan sükroz gradyanına yükleyin.
Gradyanı bir SW 41 rotor kovasına koyun. Merkezkaç. Polizom profilini görselleştirmek ve fraksiyonu toplamak için, gradyana dalan bir kılcal borudan yapılmış basit bir sistem kullanıyoruz. Bir UV küveti ile bağlantılıdır.
Peristaltik bir pompaya kendi kendine bağlanır. Bir UV spektrofotometresi, gradyan küvet boyunca ilerledikçe OD'yi sürekli olarak kaydeder. Fraksiyon toplayıcı, iki mililitrelik fraksiyonun toplanmasına izin verir.
Küveti temizleyin ve spektrofotometreye yerleştirin. Degradeyi rahatsız etmeden kovadan çıkarın. Klorofiller gradyanın üstünde yoğunlaşmalıdır.
Kılcal boruları gradyanın altına daldırın. Peristaltik pompayı çalıştırın. Degrade aşağıdan yukarıya doğru toplanır ve OD sürekli okunur.
İki mililitrelik fraksiyonlar toplanır. İşte klasik bir profilin şekli. RNA çökeltmesi, guanidinyum hidroklorür ve izopropanol kullanılarak gerçekleştirilir.
İlk önce, 50 mililitrelik bir tüpe bir hacim guanidinyum hidroklorür dökün ve ardından fraksiyonu ekleyin. Sonra 1.5 hacim izopropanol ve 50 mikrogram eşit kurye ekleyin. RNA'yı gece boyunca eksi 20 derecede çökeltin.
Fraksiyonları 40 mililitrelik ultra santrifüj tüplerine aktarın ve tüpü izopropanol ile dengeleyin. Merkezkaç. Süpernatanı çıkarın ve peleti havayla kurutun. Peleti 200 mikrolitre ılık TE tamponunda tekrar süspanse edin.
Klasik bir fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirerek RNA'yı daha fazla ekstrakte edin. Arabidopsis'ten altı günlük fideden elde edilen polizomların temsili bir profili burada gösterilmektedir. Ana tepe noktası, tek bir ribozomla ilişkili mRNA olan monozoma karşılık gelir.
Profilin ilk kısmı, polisomal fraksiyonlara, yani birçok ribozomla ilişkili mRNA'ya karşılık gelir. Her zirve, yeni ribozomun mRNA ile ilişkisiyle eşleşir. Profilin son kısmı, serbest ribozomal alt birimleri ve RNA'yı içeren süpernatan fraksiyona karşılık gelir.
Büyük miktarda 60S alt birimi, monozom zirvesinin yanında bir omuz oluşturur. Bütünlüklerini değerlendirmek için, fraksiyonlardan ekstrakte edilen RNA'lar, daha sonraki deneyler için kullanılmadan önce klasik bir Aragose jeli üzerinde çalıştırılabilir. Bu protokolü, polizomları Arabidopsis thaliana fidelerinden, aynı zamanda genç ve yaşlı rozetlerden ve ayrıca Nicotiana benthamiana, domates ve pirinç yapraklarından izole etmek için kullandık, bu nedenle çok çeşitli bitki ve dokularla çalışmalıdır.
Saflaştırılmış RNA'lar, polizomal fraksiyonlarla ilişkili küçük RNA'ların tanımlanmasının yanı sıra mikro dizi analizi ile uyumludur.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, bitki dokularında polizomları ve monozomları izole etmek için basit bir yöntemi tanımlar ve aktif olarak çevrilen mRNA'ların belirlenmesini ve çeviri düzenlemesinin çalışılmasını sağlar. Sağlanan örnek, altı günlüğüne Arabidopsis thaliana fidelerinin polizomlarının izole edilmesine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki biyolojisi
- Çeviri düzenlemesi
- mRNA analizi
Arka Plan
- Çeviri aktivitesini anlamak, gen ekspresyonunu incelemek için çok önemlidir.
- Polizomlar, bir mRNA molekülünü eşzamanlı olarak çeviren ribozom kümeleridir, monozomlar ise tek ribozomlardır.
- Bu yöntem, spesifik mRNA'ların translasyonel durumuna ilişkin bilgiler sağlar.
- Arabidopsis thaliana, bitki araştırmalarında model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Bitki dokularında polizomları ve monozomları izole etmek.
- Aktif olarak çevrilen mRNA'ları belirlemek.
- Bitkilerde çeviri düzenlemesini incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Tohumların plakalara ekilme ve iki gün boyunca soğuk stratifikasyonu.
- Fidelerin optimum koşullarda altı gün boyunca büyütülmesi.
- Bitki dokularında polizomların ve monozomların izole edilmesi.
- Çeviri aktivitesini belirlemek için RNA analizi.
Ana Sonuçlar
- Arabidopsis thaliana fidelerinden polizomların başarılı izole edilmesi.
- Aktif olarak çevrilen mRNA'ların tanımlanması.
- Bitki dokularında çeviri düzenlemesine ilişkin bilgiler.
- Çevirinin incelenmesi için yöntemin etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu protokol, bitkilerde çeviri çalışmaları için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Gen ekspresyonu düzenlemesini anlamamızı geliştirir.
- Yöntem çeşitli bitki türlerine uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
