Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Merhaba, ben Cecile. Marsilya'daki LGBP'de çalışıyorum. Bu videoda açıklayacağımız protokol, aktif olarak transle edilen mRNA'ları tanımlamak ve translasyon regülasyonunu incelemek amacıyla çeşitli bitki dokularından polisomların ve monozomların izole edilmesine yönelik basit bir yöntemdir.

Örnek olarak, altı günlük Arabidopsis thaliana fidelerinden polizomların izolasyonunu, ardından RNA izolasyonunu ve sonuçların analizini size göstereceğiz. Tohumları plaklara ekin ve iki gün boyunca dört derecede bekletin. Ardından bitkileri altı gün boyunca büyütün.

Fideleri hasat edin ve sıvı azot içerisinde öğütün. 300 miligram bitki tozunu tartın ve 2,4 mililitre polisom tamponu ekleyin. Bitki parçalarını toplamak için santrifüjleyin ve süpernatantı bir sakroz gradyanının üzerine yükleyin.

Ultra santrifüj gradyanını ardından OD okuması sürekli olarak yapılarak alttan üste doğru toplayın. Fraksiyonları polisom, monozom ve süpernatan fraksiyonu olarak ayırın ve RNA'yı gece boyunca çöktürün. Ultra santrifüj yapın, pelletle yeniden süspandirin ve sonraki analizler için RNA'yı ekstrakte edin. Polisom profilini gerçekleştirmeden birkaç gün önce sakkaroz gradyanını hazırlayın.

%50, %35 ve %20'lik sükroz çözeltileri hazırlayın ve bunları dört derecede saklayın. %50'lik sükroz katmanını dökün. Bunu eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun.

Altı saat sonra, %35'lik katmanı ekleyin ve bir gece boyunca -40 °C dondurucuda dondurun. İlk %20'lik katmanı dökün ve dondurun. Deney günü, dondurucudan gerekli sayıda gradyanı çıkarın.

Son %20 sükroz katmanını ekleyin ve gradyanların soğuk odada çözülmesini bekleyin. Taze topladığımız bitki örneğini hazırlayın. Burada, altı günlük Arabidopsis thaliana fideleri kullanıyoruz.

Sıvı azotla dondurulmuş bitkileri hasat edin ve iyice öğütün. 300 mg bitki tozunu tartın. Hızla 2,4 ml taze polisom tamponu ekleyin ve homojenize edin.

Çözeltiyi iki adet 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin. Sitozolik ekstraktı santrifüjleyin. Süpernatantı pipetleyin.

Bitki parçalarından kaçınmaya dikkat edin. Bunlar bir sonraki adımda profilin bozulmasına neden olur. Süpernatantı, gradyanı bozmadan sükroz gradyanına yükleyin.

Gradyanı bir SW 41 rotor kovasına yerleştirin. Santrifüjleyin. Polizom profilini görselleştirmek ve fraksiyonları toplamak için, gradyanın içine daldırılan bir kılcal tüpten oluşan basit bir sistem kullanıyoruz. Bu tüp bir UV küvetine bağlıdır.

Bir peristaltik pompaya kendiliğinden bağlanmıştır. Bir UV spektrofotometre, gradyan küvetten geçerken OD'yi sürekli olarak kaydeder. Fraksiyon toplayıcı, iki mililitrelik fraksiyonların toplanmasını sağlar.

Küveti temizleyin ve spektrofotometreye yerleştirin. Gradyanı, bozmadan kovadan çıkarın. Klorofiller gradyanın üst kısmında konsantre edilmiş olmalıdır.

Kılcal tüpleri gradyanın dibine kadar daldırın. Peristaltik pompayı çalıştırın. Gradyan aşağıdan yukarıya doğru toplanır ve OD sürekli olarak okunur.

İki mililitrelik fraksiyonlar toplanır. Burada klasik bir profilin görünümü yer almaktadır. RNA çöktürmesi, guanidinyum hidroklorür ve izopropanol kullanılarak gerçekleştirilir.

Öncelikle, 50 mililitrelik bir tüpe bir hacim guanidinyum hidroklorür dökün ve ardından fraksiyonu ekleyin. Sonrasında 1,5 hacim izopropanol ve 50 µg eş değer taşıyıcı ekleyin. RNA'yı -20 °C'de gece boyunca çöktürün.

Fraksiyonları 40 mililitrelik ultra-santrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri izopropanol ile dengeleyin. Santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti havada kurutun. Peleti 200 mikrolitre ılık TE tamponu içinde yeniden süspande edin.

Klasik fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirerek RNA'yı daha fazla saflaştırın. Altı günlük Arabidopsis fidelerinden elde edilen polisom ekstraktının temsili bir profili burada gösterilmiştir. Ana pik, tek bir ribozomla ilişkili olan mRNA'lar olan monozoma karşılık gelmektedir.

Profilin ilk kısmı, çok sayıda ribozoma bağlı mRNA'ları, yani polizomal fraksiyonları temsil eder. Her bir pik, yeni bir ribozomun mRNA'ya bağlanmasına karşılık gelir. Profilin son kısmı ise, serbest ribozomal alt birimleri ve RNA'yı içeren, supernatant fraksiyonu olarak adlandırılan kısma karşılık gelir.

60S alt birimlerinin yüksek miktarı, monozom pikinin yanında bir omuz oluşturur. Bunların bütünlüğünü değerlendirmek için, fraksiyonlardan ekstrakte edilen RNA'lar, daha ileri deneylerde kullanılmadan önce klasik bir Agaroz jelinde yürütülebilir. Bu protokolü Arabidopsis thaliana fidelerinden, ayrıca genç ve yaşlı rozetlerden ve Nicotiana benthamiana, domates ve pirinç yapraklarından polizomları izole etmek için kullandık; bu nedenle geniş bir bitki ve doku yelpazesinde çalışması gerekir.

Saflaştırılmış RNA'lar, mikro dizi analizinin yanı sıra polizomal fraksiyonlarla ilişkili küçük RNA'ların tanımlanmasıyla da uyumludur.