Name: Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin, bitki dokularından polizom ve monozom izolasyonu için basit bir yöntemi. Arabidopsis thaliana fide örneğinde aktif olarak çevrilen mRNA'ları belirleyin ve bitkilerde translasyon düzenlemesini çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-14-CE02-0010) tarafından desteklenmiştir. Biz yazının eleştirel okuma Dr Benjamin Field ve Dr. Elodie Lanet teşekkür ederim. Biz video düzenleme ile yaptığı yardım için Bay Michel Terese teşekkür ederim.

% 20 ila 50 (ağırlık / hacim) sukroz dereceleri hazırlanması 1. Not: Gradyan 13,2 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüpüne sükroz 4 kat (% 50,% 35 ve% 20 2 kat) imal edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, iki ayrı katmanlar halinde% 20 sukroz dökme ölçüde Polizom hazırlıkları kalitesini artırır. <ol><li> stok çözümleri hazırlayın. tüm çözümler RNAse ve DNAse serbest olduğundan emin olun. <ol><li> 400 mM Tris-HCI pH 8.4, 200 mM KCI, 100 mM MgCl2: 10X tuz solüsyonu. </li><li> 200 ml 1X tuz çözeltisi içinde sakrozun 137 g çözülür: 2 M sukroz çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> gradyanlar hazırlamak için, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, tuz çözeltisi içinde sukroz çözeltisi ile seyreltilir. Verilen miktarlar altı geçişlerini içindir. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nihai sakaroz konsantrasyonu </td><td> sukroz 2M (mi) </td><td> Tuz çözeltisi 1X (mi) </td><td> Nihai Vol. (mi) </td></tr><tr><td> % 50 </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> % 35 </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> % 20 </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> % 20 </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tablo Sukroz Çözüm 1. dilüsyonlar altı geçişlerini hazırlamak. <ol start="3"><li> Tablo 2&#39;deki gibi katmanları dökün. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sukroz katmanıdır </td><td> % 50 </td><td> % 35 </td><td> % 20 </td><td> % 20 </td></tr><tr><td> Vol. (Mi) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> Katman başına sukroz çözeltisi Tablo 2. Cilt. <ol start="4"><li> Her katman döküldükten sonra, bir -40 ° C tüpler tutmak veya -80 ° C derin dondurucuda tam donma kadar bir sonraki sakaroz katmanı eklemeden önce. Donma, genellikle -40 ° C de 2 saat sonra elde edilir, ancak bir sonraki tabaka dökülmeden önce yaklaşık 6 saat bekleyen önerilir. Son 20% tabaka donduruldu ve deney gününde taze olarak ilave edilebilir. Not: Bir sonraki bir eklemeden önce her bir katmanı Donma tabakaların herhangi karıştırma veya rahatsızlık önler. Gradyanlar bir -40 ° C&#39;de saklanır ya edilebilir -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya en az altı ay süreyle. </li><li> Zaten bitmiş değilse, deney günü degradeler son% 20 katman ekleyin. Sonra, degradeler soğuk bir odada ya da bir buzdolabı çözülme sağlar. </li></ol> Sitosolik özleri 2. Hazırlık Not: tavsiyesinebiyolojik numune başına iki gradyanları kullanılarak sona erer. 300 mg 6 günlük, Arabidopsis thaliana fide çalışırken iki gradyan hazırlanması için bitki malzemesi uygun bir miktardır. az translationally aktif dokularda çalışırken, bitki materyali miktarı 600 mg kadar artırılabilir. <ol><li> ½ Murashige ve Skoog yetiştirilen Hasat altı gün eski fideler 8 orta sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulması ile% 1 sükroz veya eşdeğer medya ile desteklenmiş </li><li> sıvı nitrojen ile önceden soğutulmuş havan ve tokmak taşlama bitki malzemesi. </li><li> önceden soğutulmuş tartım tabağına toz malzemenin 300 mg tartılır. Numunenin çözülme önlemek için hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin. Not: -80 ° C derin dondurucuda en fazla bir hafta dondurulmuş örnekleri tutun. </li><li> Dallanmış önceden soğutulmuş polisom tamponu 2.4 ml (Tuz Çözeltisi 4X, 5.26 mM EGTA,% 0.5 (h / h) oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol, 50 μg.ml -1 sikloheksimid, ekleme 50 μg.ml 1kloramfenikol) ve pipet ile karıştırılarak homojenize. iki adet 1,5 ml tüpler içine aktarın. ısınma örnekleri önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. </li><li> bir mikrosantrifüj 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin yıkıntıları pelet haline getirildi. Not: Her zaman, RNA bozulmasını önlemek 4 ° C&#39;de örnekleri tutmak için, RNaz / DNaz ücretsiz koşullarda RNaz / DNaz ücretsiz çözümler ve çalışmayı kullanma. Heparin RNA korumasını geliştirmek için, 300 μg.ml -1 nihai konsantrasyona kadar, polisom tampon eklenebilir. Ancak, aşağı analizi engelleyebilir heparin beri, bu lityum klorür yağış yerine etanol yağış (bkz not 4.7) gerçekleştirerek RNA yağış adımı sırasında kaldırılması gerekir. </li></ol> 3. Polizom Profil <ol><li> Dikkatle pelet bozmadan süpernatant pipetle. Bitki parçaları pipetle varsa, adımı 2.5 tekrarlayın. hafifçe pipettin tarafından degrade üstünde yüzer yükleyinsabit bir akışı tüpün yan duvar üzerine g. Her 1.5 ml tüp için bir degrade kullanın. </li><li> (A SW41 rotor kullanıldığında, örneğin 32.000 rpm) bir ultrasantrifüjdeki, 4 ° C&#39;de 2 saat 45 dakika süre ile 175,000 x g&#39;de kepçe ve santrifüj soğutulmuş aktarın. </li><li> Şekil 1&#39;de açıklandığı gibi degrade toplama sistemi kurmak. UV küvet 1 mm yol uzunluğuna sahiptir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Şekil 1. Gradient toplama sistemi. UV küvet degrade altına inen bir cam kılcal tüp polivinil klorür boru ile bağlanır. degrade bir peristaltik pompa sistemi sayesinde yoluyla ilerler. OD 260 sürekli okunur ve 2 ml&#39;lik fraksiyonlar toplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız</a>bu figür. <ol start="4"><li> Oda sıcaklığına fraksiyon toplayıcısı ayarlayın ve 2 mi fraksiyon koleksiyonu sağlayacak bir hızda döner bandı ayarlayın. Önceden soğutulmuş toplama tüpleri kullanın. </li><li> gradyan toplama sistemine polivinil klorür boru ile bağlı bir cam kılcal tüp kullanarak alttan üste doğru kesirler toplayın. polivinil klorür boru ve cam kılcal boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için plastik bir parafin filmi kullanın. </li><li> degrade yukarıya doğru 260 nm&#39;de absorbansı okumak. Tüm gradyanı elde edildiğinde, RNA ekstraksiyonu önce buz üzerinde toplama tüpleri. </li></ol> 4. RNA Ekstraksiyon <ol><li> aşağıdaki gibi, santrifüj tüpleri şapkalı 50 ml iki geçişlerini toplanan kesirler, havuz: Polizom: fraksiyonlar 1-3 (12 mi) Monosomes: fraksiyon 4 (4 mi) Süpernatant: fraksiyonlar 5 ve 6 (8 mi) </li><li> Her fraksiyon için, 1 vol ekleyin. 8 M guanidin hidroklorür,50 ug akril taşıyıcısı ve 1.5 hac. izopropanol. Not: Akrilik taşıyıcı alkol çökeltme sırasında, nükleik asitlerin geri kazanımını arttırmak için coprecipitant olarak kullanılan lineer akrilamid vardır. </li><li> tüpler ters çevirerek karıştırınız ve -20 ° C &#39;de O / N hızlandırabilir. </li><li> bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C&#39;de 1 saat, (a SW32 rotor içinde 32.000 rpm) 175,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Çökeltme aşaması, ultra-santrifüj ile uyumlu olmayan bir tüp içinde gerçekleştirilir, uygun bir tüp aktarın. </li><li> Süpernatant atılır ve 200 mL RNaz içermeyen TE tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 7,5-1 mM EDTA) içinde pelet çözülür. yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe transfer edin. </li><li> 1 vol ekleyerek RNA ayıklayın. suyla doyurulmuş fenol (pH 6.6) ve 1 hacim. kloroform: izoamil alkol (24: 1). kuvvetlice karıştırın. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe sulu faz transfer. Not: asit fenol (pH 4.5), DNA kontaminasyonu en aza indirmek için de kullanılabilir. </li><li>1/10 vol ekleyerek RNA hızlandırabilir. 3 M sodyum asetat ve 3 hac. % 100 etanol eklenmiştir. -20 ° C&#39;de 20 dakika veya O / N -80 ° C&#39;de çökelmesine izin verin. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Not: polisom tamponu (bakınız Not 2.5) içinde heparin kullanılarak, uygun bir şekilde alt analizi 9 müdahale edebilecek heparin arındırıldı etanol çökeltme yerine lityum klorür (LiCİ) çökelmesini gerçekleştirin. Ekstraksiyon işleminden sonra, 4 ° C&#39;de 20 ° C veya O / N 30 dakika çöktürülmüştür 2.5 M bir son konsantrasyona kadar LiCI ekleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 500 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın. Hava pelet kurutulur ve 30 ul TE tampon maddesi içinde çözülür. Bir RNazsız% 1.2 agaroz jeli (100V, 15 dakika) ya da kapiller elektroforez yöntemlerle elektroforez RNA kalitesini değerlendirmek. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Bir grafik ve veri analizi yazılımı İhracat ham veriler. NotŞekil 2A ve B de gösterildiği gibi, ham profil niteliksel bilgileri vermek: görülebileceği polisom tepe sayısı monosome tepe yüksekliği ve serbest ribozom alt birimlerine karşılık gelen bir omuz varlığı. </li><li> örnekler arasındaki profillerin karşılaştırılması izin profilleri Birleştirme. Her numune için monosome zirve X değerini belirlemek için ekran okuyucu aracını kullanın ve eğrilerin başında ekstra veri noktaları kaldırarak monosome doruklarına hizalayın. eğrinin en alçak noktası belirlemek ve Y değeri (ekran okuyucu aracını kullanarak) belirler. &quot;Set sütunları değer&quot; fonksiyonunu kullanarak 0&#39;a en alçak noktası Y değerini ayarlayın. </li><li> Ham bulunmaktadır (Şekil 3C) için eğri altındaki alanların integrasyonu ile belirlenmişlerdir polisomlann / monosomes oranını belirler. alanın sınır entegre edilecek tanımlamak için veri seçici aracını kullanın. Sonra entegre fonksiyonu (Analiz-Matematik) kullanın. </li><li> normalleştirmekmonosome tepe zirvesine Y değerine göre bir eğrinin tüm veri noktalarını bölerek monosome zirve eğrileri (ekran okuyucu aracını kullanarak belirlenir). sütunu seçin, ardından Analiz-Matematik altında, Normale seçin ve &quot;belirli bir değere bölünmesi&quot; yöntemleri seçin. Bu adım, polizom göreli seviyesi (Şekil 3D) karşılaştırılmasına olanak sağlar. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Şekil 2. Örnek polisom profilleri., Arabidopsis thaliana, vahşi tip (wt, ekotip col-0) ve mutant fideleri uzun gün fotoperiyodların (16 saat ışık, 8 saat karanlık) altında yarım Murashige ve Skoog ortamı üzerine, altı gün süre ile büyütülmüştür. A: wt fideler ham Polizom profilleri. B: mutant fideler ham Polizom profilleri. C: eğri D altındaki alanın entegrasyonu ile polizom ve monosomes yüzdesinin belirlenmesi: Polizom profiles monosome zirveye normalize. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).</li>
<li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li>
<li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms%3A+30+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li>
<li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starting+the+protein+synthesis+machine%3A+eukaryotic+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li>
<li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Arabidopsis+protocols%22">Arabidopsis protocols</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).</li>
<li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+and+transcript+copy+numbers%2C+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+syst+biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).</li>
<li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li>
<li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li>
<li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngolia%2C+NT+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Burada sunduğumuz protokol, polizom profilleri oluşturmak ve polizomlar, tek ribozomlar veya ribozomlar içermeyen mRNA'ları izole etmek için kolay ve ucuz bir yöntemdir. Literatürde çok çeşitli farklı polizom fraksiyonlama yöntemleri tanımlanmıştır. Burada anlattığımız yöntem, yalnızca gerekli bileşikleri tutacak şekilde optimize edilmiş ve bitki materyali için uyarlanmıştır. Özellikle, deterjan11 miktarını azalttık ve kloroplastik ribozomları mRNA'ya sabitlemek için tampona kloramfenikol ekledik (sikloheksimi...

Protein sentezi, bütün hücreler 1 çok önemli ve enerjik olarak masraflı bir işlemdir. Her şeyden önce, hücreler için makine, ribozom üretiminde enerji yatırım gereklidir. Örneğin bir aktif bölünmesi maya hücre Dakikada kadar 2.000 olarak ribozomlar üretir. Böyle bir üretimi toplam transkripsiyonel aktivitenin% 60 ve hücrenin 2 toplam birleştirme etkinliğinin% 90 kadar gerektirmektedir. Ayrıca, enerji amino asitler, aminoasil-tRNA ve peptid bağlarının sentezi için gereklidir. Bitkilerde, ATP 3 4.5 5.9 moleküllerden bir peptid zinciri maliyetlerine bir amino asit eklenerek. Nedenle, protein mRNA&#39;nın çeviri bunun değişen çevre koşullarına ile ilgili söz konusu, özellikle düzenlemenin önemli bir yer olması şaşırtıcı değildir. Ribozom bir mRNA&#39;nın birliğidir çeviri başlangıç ​​aşaması, düzenlenmesi ana hedefidirçeviri 4. Bir tercüme düzenlemenin bir sonucu olarak ve diğer transkripsiyon sonrası düzenleme adım olarak, protein konsantrasyonuna varyasyonları sadece% 40 mRNA bolluğu 5,6 ile açıklanabilir. Böylece, toplam mRNA çalışma protein bolluğu hakkında nispeten zayıf bilgi verir. Öte yandan, ribozom ile mRNA&#39;nın dernek çeviri katılanların mRNA erişim sağlayan protein bolluğu içine daha iyi fikir verir. Aktif tercüme mRNAlar polisomlann adlandırılan yapılar çeşitli ribozom ile ilişkilidir. Tersine, kötü çevrilmiş mRNA&#39;ların tek Ribozom (monosome) ile ilişkili olacaktır. Sonuç olarak, bir mRNA&#39;nın translasyon durumu ribozom 7 ile ilişkisi izleyerek değerlendirilebilir. Bu protokol altı gün eski Arabidopsis thaliana fide, RNA sonraki izolasyonu polizom izolasyonunu ve sonuçların analizini açıklar. polysomes ve monosomes bir sükroz yoğunluk gradyanı ile ayrılmıştır. Gradyanlar altı fraksiyon halinde toplanır. Polisomlar, monosomes ve ribozomlar ile ilişkili olmayan serbest 60S ve 40S ribozomal alt birimleri ve mRNA içeren hafif kısmını (bundan sonra adlandırılan yüzer madde): kesirler Bazı üç iyi ayrılmış kesirler elde etmek için bir araya getirilir. Küresel için etkinliği ve polisomlann profilleri karşılaştırarak eğri altında kalan alan entegrasyonu tarafından belirlenen bir polisom / monosome oranı üretilmesiyle tahmin edilebilir. mRNA ve proteinlerin daha sonra farklı fraksiyonlardan çıkarılır ve RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, mikrodizi, Western blot veya proteomik ile analiz için kullanılmıştır. Bu protokol, diğer bitkiler ve dokular için onaylanmıştır. Bu protokol gerçekleştirmek için gerekli ekipman yaygın çoğu laboratuvarlarda bulunur: bir degrade üreticisi için gerek yoktur. Bir sonraki önlemek eklemeden önce her katmanı Donmatabakaların herhangi bir karışımını ya da rahatsızlık dan. Resim boru delicisi gradyanı içinde bir cam kılcal tüp daldırma ile elde edilebilmektedir gradyan toplanması için kullanılır. Bu nedenle, yüksek maliyetli ultrasantrifüj borular hasarsız kalır ve birçok kez yeniden kullanılabilmektedir. Topluca, bu mevcut protokol Polizom profil için kolay ve ucuz bir yöntemdir yapar.

<table><tbody><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü, ince duvar, poliallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü, ince duvar, poliallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal boru</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima serisi</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polivinil klorür borusu ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polivinil klorür boru, 2,29 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV küvet</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Kuvars akışlı küvet</td></tr><tr><td>UV Spektrofotometre Varian</td><td></td><td>Cary50</td><td>Her 0.0125 saniyede bir okuyun</td></tr><tr><td>Tüm kimyasallar</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>Kullanım Sadece Moleküler Biyoloji Sınıfı</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol, dallı (Nonidet P40)</td> <td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Doğrusal akrilamid (akrilik taşıyıcı)</td> <td>ThermoFischer bilimsel</td><td>AM9520</td><td>RNA çökeltme taşıyıcı</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

bitki polizom profiling için bir kolay yöntem

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

mRNA'nın proteine çevirisi, temel ve yüksek düzeyde düzenlenmiş bir biyolojik süreçtir. Polizom profillemesi, translasyonel düzenlemenin analizi için altın standart olarak kabul edilir. Burada açıklanan yöntem, çeşitli bitki dokularından polizomları parçalamak için kolay ve ekonomik bir yoldur. Her katmanı sırayla dondurarak bir gradyan yapıcıya ihtiyaç duymadan bir sükroz gradyanı yapılır. Sitozolik ekstraktlar daha sonra sitozolik ve kloroplastik ribozomları mRNA'ya hareketsiz hale getirmek için sikloheksimid ve kloramfenikol içeren bir tampon içinde hazırlanır ve sükroz gradyanına yüklenir. Santrifüjlemeden sonra, ultrasantrifüj tüpünü delmeden altı fraksiyon doğrudan gradyanın altından üstüne toplanır. Toplama sırasında, 260 nm'deki absorbans, küresel öteleme aktivitesinin anlık görüntüsünü veren bir polizom profili oluşturmak için sürekli olarak okunur. Fraksiyonlar daha sonra üç farklı mRNA popülasyonu hazırlamak için bir araya getirilir: polizomlar, birkaç ribozoma bağlı mRNA'lar; monozomlar, bir ribozoma bağlı mRNA'lar; ve ribozomlara bağlı olmayan mRNA'lar. mRNA'lar daha sonra ekstrakte edilir. Bu protokol, Arabidopsis thaliana fideleri ve yetişkin bitkiler, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum ve Oryza sativa yaprakları dahil olmak üzere farklı bitki ve dokular için doğrulanmıştır.

Literatürde, polisom profilleri genellikle örneğin, yukarıdan aşağıya doğru, gradyanlar toplanır şeklinin bir sonucu olarak, ağır fraksiyonuna hafif fraksiyondan gösterilmiştir. Burada anlatılan protokolde geçişlerini alttan üste doğru toplanır, biz göstermek profilleri ağır fraksiyon (Polisomlar) ile başlar ve hafif fraksiyon (serbest ribozom alt birimlerinin ve RNA&#39;lar) (Şekil 2A) gidin. Daha sonra, altı, 2 ml fraksiyonlar her gradyanı toplama ancak polisom içeriği...

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Merhaba, ben Cecile. Marsilya'daki LGBP'de çalışıyorum. Bu videoda açıklayacağımız protokol, aktif olarak transle edilen mRNA'ları tanımlamak ve translasyon regülasyonunu incelemek amacıyla çeşitli bitki dokularından polisomların ve monozomların izole edilmesine yönelik basit bir yöntemdir.Örnek olarak, altı günlük Arabidopsis thaliana fidelerinden polizomların izolasyonunu, ardından RNA izolasyonunu ve sonuçların analizini size göstereceğiz. Tohumları plaklara ekin ve iki gün boyunca dört derecede bekletin. Ardından bitkileri altı gün boyunca büyütün.Fideleri hasat edin ve sıvı azot içerisinde öğütün. 300 miligram bitki tozunu tartın ve 2,4 mililitre polisom tamponu ekleyin. Bitki parçalarını toplamak için santrifüjleyin ve süpernatantı bir sakroz gradyanının üzerine yükleyin.Ultra santrifüj gradyanını ardından OD okuması sürekli olarak yapılarak alttan üste doğru toplayın. Fraksiyonları polisom, monozom ve süpernatan fraksiyonu olarak ayırın ve RNA'yı gece boyunca çöktürün. Ultra santrifüj yapın, pelletle yeniden süspandirin ve sonraki analizler için RNA'yı ekstrakte edin. Polisom profilini gerçekleştirmeden birkaç gün önce sakkaroz gradyanını hazırlayın.%50, %35 ve %20'lik sükroz çözeltileri hazırlayın ve bunları dört derecede saklayın. %50'lik sükroz katmanını dökün. Bunu eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun.Altı saat sonra, %35'lik katmanı ekleyin ve bir gece boyunca -40 °C dondurucuda dondurun. İlk %20'lik katmanı dökün ve dondurun. Deney günü, dondurucudan gerekli sayıda gradyanı çıkarın.Son %20 sükroz katmanını ekleyin ve gradyanların soğuk odada çözülmesini bekleyin. Taze topladığımız bitki örneğini hazırlayın. Burada, altı günlük Arabidopsis thaliana fideleri kullanıyoruz.Sıvı azotla dondurulmuş bitkileri hasat edin ve iyice öğütün. 300 mg bitki tozunu tartın. Hızla 2,4 ml taze polisom tamponu ekleyin ve homojenize edin.Çözeltiyi iki adet 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin. Sitozolik ekstraktı santrifüjleyin. Süpernatantı pipetleyin.Bitki parçalarından kaçınmaya dikkat edin. Bunlar bir sonraki adımda profilin bozulmasına neden olur. Süpernatantı, gradyanı bozmadan sükroz gradyanına yükleyin.Gradyanı bir SW 41 rotor kovasına yerleştirin. Santrifüjleyin. Polizom profilini görselleştirmek ve fraksiyonları toplamak için, gradyanın içine daldırılan bir kılcal tüpten oluşan basit bir sistem kullanıyoruz. Bu tüp bir UV küvetine bağlıdır.Bir peristaltik pompaya kendiliğinden bağlanmıştır. Bir UV spektrofotometre, gradyan küvetten geçerken OD'yi sürekli olarak kaydeder. Fraksiyon toplayıcı, iki mililitrelik fraksiyonların toplanmasını sağlar.Küveti temizleyin ve spektrofotometreye yerleştirin. Gradyanı, bozmadan kovadan çıkarın. Klorofiller gradyanın üst kısmında konsantre edilmiş olmalıdır.Kılcal tüpleri gradyanın dibine kadar daldırın. Peristaltik pompayı çalıştırın. Gradyan aşağıdan yukarıya doğru toplanır ve OD sürekli olarak okunur.İki mililitrelik fraksiyonlar toplanır. Burada klasik bir profilin görünümü yer almaktadır. RNA çöktürmesi, guanidinyum hidroklorür ve izopropanol kullanılarak gerçekleştirilir.Öncelikle, 50 mililitrelik bir tüpe bir hacim guanidinyum hidroklorür dökün ve ardından fraksiyonu ekleyin. Sonrasında 1,5 hacim izopropanol ve 50 µg eş değer taşıyıcı ekleyin. RNA'yı -20 °C'de gece boyunca çöktürün.Fraksiyonları 40 mililitrelik ultra-santrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri izopropanol ile dengeleyin. Santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti havada kurutun. Peleti 200 mikrolitre ılık TE tamponu içinde yeniden süspande edin.Klasik fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirerek RNA'yı daha fazla saflaştırın. Altı günlük Arabidopsis fidelerinden elde edilen polisom ekstraktının temsili bir profili burada gösterilmiştir. Ana pik, tek bir ribozomla ilişkili olan mRNA'lar olan monozoma karşılık gelmektedir.Profilin ilk kısmı, çok sayıda ribozoma bağlı mRNA'ları, yani polizomal fraksiyonları temsil eder. Her bir pik, yeni bir ribozomun mRNA'ya bağlanmasına karşılık gelir. Profilin son kısmı ise, serbest ribozomal alt birimleri ve RNA'yı içeren, supernatant fraksiyonu olarak adlandırılan kısma karşılık gelir.60S alt birimlerinin yüksek miktarı, monozom pikinin yanında bir omuz oluşturur. Bunların bütünlüğünü değerlendirmek için, fraksiyonlardan ekstrakte edilen RNA'lar, daha ileri deneylerde kullanılmadan önce klasik bir Agaroz jelinde yürütülebilir. Bu protokolü Arabidopsis thaliana fidelerinden, ayrıca genç ve yaşlı rozetlerden ve Nicotiana benthamiana, domates ve pirinç yapraklarından polizomları izole etmek için kullandık; bu nedenle geniş bir bitki ve doku yelpazesinde çalışması gerekir.Saflaştırılmış RNA'lar, mikro dizi analizinin yanı sıra polizomal fraksiyonlarla ilişkili küçük RNA'ların tanımlanmasıyla da uyumludur.

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Bu protokol, bozulmamış soya fasulyesi nodüllerinden ökaryotik polizom saflaştırma için bir yöntemi açıklar. Dizilemeden sonra, transkriptom ve translatom seviyelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için gen ekspresyon analizi için standart boru hatları kullanılabilir.

Soya Fasulyesi Simbiyotik Nodüllerinden Polizom Saflaştırma

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Öğrenin, bitki dokularından polizom ve monozom izolasyonu için basit bir yöntemi. Arabidopsis thaliana fide örneğinde aktif olarak çevrilen mRNA'ları belirleyin ve bitkilerde translasyon düzenlemesini çalışın.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Daha fazla video keşfet