Name: Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Öğrenin, polidimetilsiloksan ince film kullanarak otomatik lipid çift katman oluşturma yöntemini. Bu teknik, membran-protein etkileşimlerini çalışmak için saatte yüzde 80'den fazla başarı oranı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan Öncü Araştırma Merkezi Programı (NRF-2012-0009575) ve Ulusal Araştırma Vakfı Hibeleri (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Inha Üniversitesi Araştırma Bursu tarafından da kısmen desteklenmiştir.

1. Solüsyon Hazırlama <ol><li> Tampon çözeltisinin hazırlanması: <ol><li> Tampon çözeltisi formüle 1 M KCl (potasyum klorür), 10 mM Tris-HCl (Tris-hidroklorür) ve damıtılmış su içinde 1 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) çözülür ve 8.0 pH ayarlamak için. </li><li> 0.20 mikron filtre kullanarak çözüm Filtre. sterilize etmek için, 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;da, çözelti otoklav. </li></ol></li><li> boya öncesi lipid çözeltisinin hazırlanması: <ol><li> (A: h) DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glisero-3-fosfatidilkolin) lipit, boya öncesi lipid çözeltisi formüle% 3 çözünmesi için 2 karışımı içinde: 8 N -dekan ve heksadekan (hacim: h). Bir rotator kullanarak gece boyunca karıştırın. </li></ol></li><li> zar oluşumu lipid çözeltisinin hazırlanması: <ol><li> % 0.1 DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glisero-3-fosfatidilkolin) lipid çözülür, zar oluşumu lipid çözeltisi formüle etmek (a: h) 2 karışımı içinde: 8 kareualene ve heksadekan (hacim: hacim). Bir rotator kullanarak gece boyunca karıştırın. </li></ol></li></ol> PDMS İnce Film 2. oluşumu <ol><li> PDMS ön-polimerin oluşturulması için bir karıştırma bardak 1 (ağırlık / ağırlık) oranında bir 9 PDMS ve sertleştirme ajanı karıştırılır. PDMS ince film (- 250 um kalınlıkta 200) oluşturulması için bir Petri kabı PDMS prepolimerin 5 g ekleyin. ince bir film meydana getirmek üzere 10 saniye süre ile 800 rpm&#39;de bir eğirme kaplayıcı kullanılarak PDMS nin önceden polimeri ayırmak. </li><li> Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 2 saat boyunca 100 mTorr bir basınçta bir vakum kurutucu içerisine Petri tabağına yerleştirin. 70 ° C&#39;de 5 saat boyunca bir fırın içinde pre-polimer ince film, fırında polimerize etmek için. </li><li> Bir kare PDMS ince film yapmak için, 2 x 2 cm 2 kareler içine polimerize PDMS ince film kesti. PDMS ince film merkezinde bir açıklık olmak için 500 um mikro zımba kullanarak. 8 N- dekan ve heksadekan: 2 içinde karıştırılmıştır% 3 DPhPC lipid çözeltisi ile önceden boya delikler. </li></ol> 3. Odası İmalatı ve AsseCivata <ol><li> BLM odasını imal etmek, 4 cm x 1.5 cm x 1 cm x 1.3 cm x 0.8 cm 17 1,5 cm iç kuyu ölçüleri dış boyutları ile 3 boyutlu çizim yazılımı kullanarak odasının tasarımı iki simetrik blok. </li><li> CNC makinesi ile bir PTFE bloğu kullanarak odasını zanaat ve üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol> 4. Odası Meclis <ol><li> odasına monte etmek için, iki PTFE blokları arasında boyalı-PDMS ince film yerleştirmek PDMS ince film üzerinde açıklık odasındaki delik ile uyumlu olduğunu böyle. </li><li> gres bir cam kapak (optik gözlem kolaylaştıran) kullanarak odasının dış kenarları mühür. somun ve cıvata kullanılarak monte odasına hareketsiz. NOT: Hiçbir sıvı sızıntısı olmaması için odacık iyi mühürlü olduğundan emin olun. </li></ol> Hızlandırılmış Self-montaj Formasyonu ile Membran Öncü 5. Formasyonu (MPES) <ol><li> Bir pipet kullanarak, 0.5 yatırmak8 n -dekan: 2 içinde karıştırılmıştır,% 0.1 DPhPC lipid ul odasına monte PDMS ince film açıklığı üzerine heksadekan. </li><li> Kullanımı bir dondurucu veya 10 ° C&#39;nin altında bir buzdolabında bölme depolamak önce. </li></ol> 6. Membran Oluşumu ve Doğrulama <ol><li> MPE&#39;lerin bir BLM&#39;ye oluşturmak için, buzdolabı bölme çekme ve odanın her iki tarafındaki tampon çözeltisi 2 ml askıya. dondurulmuş membran habercisi thaws kadar &lt;10 dakika boyunca bir kenara odasına ayarlayın. </li><li> tam ışık kaynağı ve mikroskop ile ilgili yüksekliğini kontrol etmek için bir micromanipulator üzerine odasına yerleştirin. BLM oluşum sürecinde optik gözlem PDMS ince film açıklığı aydınlatmak için bir halojen fiber optik aydınlatıcı kullanan bir ışık kaynağı olarak odacığın bir tarafında aydınlatır. </li><li> Diğer taraftan, bölüm oluşumu gözlemlemek için bir ışık kaynağına göre dikey dijital mikroskop yer (20 bozar0X). </li><li> BLM oluşumunu doğrulamak için, renk annulus daha parlak hale gelir diyafram merkezini görüyoruz. </li></ol> 7. Elektrik Kayıt <ol><li> Elektrik ölçümü için,&gt; 1 dakika sodyum hipoklorit bir 208 mikron kalınlığında gümüş tel ve çamaşır suyu kullanarak Ag / Cl elektrotlar hazırlar. yeterince derin odasının her tarafına Ag / Cl elektrotları yerleştirin tampon çözeltisi içine daldırma için. </li><li> mikroelektrot amplifikatör elektrotlar bağlayın. elektrofizyoloji yazılımı kullanarak, bir kare dalga elde etmek için zarından ± 10 mV üçgen dalga formu uygulanır. V_clamp (mV) belirtilen okları tıklayarak gerilim uygulayarak ayarlayın. </li><li> kayıt düğmesine (kırmızı nokta simgesi) tıklayarak membranın elektriksel özelliklerini kaydedin. düzgün bir kare dalga görülmektedir kadar kaydı ile devam edin. siyah kare simgesine tıklayarak kayıt çıkın. </li></ol> 8. İyon Kanal Ortaklığın DEĞİLE: gA lipit solüsyonuna doğrudan ilave olarak Gramicidin bir (GA) dahil, BLM oluşması üzerine spontan olarak meydana gelir. <ol><li> , GA kanal faaliyetlerini gözlemlemek membran potansiyelini elinde ölçmek için 5 kHz örnekleme hızında zarından 100 mV uygulamak için. V_clamp (mV) belirtilen okları tıklayarak gerilim uygulayarak ayarlayın. </li><li> kayıt düğmesine (kırmızı nokta simgesi) tıklayarak gA dahil elektriksel özelliklerini kaydedin. Geçerli sıçramalar görülmektedir kadar kayıt devam edin. siyah kare simgesine tıklayarak kayıt çıkın. </li><li> elektrik verileri satın alınmasından sonra, bir elektrofizyoloji yazılımı kullanarak 100 Hz düşük geçiş Bessel filtresi ile verilere filtre. </li><li> (~, Her akım atlama 0.15 NS gA iyon kanalının dimerizasyonunu gösterir) filtrelenmiş potansiyel verileri tutan mevcut atlar gözlemlemek gA birleşme doğrulamak için. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

BLM oluşturma tekniğimiz, endüstriyel kullanım için sınırlı potansiyele sahip geleneksel tekniklerin aksine, hücre zarı ve iyon kanalı çalışmaları için güçlü bir araç sağlar. Bir PDMS ince filmi kullanarak bir membran öncüsü geliştirdik ve hızlandırılmış kendi kendine montaj özelliğine sahip donmuş bir membran öncüsü tasarladık.
Membran oluşumunun yalnızca film ve lipid çözeltisi arasındaki yüzey etkileşimleri yoluyla gerçekleştiği hidrofobik filmlerle geleneksel membran oluşturma yöntemlerini...

Yapay çift katlı lipid membran ya da siyah lipid membran (BLM), hücre zarlarının ve iyon kanalları, mekanizmaların tanıtılması yanı sıra iyon kanalları ve iyonlar / molekülleri arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bir araçtır. Patch-kelepçe yönteminin rağmen 1-7 genellikle hücre zarı çalışmaları için altın standart olarak kabul edilir, bu zahmetli ve iyon kanal ölçümleri için çok yetenekli operatörleri gerektirir. 8 yapay yeniden çift katlı lipid membranlar iyon kanal çalışmaları için alternatif bir araç olarak ortaya çıkmıştır ederken, 9,10 onlar da zahmetli ile ilişkili süreçler ve özel uzmanlık. Ayrıca, membranlar mekanik tedirginlikler hassastırlar. Bu nedenle, bugüne kadar sunulan çift katlı lipid teknolojileri sınırlı pratik uygulamalar. 11 Çift katlı lipid membranlar Costello ve ark. 12 ve Ide ve Yanagida sağlamlığını ve uzun ömürlü artırmak amacıyla <sup&gt; 13 hidrojeller tarafından desteklenen bir serbest duran lipid çift geliştirdiler. Ancak gelişmiş uzun ömürlü olmasına rağmen (&lt;24 saat), iki tabakalı sağlamlığı gelişmiş değildi. Jeon ve ark., 14 (birkaç güne kadar) artmış uzun ömürlü sonuçlanan samimi hidrojel çift katlı lipid kişiyle hidrojel kapsüllü membran (HEM) tasarladı. Daha HEM ömrünü arttırmak için, Malmstadt ve Jeon ve ark., Hidrojel lipit Her iki sistemde de yerinde kovalent konjugasyon (cgHEM). 15 ile bağlama ile bir hidrojel kapsüllenmiş zar oluşturulur, membran ömürleri önemli ölçüde artmıştır (&gt; 10 gün) . Ancak, membran oluşumu sistemleri yeterince güçlü değildi ve lipit bilayers kullanımı için uzmanlık kurtarmak için gerektiğinde depolanan veya teslim edilemedi. bir lipid iki tabakalı platformunun geliştirilmesi öncelikle sağlamlığı ve BLMs uzun ömürlü etrafında dönüyordu etti. BLMs uzun ömürlü su olmasına rağmenbstantially gelişmiş son uygulamaları nedeniyle taşınabilirliği ve depolanamaması eksikliği sınırlı kalmıştır. Bu sorunları aşmak için, Jeon ve ark., Bir depolanabilir membran sistemi oluşturdu ve MP oluşturmak için bir membran öncüsü (MP). 16 tanıttı, onlar% 3 DPhPC (1,2-diphytanoyl- içeren n dekan ve heksadekan karışımı hazırladı SN -glisero-3-fosfatidilkolin) o ~ 14 ° C (oda sıcaklığının altında tipik soğutma sıcaklığının üstünde) dondurulması öyle ki, lipid çözeltisinin donma noktası kontrol edilebilir. Bu deneyde, MP politetrafloroetilen (PTFE), filmin küçük bir diyafram üzerinde yayılır ve daha sonra 4 ° C&#39;de bir buzdolabı içinde dondurulmuştur. MP oda sıcaklığına getirildi, MP eritildi ve bir lipid iki katmanlı de otomatik olarak membran oluşumu ile bağlantılı uzmanlık ortadan oluşturulmuştur. Ancak, MP yapılan BLM başarı oranı ~% 27, ve membran Formatio gibi düşük oldun zaman, (30 dk saat 24) tutarsız pratik uygulamalarını sınırlayan. Daha önce Ryu tarafından bildirilen bu çalışmada, bir polidimetilsiloksan (PDMS) ince film yerine (a) kontrol üretim süresi ve (b) BLM oluşum başarı oranını arttırmak için geleneksel bir hidrofobik ince filmler (PTFE, polioksimetilen, polistren) arasında kullanılır ve ark., 17, burada, hücre formasyonu nedeniyle PDMS gözenekli doğası çözücü ekstraksiyonu ile kolaylaştırılır, ve zar oluşumu için gerekli zaman başarılı bir şekilde bu çalışmada kontrol edilmiştir. Lipid çözeltisi PDMS ince film absorbe gibi bu sistemde, tutarlı bir membran oluşumu süresi elde edildi. Ayrıca, membran süresi nedeniyle PDMS ince film, yağ çözeltisine skualen ilavesinin bir sonucu olarak çözücülerin yavaş bir emme uzatılmıştır. Biz bu tekniği kullanarak oluşturulan membranlar i için uygun olduğunu doğrulamak için optik ve elektrik ölçümleri yapılmıştırkanal çalışmaları.

<table><tbody><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Tampon çözeltisi için</td></tr><tr><td>Tris-hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Tampon çözeltisi için</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Tampon çözeltisi için</td></tr> <tr><td>n-decane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Lipid çözeltisi için</td></tr><tr><td>Lipid çözeltisi için Hekzadekan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td></td></tr><tr><td>Skualen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Lipid çözeltisi için</td></tr><tr><td>Gramicidin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Membran proteini</td></tr><tr><td>1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Membra oluşumu için</td></tr><tr><td>Sylgard 184a ve 184b elastromer kiti</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>PDMS ince film</td></tr><tr><td>0.2 & mu üretmek için; m filter</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Tampon çözeltisini filtrelemek için</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Lipidi homojen bir şekilde çözmek için</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Tampon çözeltisini sterilize etmek için</td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>PDMS prepolimerini yaymak için</td></tr><tr><td>Vakum kurutucu</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Hava kabarcığını çıkarmak için PDMS prepolimer</td></tr><tr><td>500 & mu'da; m&nbsp; yumruk</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>PDMS ince film CNC makinesinde bir açıklık oluşturmak için</td></tr><tr><td></td><td>KOBİ ticareti</td><td>SME 2518</td><td>Membran oluşturma odası imal etmek için</td></tr><tr><td>Halojen fiber optik aydınlatıcı</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Optik gözlem için PDMS ince filmin açıklığını aydınlatmak için</td></tr><tr><td>Dijital mikroskop</td><td>Dijital mavi</td><td>QX-5</td><td>Lipid çift katmanlı membranı optik olarak gözlemlemek için Oluşum</td></tr><tr><td>Elektrodu</td><td>A-M Sistemleri</td><td></td><td>Membran oluşumunu elektriksel olarak gözlemlemek için</td></tr><tr><td>Mikroelektrot amplifikatörü (Axopatch amplifikatör)</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B Amplifikatör</td><td>Membranın kapasitansını ölçmek için (el yazmasında mikroelektrot amplifikatörü olarak tanımlanmıştır)</td></tr></tbody></table>

bir polidimetilsiloksan İnce film kullanarak otomatik çift katlı lipid membran oluşumu

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Yapay bir lipit iki tabakalı ya da siyah lipid membran (BLM), iyon kanalları ve protein etkileşimleri incelemek, hem de biyosensör uygulamaları için çok güçlü bir araçtır. Ancak, geleneksel BLM oluşum teknikleri çeşitli dezavantajları var ve onlar genellikle belirli uzmanlık ve zahmetli süreçler gerektirir. Özellikle, geleneksel BLMs düşük oluşum başarı oranları ve tutarsız membran oluşumu zaman muzdarip. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) geleneksel olarak kullanılan filmler (politetrafloroetilen, polioksimetilen, polistren) değiştirerek kontrol inceltme çıkış süresi ve gelişmiş BLM oluşum hızı ile depolanabilir ve taşınabilir BLM oluşum sistemini göstermektedir. Bu deneyde, örneğin PDMS ince film gibi bir gözenekli yapılı bir polimer kullanılır. Düşük viskoziteli geleneksel olarak kullanılan çözücülere karşı ek olarak, skualenin kullanımı membran ömrünü uzatan PDMS yavaş çözücü emmesi ile kontrollü bir incelme Çıkış zaman izin. Reklamdakoşul, skualen ve heksadekan bir karışımını kullanarak, lipit çözeltisinin donma noktası süresiz olarak saklanabilir ve kolayca taşınabilir, membran ön üretilmiştir Buna ek olarak, (~ 16 ° C) arttırıldı. Bu zar öncüleri &lt;1 saat BLM oluşumu süresini azalttı ve% 80 ~ bir BLM oluşum oranı elde ettik. Ayrıca, gramicidin A iyon kanal deneyleri membran sisteminin uygulanabilirliğini göstermiştir.

MPES çözelti bileşimi optimizasyonu Lipidlerin ve çözücüler farklı bileşimler başarılı MPE&#39;lerin lipid iki katmanlı membranlar yeniden yapılandırmak için test edilmiştir. DPhPC 14% 3 ihtiva eden n-dekan ve heksadekan karışımıyla MP sistemi zar oluşumu (~% 27), düşük bir başarı oranı göstermiştir. PDMS filmin sürekli lipit çözeltisinin ekstre Buna ek olarak, bir intakt lipid iki katmanlı membran korumak için solven bileşimin duruma gerekliyd...

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Bu prosedürün genel amacı, polidimetilsiloksan ince film kullanılarak otomatik lipid çift tabakası oluşumunun incelenmesinde kullanılabilecek bir yöntemi tanımlamaktır. Bu yöntem, nanobiyosensör alanında membran-protein etkileşimlerine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lipid çift tabakası oluşumunun otomatik ve tekrarlanabilir olmasıdır.Başlamak için; potasyum klorür, tris hidroklorür ve EDTA'yı distile su içerisinde birleştirerek tampon çözeltiyi hazırlayın. Ardından, çözeltinin pH değerini 8.0'e ayarlayın. Daha sonra, çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtre kullanarak süzün ve çözeltiyi 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.Ardından, lipidin %3'ünü, hacimce iki ölçek undecan ve sekiz ölçek hexadecan içeren bir karışımda çözerek ön boyama için lipid çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi bir rotatör kullanarak gece boyunca karıştırın. Ayrıca, lipidin %0,1'ini aynı hacimce iki ölçek undecan ve sekiz ölçek hexadecan karışımında çözerek membran oluşumu için lipid çözeltisini hazırlayın.Bu çözeltiyi bir rotatör üzerinde gece boyunca karıştırın. PDMS ince film hazırlamak için, bir karıştırma kabında dokuz birim prepolimeri bir birim kürleme ajanı ile karıştırın. Bu karışımdan beş gramı bir petri kabına yerleştirin ve 200 ila 250 mikron kalınlığında bir film oluşturmak için kabı 800 rpm hızda 10 saniye boyunca döndürerek kaplayın.Ardından, petri kabını bir vakum desikatörüne yerleştirin ve kalıntı hava kabarcıklarını gidermek için iki saat boyunca 100 millitorr vakum uygulayın. Daha sonra, PDMS'yi polimerize etmek için ince filmi bir fırında 70 °C'de beş saat boyunca pişirin. Soğuduktan sonra, polimerize olmuş ince filmi iki santimetreye iki santimetrelik kareler şeklinde kesin ve karenin merkezinde küçük bir açıklık oluşturmak için 500 mikron çapında bir punch kullanın.Ardından, açıklıkları bir mikrolitre %3 lipid çözeltisi ile ön boyamak için bir mikropipet kullanın. Siyah lipid membran odasını oluşturmak için, 3D çizim yazılımı kullanarak oda için iki simetrik blok tasarlayın. Daha sonra, bir PTFE bloğu ve bir CNC makinesi kullanarak odayı imal edin.Hücreyi kurmak için, önceden boyanmış PDMS ince filmi, PDMS ince film üzerindeki açıklık hücredeki delikle merkezlenecek şekilde iki PTFE blok arasına yerleştirin. Hücrenin dış kenarlarını sızdırmaz hale getirmek için lamel cam ve vakum gresi kullanın. Sızdırmazlık sağlandıktan sonra, kurulmuş olan hücreyi somun ve cıvatalar kullanarak sabitleyin.Sıvı sızıntısı olmadığından emin olmak için odacığın iyi mühürlenmesi önemlidir. Bir pipet kullanarak, odacıkla birlikte monte edilmiş PDMS ince filmin açıklığına 0,5 µL %0,1 lipid çözeltisi damlatın. Ardından, odacığı 10 °C'nin altındaki soğutulmuş bir ortama yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar burada saklayın.Hızlandırılmış kendi kendine montajla siyah lipid membran oluşturmak için, hücreyi buzdolabından çıkarın ve hücrenin her iki yanına iki mililitre tampon çözelti ekleyin. Donmuş membran öncüsü çözünene kadar hücreyi 10 dakika boyunca bekletin. Ardından, ışık kaynağına ve mikroskoba göre yüksekliği hassas bir şekilde kontrol etmek için hücreyi bir mikro manipülatör üzerine yerleştirin.Halojen fiber optik aydınlatıcı kullanarak, PDMS ince filmin açıklığını aydınlatmak için haznenin bir tarafını aydınlatın. Diğer tarafa, açıklıkla aynı hizaya gelecek şekilde 20x objektif yerleştirin ve rengin halkadan daha parlak hale geldiği merkezi gözlemleyin. Elektriksel ölçüm için, 208 µm kalınlığında gümüş teli en az bir dakika boyunca sodyum hipoklorit çözeltisine yerleştirerek gümüş klorür elektrotlar hazırlayın.Ardından, elektrotları bir mikroelektrot amplifikatörüne bağlayın. Daha sonra, gümüş klorür elektrotları, tampon çözeltinin içinde olacak şekilde haznenin her iki yanına yerleştirin. Bir kare dalga elde etmek için elektrofizyoloji yazılımını kullanarak membran boyunca 10 milivoltluk bir üçgen dalga formu uygulayın.Kayıt düğmesine tıklayarak membranın elektriksel özelliklerini kaydedin. Düzenli bir kare dalga gözlemlenene kadar kayda devam edin. Ardından, siyah kare simgesine tıklayarak kaydı durdurun.Gramisidin A'yı lipid çift katmanına dahil etmek için iki yöntem kullanılabilir. Birincisi, lipid çözeltisi PDMS ince filmin açıklığına yayılmadan önce gramisidin A doğrudan lipid çözeltisine eklenebilir. İkincisi, lipid çift katmanı oluştuğunda gramisidin A çözeltisi hazneye eklenebilir.Gramisidin A kanal aktivitelerini gözlemlemek için, membranın tutma potansiyelini ölçmek amacıyla 5 kilohertz örnekleme hızında membran boyunca 100 milivolt uygulayın. Kayıt düğmesine tıklayarak, daha önce yapıldığı gibi elektriksel özellikleri kaydedin. İyon kanalı aktiviteleri görüldükçe, iyon kanalı inklüzyonunu doğrulamak için çeşitli akım sıçramaları gözlemlenene kadar kayda devam edin.Onaylandıktan sonra, siyah kare simgesine tıklayarak kaydı durdurun. Kayıt tamamlandığında, elektrofizyoloji yazılımını kullanarak verileri 100 hertz'lik bir düşük geçişli bessel filtresi ile filtreleyin. Filtrelenmiş tutma potansiyeli verilerindeki akım sıçramalarını gözlemleyin.Bu sıçramalar, bir gramisidin A iyon kanalının dimerleşmesini temsil etmektedir. Dondurulmuş membran öncüsü, çözünmesi için oda sıcaklığına getirildiğinde, hidrofobik çözücünün PDMS ince filme geçmesiyle lipid çift tabaka oluşumu kolaylaşır. Bu görüntü dizisi, dondurulmuş formundan ısıtıldığında kendi kendine düzenlenen bir lipid çift tabakanın oluşumunu göstermektedir.Burada, elektriksel iletkenlik gramisidin A'nın dahil edilmesini ve dimerleşmesini göstermektedir. Dimerleşme üzerine, gramisidin A bir iyon kanalı oluşturur ve iletkenlik seviyeleri, önceki raporların sonuçlarıyla tutarlı olan ve bu antibiyotiğin çift katmana anında dahil olduğunu gösteren 28 picosiemens seviyesine yükselir. Membran oluşturma tekniğimiz, pratik uygulama potansiyelleri sınırlı olan geleneksel tekniklerin aksine, hücre membranı ve nanokanal çalışmaları için güçlü bir araç sunmaktadır. Sistemimiz, ne membran oluşturma ne de iyon kanalı dahil etme işlemi için uzmanlık gerektirmemekte, bu da onu ilaç tarama ve biyosensör uygulamaları için oldukça uygun hale getirmektedir.

automated-lipid-bilayer-membrane-formation-using-polydimethylsiloxane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

Mikroakışkan çift emülsiyon üretimi tipik olarak desenli ıslanabilirliğe veya özel fabrikasyon cam bileşenlere sahip cihazları içerir. Burada, yüzey işlemi veya karmaşık imalat işlemleri gerektirmeyen ve 14 μm'ye kadar çift emülsiyon üretebilen tamamen polidimetilsiloksan (PDMS) çift emülsiyon jeneratörünün imalatını ve testini açıklıyoruz.

Bir Polidimetilsiloksan (PDMS) Koaksiyel Akış Odak Aygıtı Kullanma Çift Emülsiyon Üretimi

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Biz bakır ile lipid bilayer doping tarafından su / hava arayüzü bir hibrid lipid membran üretmek için bir protokol rapor (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthayanilocne (CuPc) molekülleri. Ortaya çıkan hibrid lipid membran lipid/CuPc/lipid sandviç yapısına sahiptir. Bu protokol diğer fonksiyonel nanomalzemelerin oluşumuna da uygulanabilir.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Öğrenin, polidimetilsiloksan ince film kullanarak otomatik lipid çift katman oluşturma yöntemini. Bu teknik, membran-protein etkileşimlerini çalışmak için saatte yüzde 80'den fazla başarı oranı sağlar.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

Daha fazla video keşfet