Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, bir polidimetilsiloksan ince film kullanarak otomatik lipid çift tabaka oluşumunu incelemek için kullanılabilecek bir yöntemi tanımlamaktır. Bu yöntem, nanobiyosensör alanındaki zar-protein etkileşimleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lipid çift tabaka oluşumunun otomatik ve tekrarlanabilir olmasıdır.

Başlamak için, potasyum klorür, tris hidroklorür ve EDTA'yı damıtılmış suda birleştirerek tampon çözeltisini hazırlayın. Ardından, çözeltinin PH'ını 8.0'a ayarlayın. Ardından, çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtre kullanarak süzün ve çözeltiyi 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın.

Daha sonra, lipitin% 3'ünü hacimce iki kısım undekan ve sekiz kısım hekzadekandan oluşan bir karışım içinde çözerek lipit çözeltisini ön boyama için hazırlayın. Bir döndürücü kullanarak çözeltiyi gece boyunca karıştırın. Ayrıca, lipidin %0.1'ini hacimce iki kısım undekan ve sekiz kısım hekzadekan aynı karışımında çözerek zar oluşumu için lipit çözeltisini hazırlayın.

Bu çözeltiyi gece boyunca bir döndürücü üzerinde de karıştırın. Bir PDMS ince film hazırlamak için, dokuz kısım prepolimeri bir kısım kürleme maddesi ile bir karıştırma kabında karıştırın. Bu karışımın beş gramını bir petri kabına koyun ve 200 ila 250 mikron kalınlığında bir film oluşturmak için kabı 800 rpm'de 10 saniye boyunca döndürün.

Ardından, petri kabını bir vakumlu kurutucuya yerleştirin ve kalan hava kabarcıklarını çıkarmak için iki saat boyunca 100 militorr'luk bir vakum çekin. Ardından, PDMS'yi polimerize etmek için ince filmi 70 santigrat derecede beş saat fırında pişirin. Soğuduktan sonra, polimerize ince filmi iki santimetreye iki santimetre kareler halinde kesin ve karenin ortasında küçük bir açıklık oluşturmak için 500 mikron çapında bir zımba kullanın.

Ardından, açıklıkları bir mikrolitre %3'lük lipid çözeltisiyle önceden boyamak için bir mikropipet kullanın. Siyah lipid zar odasını oluşturmak için, 3B çizim yazılımı kullanarak oda için iki simetrik blok tasarlayın. Ardından, bir PTFE bloğu ve bir CNC makinesi kullanarak hazneyi imal edin.

Hazneyi monte etmek için, önceden boyanmış PDMS ince filmi, PDMS ince film üzerindeki açıklık haznedeki delik ile ortalanacak şekilde iki PTFE bloğu arasına yerleştirin. Haznenin dış kenarlarını kapatmak için kapak camı ve vakumlu gres kullanın. Mühürlendikten sonra, monte edilmiş hazneyi somun ve cıvata kullanarak hareketsiz hale getirin.

Sıvı sızıntısı olmaması için haznenin iyi bir şekilde kapatıldığından emin olmak önemlidir. Bir pipet kullanarak, hazne ile birleştirilen PDMS ince filminin açıklığına 0,5 mikrolitrelik %0,1 lipid çözeltisi bırakın. Ardından, hazneyi 10 santigrat derecenin altında soğutulmuş bir ortama yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Hızlandırılmış kendi kendine montaj ile siyah bir lipit zarı oluşturmak için, hazneyi buzdolabından çekin ve haznenin her iki tarafına iki mililitre tampon çözeltisi ekleyin. Donmuş zar öncüsü çözülene kadar hazneyi 10 dakika bir kenara koyun. Ardından, ışık kaynağına ve mikroskoba göre yüksekliği hassas bir şekilde kontrol etmek için odayı bir mikro manipülatör üzerine yerleştirin.

Bir halojen fiber optik aydınlatıcı kullanarak, PDMS ince filmin diyaframını aydınlatmak için odanın bir tarafını aydınlatın. Öte yandan, diyafram açıklığı ile aynı hizaya 20x'lik bir objektif yerleştirin ve rengin halkadan daha parlak hale geldiği merkezi gözlemleyin. Elektriksel ölçüm için, en az bir dakika boyunca bir sodyum hipoklorit çözeltisine 208 mikrometre kalınlığında bir gümüş tel yerleştirerek gümüş klorür elektrotları hazırlayın.

Ardından, elektrotları bir mikroelektrot amplifikatörüne bağlayın. Ardından, gümüş klorür elektrotlarını haznenin her iki tarafına yerleştirin, böylece tampon çözeltisi içinde olurlar. Elektrofizyoloji yazılımını kullanarak, bir kare dalga elde etmek için zar boyunca 10 milivoltluk bir üçgen dalga formu uygulayın.

Kayıt düğmesine tıklayarak membranın elektriksel özelliklerini kaydedin. Düzgün bir kare dalga gözlemlenene kadar kayda devam edin. Ardından, siyah kare simgesine tıklayarak kayıttan çıkın.

Gramicidin A'yı lipid çift tabakasına dahil etmek için iki yöntem kullanılabilir. İlk olarak, gramicidin A, lipid çözeltisini PDMS ince filminin açıklığına yaymadan önce doğrudan lipit çözeltisine eklenebilir. İkincisi, gramicidin Bir lipit çift tabakası oluştuğunda odaya bir çözelti eklenebilir.

Gramicidin A kanalı aktivitelerini gözlemlemek için, zarın tutma potansiyelini ölçmek için 5 kilohertz'lik bir örnekleme hızında zar boyunca 100 milivolt uygulayın. Kayıt düğmesine tıklayarak elektriksel özellikleri daha önce yapıldığı gibi kaydedin. İyon kanalı aktiviteleri gösterildiğinden, iyon kanalının dahil edildiğini doğrulamak için çeşitli akım sıçramaları gözlemlenene kadar kayda devam edin.

Onaylandıktan sonra, siyah kare simgesine tıklayarak kayıttan çıkın. Kayıt bittiğinde, elektrofizyoloji yazılımı kullanarak verileri 100 hertz'de alçak geçiren bir bessel filtresi ile filtreleyin. Filtrelenmiş tutma potansiyeli verilerindeki mevcut sıçramaları gözlemleyin.

Bu sıçramalar, bir gramicidin A iyon kanalının dimerizasyonunu temsil eder. Donmuş membran öncüsü çözülmek üzere oda sıcaklığına getirildiğinde, hidrofobik çözücünün PDMS ince filmine ekstraksiyonu nedeniyle lipid çift tabaka oluşumu kolaylaştırılır. Bu görüntü dizisi, donmuş formundan ısıtıldığında kendi kendine bir araya gelen bir lipit çift tabakasının oluşumunu göstermektedir.

Burada, elektriksel iletkenlik, gramicidin A'nın dahil edilmesini ve dimerizasyonunu göstermektedir.Dimerizasyon üzerine, gramicidin A bir iyon kanalı oluşturur ve iletkenlik seviyeleri 28 picosiemens'e sıçrar, bu da önceki raporların sonuçlarıyla tutarlıdır ve bu antibiyotiğin çift tabakaya hemen dahil edildiğini gösterir. Membran oluşturma tekniğimiz, pratik uygulama için sınırlı potansiyele sahip geleneksel tekniklerin aksine, hücre zarı ve nanokanal çalışmaları için güçlü bir araç sağlar. Sistemimiz ne membran oluşumu ne de iyon kanallama dahil edilmesi için uzmanlık gerektirmez, bu da onu ilaç taraması ve biyo algılama uygulamaları için çok uygun hale getirir.