Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray'ler oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, basit bir hazırlama yöntemi kullanarak biyo membran mikrodizileri oluşturmaktır. Bu, ilk olarak silika boncukların lipid çift katmanlı membranlarla kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, lipit kaplı boncukların silikon mikrokuyu substratı üzerine bırakılmasıdır.

Üçüncü adım, bir polimetil suboksan sileceği kullanarak mikro kuyucuklarda olmayan boncukları çıkarmaktır. Son adım, lipid kaplı boncuk dizilerini floresan mikroskobu ile görüntülemektir. Sonuç olarak, bu yöntem, bir dizi görüntüleme yaklaşımı kullanılarak toksin lipid etkileşimleri için bağlanma sabitlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu yöntem, hücrelerden türetilen küresel destekli lipid çift katmanları ve doğal zar parçacıkları dizileri oluşturmak için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre ana avantajı, mikro kuyuların imalatından ayrı olarak, tekniğin, uzamsal olarak tanımlanmış biyo membran Dizileri oluşturmak için substratın veya lipit zarlarının kimyasal modifikasyonunu gerektirmemesidir. Bu tekniğin uygulamaları, nano metrik metal delik dizilerine dayalı yüzey plazması ve rezonans kullanılarak lipid protein etkileşimlerinin etiketsiz tespitine kadar genişletilebilir.

Bu yöntem, lipid protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, hücresel fokal yapışma çalışmaları, Mikro kuyu dizileri ve silecek preparatları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. metin protokolünde detaylandırılmıştır. Bu video vezikül hazırlığı ile başlar. İlk olarak küçük bir cam şişe karışımında, veziküller için bileşen lipitleri.

Bu çözeltide toplam yarım miligram lipit bulunur, vakum altında karışımı altı saat kurutun. Daha sonra, 0.1 molar bir sodyum klorür çözeltisi hazırlayın ve kurutulmuş lipitlere yarım mililitre ekleyin. Karışımın gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin.

Ertesi gün, vezikülleri askıya almak için karışımı girdaplayın. Daha sonra karışımı bir banyoda 20 dakika boyunca sonikleştirin, oda sıcaklığında sonikat yapın. Sonikasyondan sonra, süspansiyonu 100 nanometre polikarbonat membran filtreden geçirin.

Süspansiyonu ekstrüzyon filtresinden toplam 17 kez geçirin. Daha sonra ekstrüde edilmiş vezikülleri dört santigrat derecede bir cam şişede saklayın. İlk olarak 700 nanometre çapında silikon dioksit boncukları kullanarak.

0.1 molar sodyum klorürde 15 milyar boncukluk bir süspansiyon yapın. Süspansiyonu girdaplayın ve ardından 20 dakika boyunca 1700 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yıkamayı tekrarlamakla tekrarlayın, boncukları başka bir mililitre tuz çözeltisinde süspanse edin ve 20 dakika daha döndürün.

Ardından, küresel destekli lipid çift katmanlarını veya SSB'leri oluşturmak için işlemi üçüncü kez tekrarlayın. 25 mikrolitre silikon dioksit boncuk süspansiyonunu, önceki bölümden 200 mikrolitre vezikül süspansiyonu ile karıştırın. Karışımı vorteksleyin ve bir saat sonra oda sıcaklığında inkübe edin, karışımı 1700 Gs'de 20 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. Pelet, boncuklar üzerinde sıra DPPE ile yırtılmış veziküllere kadar pembedir. PH 7.4'te 225 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Yırtılmamış vezikülleri çıkarmak ve SSB'lerin oluşturulmasını tamamlamak için sıkma ve Resus süspansiyon adımlarını iki kez tekrarlayın. Mikro kuyu dizilerinin gofretlerini, her biri dört ila altı dizi olan dikdörtgen parçalara bölün. Daha sonra, girdap, önceki bölümden SSLB süspansiyonu ve her bir mikro kuyu dizisine 10 mikrolitre aktarın.

SSB'lerin daha sonra yerleşmesi için bir saat bekleyin. Dizi yongalarını PBS ile nazikçe yıkayın ve batık yongaların yüzeyi üzerinde beş kez silecek kaymasını kullanarak diziyi PBS'ye daldırın. Bu, mikro kuyuların içinde olmayan SLP'leri ortadan kaldırır.

Ardından, her bir dizi çipini cımbızla kavrayın ve PBS'yi nazikçe sallayın. Ardından taze bir PBS banyosuna aktarın. Talaşların üst yüzeyleri ıslak kalmalıdır.

Banyodan bir talaş çıkarın ve uzaklaşın. PBS'nin çoğu laboratuvar mendili ile. Diziyi nemli tutmak için yeterli PBS bırakın.

Şimdi spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için diziye 200 mikrolitre BSA çözeltisi ekleyin. Dizinin bir saat kuluçkaya yatmasına izin verin. Daha sonra nemlendirilmiş bir kutuda, BSA'yı bir mikro pipetle çıkarın ve 200 mikrolitre kolera toksin çözeltisi ekleyin.

Ardından diziyi nemlendirilmiş odaya geri koyun. Bir saat daha bekleyin, ardından diziyi PBS ile yıkayın ve fazla PBS'yi bir kucak mendili ile uzaklaştırın. Ardından dizi çipini standart bir mikroskopi slaytına yerleştirin ve diziye 24 x 40 milimetre karelik bir kapak fişi takın ve görüntülemeye devam edin.

Görüntü J.Otomatik partikül analiz fonksiyonları ile görüntü analizi yapılabilir. Ardından, her dizi için, tek tek SSB'lerin ortalama yoğunluklarını histogram olarak özetleyin. Belirtilen yöntemleri kullandıktan sonra, bir dizi üzerindeki 100 mikron karelik bir alan 936 SSB'yi gösterir.

Doluluk verileri hesaplanırken ve bir haftalık depolamadan sonra SSLB floresan yoğunluklarının histogramı oluşturuldu. Aynı dizi aynı şekilde yeniden analiz edildi ve floresan yoğunluklarında veya dizi doluluğunda herhangi bir değişiklik olmadı. Belirtilen yöntemlerle farklı tanımlayıcı belirteçlere sahip farklı SSB'lerin sıralı olarak biriktirilmesi de mümkün olmuştur.

İkinci SSB'ler 10'da bir oranında yatırıldı. Yatırılan ilk SSB'lerin konsantrasyonu. Bir deney için her iki işaretçinin yer paylaşımı gösterilir.

Diziler, çeşitli konsantrasyonlarda GM bir içeren SSB'lerle yapıldı ve sabit bir kolera toksini konsantrasyonuna maruz bırakıldı. Denge ayrışma sabitini belirlemek için ters de yapıldı. GM biri için.

Kolera toksin bağlama dizileri, miyelin parçacıklarından yapılmış bu dizi gibi doğal biyo zarlardan da yapılabilir. Lipofilik floro dört FM 1 43 ile etiketlenmiştir. Lipid salları, kolesterol ve GM gibi gangliositler açısından zenginleştirilmiştir.

Bu nedenle, Alexa 4 88 konjuge kolera toksini, lipid sal mikrodizilerine güçlü bir şekilde bağlanır, aksine, floresan etiketli soyulmuş Aden bu dizilere bağlanmaz. Miyelin ve lipid sallarının 250 mikron kanallı bir mikroakışkan çip aracılığıyla mikro kuyulara iletilmesiyle bir dizi yapıldı. Anti oligodendrosit IgM ile etiketlendi ve miyelinde bulunan S sülfür etiketlendi, ancak lipit salları etiketlenmedi.

Lipit bator kaplı boncuklar hazırlandıktan sonra değil. Bu teknik, doğal zar parçacık dizilerinin oluşturulmasını takiben, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse dizileri bir saat içinde hazırlamak için kullanılabilir. Nano delik yüzeyi, plazma ve rezonans gibi diğer yöntemler, biyomoleküler etkileşimlerin etiketsiz algılanması için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, lipid safra tabakası kaplı boncuklar ve doğal membran parçacıkları kullanılarak biyo membran dizilerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.