Name: Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin, FINA yöntemiyle tam kandan HIV proviral DNA izolasyonunu. Bu kağıt tabanlı hızlı DNA ekstraksiyonu, santrifüj gibi laboratuvar ekipmanı kullanmadan iki dakikadan kısa sürede tamamlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokol geliştirme, Bill ve Melinda Gates Vakfı'nın Küresel Sağlıkta Büyük Zorluklar hibesi 37774 tarafından desteklenmiştir. Gerçek zamanlı PCR reaktifleri ve tavsiyeleri Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL tarafından sağlandı. 8E5-LAV hücreleri, Viroloji Kalite Güvence Laboratuvarı, Rush Presbyterian tarafından sağlandı; St. Luke's Tıp Merkezi. HIV-1 negatif kan, Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL tarafından sağlandı. Fotoğraf yardımı için Mark Fisher'a teşekkürler.

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan tam kan örnekleri insan denekleri araştırma olarak kabul edilmez. örnekler memnun edildi klinik tanı amaçlar için elde edilmiş ve bu örneklerin kalan kısmı FINA araştırma deneyi için sağlanmıştır. Numuneler araştırmacılar kolayca bireylerin kimliğini tespit etmek mümkün değildi böyle kodlanmıştır. FINA Numune Hazırlama Modülü 1. Hazırlık <ol><li> A 2.6 mm 35 x 35 mm 2 kalınlığında% 100 pamuklu ped keserek pedi kurutma hazırlayın. örnek başına bir tane yastığı kesin. </li><li> ve daha sonra bir çekiç tahrik delik yumruk kullanarak bant merkezinde 7.14 mm çapında bir delik delme (50 (w) mm 25 mm (h)) parafin film kesme parça kağıt bant ile plastik parafin filmi hazırlayın. örnek başına bir bant hazırlayın. </li><li> Bir 8.35 mm çaplı daire delme bir bağlı cam kan ayırıcı membran (zar yakalama) diski hazırlayınBir çekiç tahrik delik kullanarak. örnek başına bir diski yumruk. Disk 2.3 um olan bir partikül tutma yeteneğine sahiptir. </li><li> forseps kullanarak lekeleme pad merkezinde yakalama diski koyarak FINA örnek hazırlama modülü monte edin. parafin bant delik maruz yakalama diskin merkezine bırakır, böylece yakalama disk üzerinde parafin filmi bandı yerleştirin. </li><li> lekeleme pedi kapsayacak şekilde hafifçe parafin bant germe ve diskin tüm kenarlarda blot pad sopa sıkıca parafin bant basarak disk ve lekeleme ped arasındaki maksimum temas sağlamak. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar modülleri yapın. </li></ol> qPCR Tube 2. Hazırlık <ol><li> çift ​​kaplamalı Polye bir daire delme ile floresan algılama engelleme zarın önlemek için qPCR tüpün yanına hücre yakalama zarını demir atacak 5.1 mm&#39;lik bant diski hazırlayınbant sacdan bir çekiç tahrik yumrukla teşhis bant kayit yaptirilabilir. örnek başına bir bant diski hazırlayın. </li><li> Bandın etiket astarın bir tarafını kaldırın. bir yüzüne ve tüpün dibine doğru yapışmasını 200 ul PCR tüp içine bandı yerleştirin. İkinci etiket kaplamasını çıkartın. Tüp şimdi hazırlanmış diski almaya hazırdır. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar tüpleri üretin. </li></ol> 3. contrive Kan Numune Not: gerçek bir test numunesi hazırlanmaktadır ediliyorsa, 4. adıma geçin. <ol><li> Viroloji Laboratuvarı Kalite Güvence elde edilen HIV-1 Provirüsün tek bir kopyasını barındıran Çözülme 8E5-LAV hücreleri 15 (MYK; Rush Presbyterian / St Luke Tıp Merkezi, Chicago, IL.). Not: / ml 4000 hücre konsantrasyonunda dondurulmuş hücre peletleri olarak depolanır. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 hücre sayısı kontrol edildi. </li><li> ser hazırlayın/ Ul 1 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlara ortamı (% 90 fetal sığır serumu,% 10 dimetil sülfoksit) donma ial dilüsyon. </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine seri sulandırmaların her birinin arasında pipetleyin 10 ul hücre. 8E5-LAV kopya sayılarının 10-4,000 bir standart eğri oluşturmak için her bir tüpe, taze, HIV-1 negatif EDTA tedavi tam kan örneği 100 ul ekle. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. </li></ol> 4. FINA Ekstraksiyon gerçekleştirin <ol><li> 110 ul tam kan ve aşama 3,3 hücreler)% 1 (11 ul,% 10 Triton-X100 içinde bir son konsantrasyona kadar Triton-X100) eklenerek lize kan hücreleri. </li><li> yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. Kan saydam kırmızı renkte olmalıdır. </li><li> Pipetleyin yakalama diske kan örneğinin tüm. Not: parafin bant ve yakalama membranı arasında bir su geçirmez mühür kan zarından akan sağlar ve yakalama m arasında iyi temaszarı böylesine ve kurutma ped montaj hızlı numune fitilleme sağlar. </li><li> Örnek filtresinden bekletin. Not: kılcal eylemi lekeleme pedine kan lizatı fitilleri, yakalama diskin yüzeyi üzerinde genomik DNA yakalama. o mat göründüğünde lizat disk içine batırılmış gelmiştir. </li><li> yakalama diske 600-1,000 ul 10 mM NaOH damla damla ekleyin. Not: Yıkama tamponu, 600 ul bir hacim ilave olarak eklenebilir. tampon hidrofobik parafin kasete bir damlacık oluşturur ve yaklaşık 20 saniye içinde diske delikten fitil olacak. Filtre hemoglobin beyaz belirten temizlenmesi için kırmızı değişecektir. </li><li> forseps ile lekeleme pedi disketi ayırın ve hazırlanan PCR tüpünde bant diski uygulayın. Filtre üzerinde kalan herhangi bir kırmızı varsa tüp içinde yerleştirmeden önce filtreyi temizlemek için yıkama tamponu 50-100 ul ekleyin. Not: Nadiren, aşırı basınç hazırlanmasında kullanılanlekeleme pad ayrılma sırasında zar katmanlarının bölümleme FINA modülleri sonuçları. Bu diskleri atın ve taze bir örnek hazırlamak. </li><li> Filtre PCR tüpünde yerleştirildikten sonra, hemen numuneleri analiz. Alternatif olarak, bir kutu içeren kalsiyum sülfat kurutucu kuru bir gecede, daha sonra analiz için hazır olana kadar silis kurutucu ve mağaza ile bir folyo kese içinde kap ve yer. </li></ol> 5. qPCR Reaksiyon <ol><li> Daha önce 9,11 açıklandığı gibi HIV spesifik primer ve problar kullanılarak reaksiyon başına 100 ul qPCR master karışımı hazırlayın. Bir iç amplifikasyon kontrolü amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı izlemek için ve negatif örnek bir gerçek negatif olduğunu doğrulamak için ekleyin. Filtre tamamen ana karışımı ile ve filtre reaksiyon boyunca tüpün yanına sabitlenmiş kalmasını kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Daha önce 9 tarif edilen bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+Machine%22+for+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world%3B+an+example+of+microfluidic+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li>
<li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+molecular+diagnostic+for%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li>
<li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+RNA+Extraction%2C+in+Situ+Isothermal+Amplification%2C+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost%2C+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+%28H1N1%29+from+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li>
<li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+%28STIs%29%3A+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li>
<li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li>
<li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li>
<li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).</li>
<li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-PCR+processing%3A+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).</li>
<li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hızlı tedavi erişimine bağlı EID nedeniyle HIV enfeksiyonuna 16 bebek ölümlerini azaltmak için ortaya konmuştur. Çünkü bir bebeğin kanında anne antikorların kalıcılığı, hızlı HIV antikor testleri, HIV-maruz kalan bebeklerin durumunu belirlemede yarar sınırlıdır. DSÖ, HIV-1 pozitif annelerden doğan tüm bebeklerin bir virolojik testi 17 kullanılarak, yaş 4-6 hafta test edilmelidir önerir. Biz 61 Güney Afrikalı bebekler 11 küçük alan değerlendirmesinde göstermiştir% 100 duyarlılık ve özgüll...

Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları 1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test 6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji 7 adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır. Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını 8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların 12 varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon 9 kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi 13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları. FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi 11 tarafından serbest ya hücrelerinin 9 ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu 11 kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık. Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 kurutma pedi</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Çift Taraflı Polyester Teşhis Bandı&nbsp;</td><td>3M Tıbbi Uzmanlık Alanları</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l qPCR şerit tüpleri</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>optik şerit kapakları</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR Sistemi</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>ACS Reaktifi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu, sertifikalı, ABD menşeli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Çekiç tahrikli küçük delgeç 3/16" delik çapı (5.1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Çekiç tahrikli küçük delgeç 1/4" delik çapı (7.14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Çekiç tahrikli küçük delgeç 5/16" delik çapı (8.35 mm)</td> <td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

nükleik asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı dna izolasyonu,

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu, en az 2 dakika içinde tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı emici ped vasıtasıyla dikey filtrasyon kullanan yeni bir ekstraksiyon yöntemi. Kan numunesi deterjan, kısa bir süre karıştırıldı ile muamele edilmiş ve ayırma membranı şekilde kamış ile uygulanır. Lizat ayırma membranı yüzeyinde genomik DNA yakalama, kılcal eylemi lekeleme pedine fitilleri. Ekstre edilen DNA, PCR inhibitörleri, emici lekeleme pedine kötü burada basit bir yıkama aşaması sırasında zar üzerinde muhafaza edilir. yakalanmış DNA içeren zar daha sonra daha fazla arıtılmadan PCR reaksiyonuna ilave edildi. Bu basit yöntem laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen ve kolayca ucuz laboratuar malzemeleri ile uygulanabilir. Burada erken için bir model olarak, 100 ul tam kandan, HIV-1 proviral DNA&#39;nın son derece hassas algılama ve miktar tayini için bir protokol açıklarkolayca diğer genetik hedeflere adapte olabilir HIV fant tanı.

8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kandan proviral DNA çıkarmak için iş akışı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 2 FINA örnek modülü göstermektedir qPCR tüp hazırlanır Şekil. Zoraki örnekleri (Şekil 3) standart eğride gösterildiği gibi bu yöntem, farklı kopya numaraları de 8E5-LAV hücrelerinden, HIV-1 provirüs verimli amplifikasyonu için izin verir. PCR Verimliliği = -1 + 10 (-1 / eğim) hesaplanan,% 103 bir etkinl...

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Nükleik asitlerin filtrasyon yoluyla izolesi anlamına gelen FINA yönteminin genel amacı, kompleks numunelerden PCR amplifikasyonu için gerekli olan genomik DNA'yı, santrifüj gibi laboratuvar cihazlarına ihtiyaç duymadan, hızlı ve basit bir şekilde izole etmektir. HIV proviral DNA için geliştirilen bu hızlı kağıt tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemi, kantitatif bir PCR tanı cihazına entegre edilmek üzere geliştirilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, numune hazırlama modüllerinin ve PCR tüplerinin önceden hazırlanabilmesi sayesinde DNA ekstraksiyonunun iki dakikadan kısa sürdüğüdür.Bu yöntemi ilk olarak, topuktan alınan kanda HIV-1 için erken bebek tanı testine dahil edilmek üzere geliştirdik. Genel olarak, bu yöntemi yeni kullanan kişiler, hücre yakalama membranını PCR tüpünün kenarına sabitleyen çift taraflı bandın koruyucu yüzeyini çıkarma işlemi pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Prosedürü, laboratuvarımdan kıdemli bir teknisyen olan Jen Reed uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre, FINA numune hazırlama modülünün kurulumu için gerekli malzemeleri hazırlayarak başlayın. 2,6 mm kalınlığında %100 pamuklu pedden 35 by 35 milimetrelik bir kare keserek blot pedini hazırla

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Kaynak: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, klik kimyası ve manyetik boncuk saflaştırması kullanarak hücre çekirdeklerinden protein-viral DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Protokol; viral genomların alkin-modifiyeli nükleotidlerle işaretlenmesini, bir klik reaksiyonu aracılığıyla biyotinilasyonu ve streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanmayı içerir. Yıkama ve ısı...

Viral DNA-Protein Komplekslerinden Proteinlerin İzolasyonu

Daha fazla analiz için çeşitli bileşenler elde etmek üzere tam kanın işlenmesi için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Klinik olmayan bir ortamda tam kan örneklerinin hızlı, yüksek verimli eş zamanlı işlenmesini sağlayan kolaylaştırılmış bir protokolü optimize ettik.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Bu protokol, plazmid DNA çıkarımını hızlandırmak için maliyet etkin bir yöntem tanımlar. Standart sallanan kovalı plaka rotorlarıyla uyumlu özel 3D baskılı raflar kullanılarak, araştırmacılar aynı anda 48 döner kolonunu kapaklı veya 116 döner kolonunu kapaksız işleyebilir; bu da manuel mikrosantrifüj yöntemlerine kıyasla kullanım süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.

24 kuyu rafları kullanarak orta verimlilikli kolon DNA çıkarımı

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Bu iletişim, doğruluk ve tekrarlanabilirlik dsDNA ve protein kantitatif BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometre veri sunmaktadır. Ultra-küçük birimler bile otomatik silme fonksiyonu, hacmi ve daha kesin sonuçlar için en az taşınmasını sonuçları artırıyor (1 ila 2 L), tekrarlanabilirlik, mükemmel.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Öğrenin, FINA yöntemiyle tam kandan HIV proviral DNA izolasyonunu. Bu kağıt tabanlı hızlı DNA ekstraksiyonu, santrifüj gibi laboratuvar ekipmanı kullanmadan iki dakikadan kısa sürede tamamlanır.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Daha fazla video keşfet