Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu anlamına gelen bu FINA yönteminin genel amacı, santrifüj gibi laboratuvar enstrümantasyonu kullanılmadan karmaşık örneklerden PCR amplifikasyonu için genomik DNA'yı hızlı ve basit bir şekilde izole etmektir. HIV pro viral DNA için bu hızlı kağıt tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemi, kantitatif bir PCR tanı cihazına dahil edilmek üzere geliştirilmiştir. Bu tekniğin ana avantajı, numune hazırlama modüllerinin ve PCR tüplerinin önceden hazırlanabilmesi ve böylece DNA ekstraksiyonunun iki dakikadan az sürmesidir.

Bu yöntemi ilk olarak, topuk kanından HIV-1 için erken bebek tanı testini yanıtlamak için bir örneğe dahil edilmek üzere geliştirdik. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, hücre yakalama zarını PCR tüpünün yanına tutan çift taraflı bandın arkasını çıkarmak pratik gerektirdiğinden mücadele edebilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan kıdemli bir teknisyen olan Jen Reed olacak.

FINA numune hazırlama modülünün montajı için gerekli malzemeleri hazırlayarak bu prosedüre başlayın. 2,6 milimetre kalınlığında% 100 pamuklu bir pedin 35 x 35 milimetre karesini keserek kurutma pedini hazırlayın. Bir kağıt destek bandı ile plastik parafin filmi hazırlayın.

25 x 50 mm'lik bir parafin film parçası kesin ve ardından bandın ortasına 7,14 mm çapında bir delik açmak için bir çekiç kullanın. 8,35 mm çapında bir daireyi delmek için bir çekiç kullanarak bağlı bir cam kan ayırıcı membran veya yakalama diski hazırlayın. FINA numune hazırlama modülünü monte etmek için, yakalama diskini lekeleme pedinin ortasına yerleştirmek için forseps kullanın.

Parafin film bandının arkasını çıkarın ve parafin bandının tamamı yakalama diskinin merkezini açıkta bırakacak şekilde yakalama diskinin üzerine yerleştirin. Kurutma pedini kaplamak için parafin bandını hafifçe gererek ve parafin bandını diskin tüm kenarlarından kurutma pedine yapıştırmak için sıkıca bastırarak disk ile kurutma pedi arasında maksimum teması sağlayın. Membranın gerçek zamanlı PCR cihazının floresan algılamasını engellemesini önlemek için yakalama membranını qPCR tüpünün yan tarafına sabitlemek için 5.1 mm'lik bir bant diski gereklidir.

Bu bant diskini, bir bant tabakasından çift taraflı polyester teşhis bandından bir daire delmek için bir çekiç kullanarak hazırlayın. Forseps kullanarak bant etiket astarının bir tarafını çıkarın. Bandı 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne yerleştirin, bir tarafa ve tüpün altına doğru yapıştırın.

İkinci çıkartma astarını çıkarın. Tüp artık hazırlanan diski almaya hazırdır. 8e5 LAV hücreleri ile çivilenmiş tam kandan proviral DNA'nın tespiti bu videoda gösterilecektir.

Önceden donmuş 8e5 LAV hücre peletlerini buz üzerinde çözün. Hücrelerin dondurucu ortamda, mikrolitre başına 1 ila 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlarda seri bir seyreltmesini hazırlayın. Seyreltmelerin her birinden 10 mikrolitre hücreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin.

Standart bir eğri oluşturmak için her tüpe 100 mikrolitre taze HIV-1 negatif eDTA ile muamele edilmiş tam kan örneği ekleyin. Tüpün altını beş kez hafifçe vurarak karıştırın. DNA ekstraksiyon prosedürüne başlamak için, yüzde birlik bir nihai konsantrasyona triton X-100 ekleyerek kan hücrelerini parçalayın.

Tüpün altını beş kez hafifçe vurarak karıştırın. Kan yarı saydam bir kırmızıya dönmelidir. Kan örneğinin tamamını yakalama diskine pipetleyin.

Parafin bandı ile yakalama zarı arasındaki su geçirmez bir conta, kanın zardan akmasını sağlar. Temas membranı ile kurutma pedi tertibatı arasındaki iyi temas, numunenin hızlı bir şekilde emilmesini sağlar. Numunenin filtreden geçmesine izin verin.

Kan lizatı yakalama diskine batırılmıştır ve disk mat görünür. Yakalama diskine damla damla 600 ila 1.000 mikrolitre 10 mmol sodyum hidroksit ekleyin. Filtre kırmızıdan beyaza dönerek hemoglobinin temizlendiğini gösterir.

Daha sonra diski kurutma pedinden ayırın ve diski hazırlanan PCR tüpündeki banda uygulayın. Filtre PCR tüpüne yerleştirildikten sonra numuneyi hemen analiz edin. qPCR ana karışımını protokol metninde açıklandığı gibi hazırlayın ve filtrenin ana karışımla tamamen kaplandığından ve reaksiyon boyunca tüpün yan tarafına sabit kaldığından emin olun.

Protokol metninde açıklandığı gibi gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanarak amplifikasyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, qPCR hemen gerçekleştirilemezse, filtreyi gece boyunca kalsiyum sülfat kurutucu içeren bir kutuda kurutun. Ertesi gün, PCR tüpünü kapatın ve silika kurutuculu folyolu bir poşete koyun ve analize hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.

Bu yöntem, HIV-1 provirüsünün farklı kopya sayılarında 8e5 LAV hücrelerinden verimli bir şekilde amplifikasyonuna izin verir. Düz çizgiler, dahili kontrolün reaksiyonu başına 500 kopya ile 4.000, 400, 40 ve 10 8e5 LAV hücresi ile çivilenmiş dört HIV-1 negatif tam kan kopyasından elde edilen amplifikasyon grafikleridir. Noktalı çizgi eşiği gösterir.

Bu sonraki grafik, 100 mikrolitre tam kan başına 8e5 LAV hücresinin amplifikasyon grafiği vs. log kopya sayısından hesaplanan kantitasyon döngüsü değerlerinin standart eğrilerini göstermektedir. Hesaplanan PCR verimliliği %103 idi. HIV proviral DNA standart eğrisi replikaları ayrıca yüksek oranda tekrarlanabilir amplifikasyona sahiptir.

Ek olarak, 500 kopya hidroksi piruvat redüktaz dahili kontrolünün varlığı, mevcut HIV-1 provirüsünün kopya sayısından bağımsız olarak, bu yöntemle kan alınmasından kaynaklanan herhangi bir PCR inhibisyonu olmadığını göstermektedir. Düz çizgiler amplifikasyon grafiklerini temsil eder ve noktalı çizgi eşiği temsil eder. Bu prosedürü takiben, ilgilendiğiniz geni tespit etmek için PCR hedefleri çeşitli numune türlerinden amplifiye edilebilir.

Örneğin, farmakogenetik tarama için yanak sürüntüleri veya hayvan modellerinin hızlı genotiplemesi için kan. Kan yoluyla bulaşan patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman evrensel önlemler alınması gerektiğini unutmayın.