Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Nükleik asitlerin filtrasyon yoluyla izolesi anlamına gelen FINA yönteminin genel amacı, kompleks numunelerden PCR amplifikasyonu için gerekli olan genomik DNA'yı, santrifüj gibi laboratuvar cihazlarına ihtiyaç duymadan, hızlı ve basit bir şekilde izole etmektir. HIV proviral DNA için geliştirilen bu hızlı kağıt tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemi, kantitatif bir PCR tanı cihazına entegre edilmek üzere geliştirilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, numune hazırlama modüllerinin ve PCR tüplerinin önceden hazırlanabilmesi sayesinde DNA ekstraksiyonunun iki dakikadan kısa sürdüğüdür.

Bu yöntemi ilk olarak, topuktan alınan kanda HIV-1 için erken bebek tanı testine dahil edilmek üzere geliştirdik. Genel olarak, bu yöntemi yeni kullanan kişiler, hücre yakalama membranını PCR tüpünün kenarına sabitleyen çift taraflı bandın koruyucu yüzeyini çıkarma işlemi pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Prosedürü, laboratuvarımdan kıdemli bir teknisyen olan Jen Reed uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre, FINA numune hazırlama modülünün kurulumu için gerekli malzemeleri hazırlayarak başlayın. 2,6 mm kalınlığında %100 pamuklu pedden 35 by 35 milimetrelik bir kare keserek blot pedini hazırlayın. Kağıt destekli bant ile plastik parafin film hazırlayın.

25 x 50 mm boyutunda bir parafin film parçası kesin ve ardından bir çekiç kullanarak bandın merkezine 7,14 mm çapında bir delik açın. Bir çekiç yardımıyla 8,35 mm çapında bir daire keserek bağlı bir cam kan ayırıcı membran veya yakalama diski hazırlayın. FINA numune hazırlama modülünü monte etmek için, pensle yakalama diskini blotting pedinin merkezine yerleştirin.

Parafin film bandının koruyucu tabakasını çıkarın ve parafin bandının tamamı yakalama diskini merkezden açıkta bırakacak şekilde bandı yakalama diskinin üzerine yerleştirin. Parafin bandını, blotting pedini kaplayacak şekilde hafifçe gererek ve diskin tüm kenarlarından blotting pedine sıkıca bastırarak yapıştırarak, disk ile blotting pedi arasında maksimum temas sağladığınızdan emin olun. Membranın, gerçek zamanlı PCR cihazının floresans tespitini engellemesini önlemek için yakalama membranını qPCR tüpünün yan tarafına sabitlemek amacıyla 5,1 mm'lik bir bant diski gereklidir.

Bir çekiç kullanarak, çift kaplı polyester diyagnostik bant tabakasından daire şeklinde bir bant parçası çıkararak bu bant diskini hazırlayın. Penset yardımıyla bant etiket astarının bir tarafını çıkarın. Bandı 200 µL'lik bir PCR tüpüne yerleştirerek tüpün bir kenarına ve tabanına doğru yapıştırın.

İkinci yapışkan koruyucuyu çıkarın. Tüp artık hazırlanan diski almaya hazırdır. Bu videoda, 8e5 LAV hücresi eklenmiş tam kandan proviral DNA'nın tespiti gösterilecektir.

Daha önceden dondurulmuş 8e5 LAV hücre peletlerini buz üzerinde çözdürün. Dondurma ortamında, mikrolitre başına 1 ile 400 hücre arasında konsantrasyonlara sahip hücrelerin seri dilüsyonunu hazırlayın. Her bir dilüsyondan 10 µL hücreyi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin.

Standart bir eğri oluşturmak için her tüpe 100 µL taze HIV-1 negatif eDTA işlem görmüş tam kan örneği ekleyin. Tüpün altına beş kez hafifçe vurarak karıştırın. DNA ekstraksiyon prosedürüne başlamak için, son konsantrasyonu %1 olacak şekilde triton X-100 ekleyerek kan hücrelerini lizleyin.

Tüpün altına beş kez hafifçe vurarak karıştırın. Kan, yarı saydam bir kırmızıya dönmelidir. Kan örneğinin tamamını yakalama diskine pipetleyin.

Parafin bant ile yakalama membranı arasında su sızdırmaz bir mühür oluşturulması, kanın membran üzerinden akmasını sağlar. Kontak membran ile blotlama pedi düzeneği arasındaki iyi temas ise numunenin hızlıca emilmesini sağlar. Numunenin filtre boyunca emilmesine izin verin.

Kan lizatı yakalama diskine emilmiş ve disk mat görünmektedir. Yakalama diskinin üzerine damla damla 600 ila 1.000 µL 10 mmol sodyum hidroksit ekleyin. Hemoglobinin temizlendiğini göstererek filtrenin rengi kırmızıdan beyaza dönecektir.

Ardından, diski blotlama pedinden ayırın ve diski, hazırlanmış PCR tüpündeki bandın üzerine uygulayın. Filtre PCR tüpüne yerleştirildikten sonra örneği hemen analiz edin. qPCR master mix'ini protokol metninde açıklandığı şekilde hazırlayın; filtrenin master mix ile tamamen kaplandığından ve reaksiyon boyunca tüpün kenarına sabitlendiğinden emin olun.

Protokol metninde açıklandığı şekilde, gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanarak amplifikasyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, qPCR hemen yapılamıyorsa, filtreyi kalsiyum sülfat kurutucu içeren bir kutuda gece boyunca kurutun. Ertesi gün, PCR tüpünü kapatın ve silika kurutucu içeren folyolu bir poşete yerleştirip analiz aşamasına kadar oda sıcaklığında saklayın.

Bu yöntem, farklı kopya sayılarındaki 8e5 LAV hücrelerinden HIV-1 provirüsünün verimli bir şekilde amplifikasyonuna olanak tanır. Düz çizgiler, reaksiyon başına 500 kopya iç kontrol ile desteklenmiş ve 4.000, 400, 40 ve 10 8e5 LAV hücresi eklenmiş HIV-1 negatif tam kandan elde edilen dört tekrarlı amplifikasyon grafikleridir. Kesikli çizgi eşik değerini belirtmektedir.

Sıradaki grafik, 100 mikrolitre tam kanda 8e5 LAV hücrenin log kopya sayısına karşı amplifikasyon grafiğinden hesaplanan kantifikasyon döngü değerlerinin standart eğrilerini göstermektedir. Hesaplanan PCR verimliliği %103'tür. HIV proviral DNA standart eğrisi tekrarları da yüksek düzeyde tekrarlanabilir amplifikasyon göstermektedir.

Ek olarak, 500 kopya hidroksi piruvat redüktaz içeren bir iç kontrolün varlığı, mevcut HIV-1 provirüs kopya sayısından bağımsız olarak, kanın bu yöntemle ekstrakte edilmesinden kaynaklanan bir PCR inhibisyonu olmadığını göstermektedir. Düz çizgiler amplifikasyon grafiklerini, noktalı çizgi ise eşik değerini temsil etmektedir. Bu prosedür takip edilerek, hedef geninizi tespit etmek amacıyla çeşitli numune türlerinden PCR hedefleri amplifiye edilebilir.

Örneğin, farmakogenetik tarama için yanak sürüntüleri veya hayvan modellerinin hızlı genotiplendirmesi için kan kullanılabilir. Kan yoluyla bulaşan patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman evrensel önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.