Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama
April 29th, 2017
Bu makale, kütle sitometrisi analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır.
Bu numune hazırlama işleminin genel amacı, heterojen hücre popülasyonlarının sorgulanmasını sağlamak için çeşitli numunelerin sağlam ve tutarlı bir antikor boyamasını üretmektir. Bu yöntem, karmaşık bir heterojen hücre popülasyonunda hücre kimliği, hücre sinyalizasyonu ve hücre tepkisi ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücre düzeyinde yüksek parametreli protein seviyelerinin ölçülmesine izin vermesidir.
Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Aundrietta Duncan olacaktır. Her bir tek hücre süspansiyon numunesi için, serum içermeyen ortamda mililitre başına dört kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin, altı hücreye 2/10'da 500 mikrolitre taze hazırlanmış 50 MicroMolar Sisplatin ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında sabit karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bir dakika sonra, Sisplatin'i eşit hacimde yıkama tamponu ile söndürün ve hücreleri santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek, hücreleri santrifüjleyerek ve yıkama tamponunu dökerek numuneleri iki kez daha yıkayın. Bunu, 500 mikrolitre PBS'de iki yıkama ile takip edin, benzer şekilde numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. İkinci PBS yıkamasından sonra, peletleri 500 mikrolitre taze PBS'de tekrar süspanse edin ve hücreleri 500 mikrolitre% 4 PFA ile sabitleyin.
Karıştırmak için hücreleri pipetleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sürekli karıştırarak orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı dökün ve bunu taze PBS'de yıkayın.
Hücrelere nüfuz etmek için, hücreleri tekrar döndürün ve süpernatanları atın. Nazikçe girdaplama ile kalan PBS'deki numuneleri yeniden süspanse edin ve hemen nazikçe pipetleme ile altıncı hücrelere 2/10 10'da bir mililitre %100 metanol ekleyin. Numuneleri en az bir saat boyunca dört derecede inkübe edin ve inkübasyonun sonunda hücreleri santrifüjleyin.
Daha sonra metanolü boşaltın. Daha sonra peletleri her mililitre metanol için bir mililitre yıkama tamponunda yıkayın, ardından 500 mikrolitre taze yıkama tamponunda iki yıkama daha yapın. 50 mikrolitreye ayarlanmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her peletten kalan yıkama tamponunu uygun karşılık gelen antikor kokteylinin bir tüpüne aktarın.
Pistonu kısmen basılı tutarak uca hava çekmeden birleşik çözeltiyi pipetleyin. Ardından pipet ucunu, pistonu serbest bırakmadan 500 mikrolitre yıkama tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Toplam 50 mikrolitrelik bir antikor kokteyli hacmi için yıkama tamponunu çekerek pistonu serbest bırakın ve uygun karşılık gelen numuneyi nazikçe pipetleme ile aspire edilmiş antikor kokteyli ile etiketleyin.
Sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat sonra, numuneleri dört kez yıkayın ve her seferinde yıkama tamponunu dökün. Hücreleri iridyum ile etiketlemek için, son peletleri 500 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 500 mikrolitre yüzde dört PFA ekleyin. Daha sonra, 500 mikrolitre taze hazırlanmış 62.5 nanomolar iridyum ve PFA'yı 15 dakika daha oda sıcaklığında çalkalamak için numunelere ekleyin.
Daha sonra hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı dökün ve ardından 500 mikrolitre yüzde 0.1 BSA ve filtrelenmiş deiyonize suda iki yıkama yapın. Numune plakalarının kuyucuklarına normalizasyon boncukları ekleyerek, hücreleri bu kuyucuklara pipetleyerek ve ardından 24 saat içinde kütle sitometrisi gerçekleştirerek numuneleri analiz edin. Sinyal yoğunluğunun normalleştirilmesini takiben, kalibrasyon boncukları, iridyum 191 pozitif boncuk negatif popülasyonu üzerinde geçit yapılarak verilerden çıkarılabilir.
Tek hücre olayları daha sonra, olay uzunluğuna karşı iridyum 193 negatif ifadesinin çift eksenli bir grafiği kullanılarak kalıntıları ve hücre çoklarını çıkarmak için kapılanabilir. Sisplatin etiketleme, hücre derinliği miktarını ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, burada düşük ve daha yüksek miktarlarda ölü hücre içeren örnekler gösterilmektedir.
Ölü hücreler, platin 198 pozitif popülasyonun kapısını açarak çıkarılabilir, barkodlama, numunelerin barkodlama parametreleri içinde belirgin bir şekilde ayrılmasına neden olur ve hücrelerin orijinal numune kimliklerine atanmasına izin verir. IDU etiketlemesi, burada gözlemlenen ABD yüz hücrelerini tespit etmek için kullanılabilir. İlk normalleştirme, barkodlama ve geçitlemenin ardından, yüksek boyutlu veriler, verilerin görsel yorumlamaya daha uygun olan daha düşük boyutlu bir temsilini oluşturmak için SPADE algoritması kullanılarak analiz edilebilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört ila altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yıkama adımını yaparken numune kaybını en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kütle sitometrisi analizi için numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Sodyum azid ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken uygun KKD giymek gibi önlemler almalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kütle sitometre analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklar. Yöntem, heterojen hücre popülasyonlarını incelemek için tutarlı antikor boyaması üremeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kütle Sitometresi
Arka Plan
- Kütle sitometresi, tek hücre düzeyinde yüksek parametreli protein seviyelerinin ölçülmesine izin verir.
- Hücre kimliğini ve sinyalizasyonunu anlamak için yararlıdır.
- Teknik karmaşık heterojen hücre popülasyonlarına uygulanabilir.
- Örnek hazırlanması, sağlam sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kütle sitometresi için bir örnek hazırlama sürecini göstermek.
- Çeşitli hücre popülasyonlarının sorgulanmasını sağlamak.
- Hücre tepkileri ve etkileşimleri hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tek hücre süspansiyon örneklerinin serum içermeyen ortamda yeniden süspanse edilmesi.
- Hücre işlemi için taze hazırlanmış Cisplatin kullanımı.
- Tutarlı karıştırma için bir yörünge şekerleyici üzerinde inkübasyon.
- İşlem sonrası hücrelerin santrifüjlenmesi ve yıkanması.
Ana Sonuçlar
- Etkili örnek hazırlama tekniğinin gösterilmesi.
- Örnekler arasında tutarlı antikor boyaması elde edilmesi.
- Tek hücre düzeyinde yüksek parametreli analizin kolaylaştırılması.
- Heterojen hücre popülasyonları hakkında bilgilerin elde edilmesi.
Sonuçlar
- Yöntem, karmaşık hücre popülasyonlarını analiz etme yetisini artırır.
- Doğru kütle sitometresi sonuçları için sağlam örnek hazırlaması kritik öneme sahiptir.
- Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarını ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
