Name: Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Öğrenin, kitle sitometrisi ile periferik tam kan örneklerinde tek hücreli immünofenotip ve sitokin üretimini analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım, otoimmün hastalıklardaki immün düzenlenme bozukluklarını değerlendirmek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aimee Pugh-Bernard onun fikri girdi ve yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Boettcher Vakfı Webb Waring Biyomedikal Araştırma Ödülü ve Ödülü K23-1K23AR070897 arasında sayı NIH Elena W.Y. Hsieh tarafından desteklenmiştir. O da ödül sayısı çocuk sağlığı ve insan gelişimi ve Lucile Packard Vakfı tarafından K12-HD000850 Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı, Stanford CTSA UL1 TR001085 ve çocuk sağlığı araştırma için destekli yapıldı. Enstitüsü Stanford Üniversitesi.

Tüm yöntem tanımlamak burada Colorado birden çok kurumsal İnceleme Kurulu (COMIRB tarafından), Colorado Üniversitesi onaylanmış olması. Aşağıdaki tüm açıklanan yordamlar steril doku kültürü mahallede, filtre uygulanmış pipet ipuçları ile belirtilmedikten gerçekleştirilmesi gereken ve tüm reaktifler filtre.
1. hazırlanması reaktifler periferik tam kan işleme için
<ol><li>Ruxolitinib hisse senedi aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 10 mM üretici yönergelerine (mağaza-80 ° c) göre DMSO içinde reaktif lyophilized sulandrarak hazırlayın. DMSO konsantrasyonu % 0,2 (vol/vol) aşağıda unstimulated denetimleri de dahil olmak üzere tüm deneyleri unutmayın.</li>
	<li>R848 hazırlamak (resiquimod) stok aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 1 μg/μL steril su lyophilized reaktif sulandrarak tarafından üretici yönergelerine başına. Mağaza-80 ° C'de</li>
	<li>Lipopolysaccharide (LPS) hisse senedi aliquots (sadece bir süre için şişe başına 5 μL) 1 μg/μL, steril su üretici talimatları uyarınca lyophilized reaktif sulandrarak hazırlayın. Mağaza-80 ° C'de</li>
	<li>PBS, % 0.5 BSA ve %0.02 NaN3kullanarak hücre boyama medya (CSM) hazırlayın.</li>
	<li>Alacak ve protein taşıma inhibitörü (PTI) kokteyl (Tablo reçetesi) hazır tutun.</li>
	<li>Çözülme ve ruxolitinib hisse senedi flakon (10 mM) 1: 10'steril PBS (1 mM) oranında seyreltin. Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Çözülme ve R848 hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1:10 steril PBS seyreltik (0,1 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Çözülme ve LPS hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1: 100 steril PBS içinde seyreltik (0.01 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Steril RPMI (yok L-glutamin) bir standart 37 ° C su banyosu (için en az 10 dk) önceden ısıtmak.</li>
	<li>1:5 filtre uygulanmış GKD2O (çalışma konsantrasyonu) (steril olması gerekmez) benchtop tarafından lyse/düzeltme arabellek sulandırmak. Not: tam kan 1 mL 20 mL çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek gerektirir.<ol>
<li>Parçalayıcı/düzeltme arabellek tam kan her (en az 100 mL), 1 ml 5 koşulları için yapmak. Lyse/düzeltme arabellek çalışma konsantrasyonu tam kan (keep lyse/düzeltme çözüm gerekinceye kadar 37 ° C'de) mililitre başına 50 mL konik tüpler içine aliquot 20 mL. Aşağıdaki gibi koşullar/düzeltme arabellek içeren konik tüpler koşullara etiket: T0 (zaman sıfır), T6 + 5R (zaman 5 ile 6 h uM ruxolitinib), T6 + R848 (zaman 6 h ile 1 μg/mL R848), T6 + LPS (zamanla 6 h 0,1 μg/mL LPS), T6 (6 h zaman).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiket yuvarlak kapaklar ile alt steril polistren tüpler ve 1 mL microcentrifuge tüpleri ile adım 1,10 olduğu gibi aynı adlandırma.</li>
</ol>2. stimülasyon ve periferik tam kan (Şekil 1) işlenmesi
<ol><li>Etiketli alt polistren tüpler adım 1,11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) bir raf üzerinde yuvarlak yerleştirin. Not: Aşağıdaki adımların tümünü Aksi belirtilmediği sürece bu tür tüp içinde gerçekleştirilir. Tüpler doku kültürü hood ve kısırlık korumak için inkübatör transfer ederken kap.</li>
	<li>37 ° C RPMI (yok L-glutamin) 1 mL tüpler (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) için ekleyin. Kan toplama tüp birkaç kez ters çevir, her tüpün tam kan 1 mL ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez RPMI ile iyice karıştırın (RPMI ile seyreltme engeller kanı 6 h kuluçka döneminde topaklanma).</li>
	<li>1:10 10 μL eklemek ruxolitinib T6 + 5R. P1000 pipet ile iyice karıştırın. 37 ° C'de kuluçka tüpler rafa yerleştirin ve kuluçka zamanlama başlar (T = 0).</li>
	<li>T0 örnek aşağıdaki gibi işlem.<ol>
<li>T0 tüp tüm içeriğini 37 ° C çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabelleği 20 mL içeren etiketli bir konik tüp pipette. Hücre kurtarma en iyi duruma getirmek için çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek ile tüp durulayın. Konik tüp ters çevirme karıştırın.</li>
		<li>Lizis ve fiksasyon için izin vermek 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Fiksasyon, benchtop, tüm sonraki adımları uygulayın. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak. Buz soğuk PBS Pelet kadar kırmak için 1 mL hücrelerde resuspend sonra konik bir 15 mL birime PBS ile doldurun.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant dikkatle boşaltmak. Granül kırmızı PBS yıkama (adımları 2.4.3–2.4.4) işlemini yineleyin. CSM Pelet kadar kırmak, sonra antikor boyama için etiketli microcentrifuge tüp (adım 1.11) aktarmak için 1 mL hücrelerde resuspend. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 µL örnek almak. Not: tüm hücreleri bu noktada sabitlenir beri bu canlılığı leke eklemek gerekli değildir.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Pelet rezidüel hacim ~ 60 µL içinde bırakarak süpernatant, Aspire edin. Diğer koşullar örnekleri işlem tamamlanıncaya kadar bu pelet buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dk, T = tüp raf (adım 2.3) doku kültürü hood taşımak ve aşağıdakileri gerçekleştirmek.<ol>
<li>0,1 μg/μL 10 μL eklemek R848 T6 + R848. P1000 pipet ile iyice karıştırın.</li>
		<li>0,01 μg/μL LPS 10 μL T6 + LPS ekleyin. P1000 pipet ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Protein taşıma inhibitörü (500 X hisse senedi) 4 μL eklemek T6, T6 + 5R ve T6 + LPS (ama değil T6 + R848) ve örnekleri için kuluçka T kadar dönmek 6 h. Mix P1000 pipet her 2 h ile iyice =. Not: R848 bir endoplasmic TLR agonist ve bu nedenle onun hedef reseptör erişimi için izin vermek için protein taşıma inhibitörü eklenmesi geçici gecikmeden gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 h, T = 4 μL protein taşıma inhibitörü kokteyl (500 X hisse senedi) eklemek T6 + R848 tüp. Tüm örneklerini P1000 pipet ile karıştırın ve raf için kuluçka T kadar dönmek 6 h =.</li>
	<li>Örnekleri ile bir P1000 t bir kez daha karıştırın 4 h =.</li>
	<li>T = 6 h, proses T6, T6 + LPS, T6 + R848 ve T6 + 5R kan örnek tüpler açıklandığı gibi adım 2.4 T0 örnek için.</li>
	<li>Hücre topakları kalan CSM birim gelecekteki bir tarihte işlemeye-80 ° C'de depolayın. Alternatif olarak, barkod ve antikor depolamadan boyama devam edin.</li>
</ol>3. kan hücrelerinin Lysed/Sabit barkod
<ol><li>Buz üzerinde yavaş yavaş-80 ° C depodan lysed/sabit hücre örnekleri çözme; en fazla 20 örnekleri ile benzersiz barkod etiketli ve bu sistemi kullanarak havuza alınmış. 1:10 PBS ile 10 X barcoding perma arabellek seyreltik; ~ 3 mL örnek başına için yeterli arabellek olun.</li>
	<li>Bir non-steril yalak CSM ve 1 X barcoding perma arabellek ile doldurun. Buz 1 mL ekleyin taze çözülmüş örnekleri, soğuk CSM bir pipet ile iyice karıştırın ve transfer için ilgili önceden etiketli Polipropilen küme tüpler.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 μL örnek almak. 1,5-2 katı örnek her küme tüp başına 106 hücre hücre sayısı normale: kaldırmak ve 2 x 106 hücre yukarıda aşırı hücre hacmi atın.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. 1 X barcoding perma arabelleği bir çok kanallı pipet ve oda sıcaklığında 5 min için 600 x g, santrifüj ile 1 mL hücrelerde resuspend. Süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Küme tüpler aynı sırada bir raf üzerinde barkod anahtar örnek onun barkod ile eşleşecek şekilde gösterildiği gibi hizalayın. Barkodlama perma arabellek X 800 μL 1, hücre kaybı azaltmak pipet uçları-(asla karıştırma) ile hücre Pelet dokunmadan küme tüpler tüm örnekleri tarafından çok kanallı pipet ekleyin. Raf kümesi tüp ile bir kenara.</li>
	<li>-20 ° C ve çözülme oda sıcaklığında 20-plex Pd barkodlama Kit tüp şeritler kaldırın. 1 X barcoding perma arabelleği 100 μL eklemek, iyice karıştırın ve karşılık gelen hücre örnekleri küme tüpler içine resuspended barkod karışımı 120 μL transfer.</li>
	<li>Böylece hiçbir çapraz bulaşma ayrı ayrı barkodlu örnekleri arasında çok kanallı pipet tarafından iyice karıştırın. Küme tüpler hücreleri etiketlemek barkodlar izin vermek için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin, sonra 1 mL CSM resuspend.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi ve CSM içinde tekrar adım 3.8 olduğu gibi resuspend. Not: Her örnek şimdi benzersiz bir barkod ile etiketlenir ve örnekleri havuza alınmış hazır.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Tek bir pipet ve aynı ucu kullanarak, tüm hücre topakları ~ 70 – 80 aktarım μL kalan birime bir polistren tüp. Değil pipet ucu dışarı atmak; Bu uç ile tek pipet kenara.</li>
	<li>Bir çok kanallı pipet ve yeni ipuçları, ~ 100 μL CSM hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak için her özgün küme tüp ekleyin. Bir kenara koyun ucu tek pipet ile aynı polistren tüp ~ 100 μL artık birimdeki tüm hücre topakları aktarın.</li>
	<li>CSM polistren tüp (~ 3 mL) kapalı dön ekleyin. Sayısı ve kayıt havuza alınan barkod hücre sayısını ayarlayın. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Aynı gün barkodlu örnekleri boyama için devam edin. Not: ~ 20-%30 hücre iletişim kesilecek barkodlama sürecinde normaldir.</li>
</ol>4. boyama barkodlu Lysed/kan hücreleri ve analiz için hazırlık kitle sitometresi araç üzerinde sabit
Not: antikor boyama her 1 X titresi (antikor 100 başına 1 μL tepki boyama μL), genellikle 3-4 x 106 hücre leke olabilir. Ne zaman tüm barkodlu örnekleri bir tüpün içine birikmiş, bu nedenle, antikor miktarı ölçekli olmalıdır. 20 barkodlu örnekleri tutarı 30 x 106 hücreler ve her 1 X titresi için 3-4 x 106 hücre leke olabilir, barkodlu örnek, ancak bir antikor (başına 1 X 20 X miktarda gerektiren tek tek, her örnek boyama aksine bir 10 X titresi, gereksinimi bireysel tüp). Cep numarası için antikor konsantrasyonu (burada tartışılan değil) her bireysel antikor için kokteyl dikkatle titre.
<ol><li>Antikorlar (Tablo reçetesi) kullanarak hücre yüzey boyama ve sitokin indüksiyon için leke.<ol>
<li>Yüzey boyama kokteyl tutarın eklendi ve muhasebe için pipetting hata olmasını hesaplayarak yapmak (yani, 2 x 106 hücre her örneğinde, 20 barkodlu örnekleri boyama 10 X titresi leke ise gerekli son hacim hesaplamaları için; Pipetting hata için bir 10,5 X son çözüm boyama yaparak telafi etmek).</li>
		<li>10 X barkodlu hücre Pelet birime boyama yüzey ekleyin. Aynı ucu hücre kaybı azaltmak için mix ve yüzey lekeleri ve hücre Pelet sesini ölçmek.</li>
		<li>Hücrelerin ve kokteyl boyama birimde dayanarak, CSM sayısına göre hücre örnekleri (el 20 örnekleri, X 20 = 1 mL 50 μL çalışsayani) 50 μL son boyama hacmi ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama tanıtmak için tahrik.</li>
		<li>Yüzey leke kuluçka sırasında O. Prepare birimleri için permeabilization 2 mL ve 5 mL yıkama sulandrarak 1:10 süzülmüş GKD2perma/yıkama arabellek (Tablo reçetesi) hazır olun. 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.</li>
		<li>CSM ile tüp boyama yüzey kapalı üst ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj süpernatant Aspire edin. Barkodlu örnek 4 ° C, 1:10 2 mL resuspend seyreltme perma/yıkama arabellek. 20-30 dk tam hücreleri permeabilize 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
		<li>Hücre içi boyama için (gelince yüzey boyama) benzer boyama adımları izleyin. Ancak, 4 ° C, 1:10 kullanın seyreltme perma/yıkama arabellek CSM cilt hücreleri, hücre içi boyama boyunca permeabilizing bir ortamda kadın boyama toplam yapmak yerine.</li>
		<li>Hücre içi antikor yüzeye kokteyl lekeli ve hücre Pelet (adımları 4.1.2–4.1.17) permeabilized ekleyin. Hücre örnekleri sayısı başına 50 μL birime boyama toplam getir. 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama emin olmak için tahrik.</li>
		<li>Hücre içi boyama sırasında hazırlamak enterkalatörün çözüm: filtre uygulanmış PBS + filtre uygulanmış %16 100 μL 900 μL PFA (son konsantrasyonu % 1.6 PFA) + 0.2 μL 500 enterkalatörün boya (Tablo malzemeler), uM.</li>
		<li>Kapalı hücre Pelet + hücre içi antikor soğuk 1:10 ile kokteyl perma/yıkama arabellek üst.</li>
		<li>600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. CSM ile boyama tüp kapalı üst. Saymak ve telefon numarası kaydedebilirsiniz. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. 1 mL enterkalatörün çözeltisi adım 4,9 hücrelerde resuspend. Tam enterkalasyon için oda sıcaklığında en az 20 dk için kuluçkaya, veya bir gece 4 ° c (enterkalatörün çözüm örnekleri 4 ° C'de onları kitle sitometresi araç üzerinde çalıştırmadan önce 1 hafta kalabilir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri toplu sitometresi enstrüman için hazırlayın.<ol>
<li>«Ana sayfa» kapalı süzülmüş GKD2O 3 mL ve 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj tüpü Filtre uygulanmış GKD2O. geçmek 3 mL hücrelerde bu süspansiyon herhangi bir enkaz veya potansiyel olarak kitle sitometresi enstrüman yapışmasına neden toplamları kaldırmak için 100 mikron filtre resuspend.</li>
		<li>Say ve hücre sayı sonrası filtrasyon kaydetmek. 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 süzülmüş GKD2O. sulandrarak kalibrasyon boncuk çözüm (Tablo reçetesi) hazırlamak</li>
	<li>Lekeli resuspend 1:10 gerekli cilt hücrelerinde hücre konsantrasyonu 106 hücre/mL x 1 ~ ulaşmak için kalibrasyon boncuk çözüm seyreltilmiş. Not: 45 µL/min bir CyTOF1 için önerilen optimum 5 x 105 hücre/mL olduğunu; 30 µL/dk, 7.5 x 105 hücre/mL Helios için.</li>
	<li>Kitle sitometresi enstrüman9tarihinde örneği çalıştırmak için devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+diseases%3A+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+public+health%22%5BJournal%5D)">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li>
<li>Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus%3A+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li>
<li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27306639">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).</li>
<li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+effector+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).</li>
<li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function%3A+the+T+helper+type+17+example%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li>
<li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+stories+on+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li>
<li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li>
<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li>
<li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry%3A+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li>
<li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li>
<li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li>
<li>Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li>
<li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li>
<li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li>
<li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425(2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li>
<li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li>
<li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li>
<li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz bir roman, tek hücreli, proteomik yaklaşım aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak açıklar. Bu yöntemi periferik tam kan analitik araç ve toplu sitometresi bağışıklık hücresel fenotipik ve fonksiyonel anormallikler değerlendirilmesi için araç olarak kullanır. Yöntem insan ve fare çalışmaları21' e kolayca uygulanabilir ve sinyal anormalli...

Otoimmün hastalıklar morbidite ve mortalite nüfusun % 3-8 etkileyen önemli bir nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen genç ve orta yaşlı kadınlarda ölüm nedenleri otoimmün hastalıklar arasındadır (Yaş < 65 yaş)1,2. Otoimmün hastalıklar türdeş olmayan klinik sunum ve çeşitli temel immünolojik süreçleri ile karakterizedir. Heterojenite yelpazesi de romatoid artrit (RA) eklem tutulumu ve nörolojik hastalığı multipl skleroz (MS) gibi farklı bozuklukları arasında temsil edilir. Ancak, bu düzeyde heterojen da sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi tek bir bozukluğu içinde örneklenir: Diğer hematolojik veya eklem tutulumu3acı çekerken bazı hastalar böbrek patolojisi ile takdim edebilir miyim.
Otoimmün hastalıklar temel immunopathogenesis auto - ve hiper-harekete geçirmek-in birden fazla doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ve eşlik eden dysregulated sitokin üretim ile ilgili klinik heterojenite yansıtır. Sitokinler otoimmün hastalık patogenezinde önemli rol oynarken, hastalığın mekanizması içindeki belirli rolü anlamak zor olduğu ispatlanmıştır. Sitokinler tarafından Pleiotropi ile karakterize (bir sitokin farklı hücre tipleri üzerinde birden fazla etkileri olabilir), (birden çok sitokinler aynı etkisi olabilir) artıklık, ikilik (bir sitokin pro veya anti inflammatory etkileri farklı koşullar altında olabilir), ve plastisite (sitokinler kalıp içine bir rol farklı ortama bağlı "orijinal" onun bir)4,5,6. Sonuç olarak, nüfus düzeyinde yöntemleri aynı "sitokin ortamın" türdeş olmayan hücresel yanıt ayırt edemez. Benzer şekilde, çalışma (bir tek hücre türü veya sitokin) bağışıklık sisteminin bir belirli konu üzerinde odaklanmak tasarımları, karmaşık otoimmün hastalığı dahil tüm öğeleri genel bir değerlendirmesini sunuyor musunuz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz.
Son zamanlarda, aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak için bir tek hücreli proteomik yaklaşım geliştirdik. Burada açıklanan iş akışı bozulmamış çevre tam kan örnekleri, izole periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) karşı kullanımı ile karakterizedir. Bütün kan periferik sistemik immün aracılı hastalığı otoimmün hastalığı (yani, nötrofiller, trombosit) ve 2) plazma kez dahil 1) Sigara-mononükleer kan hücreleri de dahil olmak üzere, eğitim için en fizyolojik ilgili araç temsil eder. Nükleik asitler, immün kompleksler ve sitokinler, gibi faktörler dolaşan olan bağışıklık aktive rollere sahip. Yakalamak için "içsel patojenik" dysregulated sitokin üretim, periferik kan örnekleri hemen sonra kan alımı (T0, sıfır) ve 6 h, 37 ° c (fizyolojik vücut ısısı) bir protein taşıma ile kuluçka sonra işlenir inhibitörü "içsel" hastalık durumu (Şekil 1) yansıtacak sitokin üretim (birikimi, T6-T0) tespit etmek için herhangi bir eksojen uyarıcı durumu (T6, saat 6 h), yokluğunda. (6 h kuluçka protein taşıma inhibitörü ile 37 ° C'de) üzerinden yansıtmak dysregulated işlemler veya periferik kan örnekleri olan yolları bağışıklık yanıtı hastalığa, ilgili yer işaret altında aktif çalışmaya bir eksojen ile tedavi Nükleik asitler yanıt yansıtacak sitokin üretim algılamak için geçiş ücreti-gibi-reseptör (TLR) agonistler SLE (T6 + R848, zaman 6 1 µg/mL ile R848 s), söz konusu olduğunda gibi hastalık patogenezinde yansıtır koşulu uyarıcı (T0 vs T6 vs T6 karşılaştırma + R848, Şekil 1). Onlar kesin bağışıklık dysregulated işlemler için belirli hasta ilgilendirmeyen olarak kullanılabilir therapeutics ex vivo, etkileri immunomodulatory eğitim için periferik kan örnekleri bir JAK inhibitörü ile ilgili, terapötik değerlendirilir konsantrasyonu (burada, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, süre 5 ile 6 h uM ruxolitinib), "iç" hastalık durumunda ilaç (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Şekil 1) karşılık olarak değişiklikleri algılamak için. JAK inhibitörleri gibi ra otoimmün hastalıkların tedavisinde başarılı olduğu gösterilmiştir çünkü bir JAK önleyici bu çalışma için seçildi
Aynı anda birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri, SLE periferik kan örnekleri yukarıda açıklanan dysregulated işlemleri değerlendirmek için hasta ve sağlıklı kontrol yukarıda açıklandığı gibi işlenen ve kitle sitometresi tarafından analiz. 7,8,9spektral konularda örtüşme olmadan kitle sitometresi, olarak da bilinen sitometresi-zaman--uçuş, 40'tan fazla parametreleri tek hücre analizi sunmaktadır. Bu tekniği nadir toprak metal izotoplar çözünür metal iyonları şeklinde Etiketler antikorlar, fluorophores10yerine bağlı olarak kullanır. Kitle sitometresi teknolojik platform (Yani, ayar ve kalibrasyon, örnek alma) ile ilgili ek ayrıntılar bulunabilir Leipold vd ve McCarthy vd. 11 , 12 yüksek-boyutluluk kitle sitometresi, tek hücreli taneciklik (Malzemeler tablo) ile aynı anda birden fazla sitokinler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri boyunca ölçümü sağlar.
Geçerli geleneksel klinik ve laboratuvar parametreleri hassas veya devam eden hastalık aktivitesi veya belirli immunomodulators13daha iyi temel bağışıklık betimlemek gerek yansıtan, cevaben algılamak için belirli genellikle değildir flare-up sürücü değişiklikleri. Sitokin bozukluk kapitalistleri otoimmün hastalığı göz önüne alındığında, antikorlar veya sitokinler hedefleme veya sinyal proteinleri sitokin üretiminin yönetmelikte yer alan küçük moleküler inhibitörleri kullanın tedavi yaklaşımları bir bolluk var Son zamanlarda ortaya çıkan. Temel biçimiyle, burada açıklanan periferik kan analitik yaklaşım hastaya özgü dysregulated hücre alt kümeleri ve anormal sitokin üretim sistemik bulgular ile otoimmün hastalık tanımlamak için bir platform sağlar. Bu metodoloji tedavi seçenekleri kişiselleştirme için belirli dysregulated sitokinler belirlenebilir ve spesifik tedavi seçenekleri olabilir onların yetenek-e doğru immunomodulate değerlendirmek için ex vivo hasta belirli hastalık test sağlar işlem.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Stok Konsantrasyonu: 10 mM; Son Sonuç: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stok Kons: 1 &mu; g/&mu; L; Son Sonuç: 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Stok Konk: 1 &mu; g/&mu; L; Son Sonuç: 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stok Kons: 5X; Son Conc: 1X (ddH2O içinde seyreltik)</td></tr> <tr><td>BD Fosflow perma / yıkama tamponu I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stok Conc: 10X; Son Conc: 1:10 (ddH2O içinde seyreltik)</td></tr> <tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide (NaN3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Stok Kons: %>99,9; Son Conc: 0.0002</td></tr><tr><td>Protein Taşıma İnhibitörü (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Stok Kons: 500X; Son Konsantrasyon: 1X</td></tr><tr><td>DNA İnterkalatör</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stok Konsantrasyonu: 500 &mu; M; Son Sonuç: 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hücre Boyama Ortamı (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + %0,5 BSA, %0,02 NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barkod Perma Tampon</td><td>Sıvısıigm</td><td>201057</td><td>Stok Kons: 10X; Son Kapanış: 1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd Barkod Seti</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Stok Konsantrasyonu: n/a; Son Çözüm: Yok</td></tr><tr><td>EQ TM Dört Elemanlı Kalibrasyon Boncukları</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Stok Konsantrasyonu: 10X; Son Konsantrasyon: 1X</td></tr><tr><td>%16 MeOH içermeyen Formaldehit Çözeltisi</td><td>Termo</td><td>28908</td><td>Stok Konsantrasyonu: %16 (a/h); Son Conc:% 1.6 (w / v)</td></tr> <tr><td>Steril yuvarlak tabanlı polistiren tüpler</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Stok Conc: n / a; Son Conc: n / a</td></tr><tr><td>Polipropilen küme tüpleri</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Stok Conc: n / a; Son Conc: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF cihazı</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>CyTOF analizinde kullanılacak tüm solüsyonların metal kontaminasyonundan arındırılmış olması gerekmektedir. ddH2O, herhangi bir çözeltinin hazırlanmasında kullanılır, en az 18.0 M&Omega; direncine sahip olmalıdır. ddH2O ve kendi kendine hazırlanan solüsyonlar, hiç otoklavlanmamış yeni plastik veya cam şişelerde saklanmalıdır.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kütle Sitometrisi için kullanılan antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüzey belirteçleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Kütle: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Kütle: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Kütle: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Kütle: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Kütle: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Kütle: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Kütle: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Kütle: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Kütle: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Kütle: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Kütle: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Kütle: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Kütle: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Kütle: 172</td></tr><tr><td>CD45 toplam</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Kütle: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Kütle: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Kütle: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Kütle: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Kütle: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Kütle: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Kütle: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Kütle: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Kütle: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Kütle: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Kütle: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Kütle: 167</td></tr><tr><td><güçlü>Sitokinler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1 ve alfa;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Kütle: 147</td></tr><tr><td>IL-1 ve beta;</td><td>Biyoefsane&nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Kütlesi: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>AS17</td><td>Kütle: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Kütle: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Kütle: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Kütle: 171</td></tr><tr><td>IL-17A Biolegend</td><td>&nbsp;</td><td>BL168</td><td>Kütle: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Kütle: 176</td></tr><tr><td>MIP1 ve beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Kütle: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Kütle: 170</td></tr><tr><td>IFN&alfa;</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>Kütle: 175</td></tr><tr><td>IFN&gama;</td><td>Biyoefsane</td><td>4S. B3</td><td>Kütle: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Kütle: 159</td></tr><tr><td>TNF & alfa;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Kütle: 166</td></tr><tr><td>Not: Üretici Fluidigm olarak belirtilmişse, bu antikor metal önceden konjuge edilmiş olarak Fluidigm'den satın alınmıştır. Üretici Fluidigm'den farklı olarak belirtilirse, bu antikor MaxPar Multi-Metal Etiketleme kullanılarak kendi kendine konjuge edilmiştir&nbsp; Kit (Fluidigm Cat: 201300) üretici protokolüne göre.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Sitokinler, otoimmün hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sitokin düzeyleri ölçümü bir girişim self-tolerance ve sonraki otoimmünite dökümü yol açan kesin mekanizmalar anlamak için birden fazla çalışmaların odak noktası olmuştur. Yaklaşımlar şu ana kadar belirli bir yönü (tek veya birkaç hücre tipleri veya sitokinler) bağışıklık sisteminin çalışmaya dayanarak ve karmaşık otoimmün hastalık genel bir değerlendirmesini sağlamaz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz. Sitokin üretim faktörleri, dolaşan "içsel" hasta özel plazma bağlamında birden çok alt bağışıklık hücre kümeleri içinde değerlendirmek için kapsamlı bir tek hücreli yaklaşım burada açıklanmıştır. Bu yaklaşım sağlar hastaya özgü bağışıklık fenotip (yüzey işaretleri) izleme ve fonksiyonu (sitokinler), ya da onun yerli "içsel patojenik" hastalık devlet, veya terapötik ajanlar (içinde VIVO veya ex vivo) huzurunda.

İş akışı uyarılması için Şekil 1 gösterir ve kan örnek aliquots, tahsisi de dahil olmak üzere periferik kan örnekleri işleme zamanlama stimülasyon ajanlar, protein ek taşıma inhibitörü kokteyl ve kuluçka kez kırmızı kan hücresi (RBC) lizis ve fiksasyon kadar. Seçtiğiniz uyarıcı ajanlar bir değerlendirmesi için hedeflenir sinyal ve sitokin yollar bağlı olacaktır. Örneğin, burada açıklanan protokolünde TLR agonistler doğuştan gelen bağışıklık algılama mekanizma...

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Bu yöntem, otoimmün hastalık ortamında hücre frekansı anormalliklerinin ve anahtar sitokinlerin üretimi gibi fonksiyon farklılıklarının tanımlanması gibi otoimmünite alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, kolayca elde edilebilen bir periferik kan örneğinden geniş bir repertuarı veya farklı hücre tiplerini ve fonksiyon farklılıklarını yakalayabilmesidir. Genel olarak, bu sürece yeni başlayan kişiler, kan işleme adımlarının zamanlamasını doğru yapmak, antikor paneli tasarımı, barkodlama işleminin kendisi ve yüksek boyutlu tek hücre verilerinin analizi ile mücadele edebilir.Bu sistem immünolojisi yaklaşımı, özellikle periferik kanda immün disregülasyonun yaygın ve belirgin olduğu SLE gibi otoimmün hastalıklar için uygundur. Bu yöntemin görsel gösterimi, adımların zamanlamasını açıklığa kavuşturmak ve ayrıca kütle sitometri analizinden önce birden fazla numunenin nasıl barkodlanabileceğini ve bir araya getirilebileceğini göstermek için önemlidir. Bu prosedüre başlamak için, tam kan işleme için beş farklı koşula sahip etiketli yuvarlak tabanlı polistiren tüpleri bir rafa yerleştirin.Ardından, her tüpe bir mililitre 37 santigrat derece RPMI ekleyin. Ardından, her tüpe bir mililitre tam kan ekleyin ve RPMI ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, T altı artı beş R etiketli tüpe 10 mikrolitre önceden seyreltilmiş ruxolitinib ekleyin ve iyice karıştırın.Tüp rafını inkübatöre 37 santigrat derecede yerleştirin ve inkübasyonu zamanlamaya başlayın. T sıfır numunesini işlemek için, T sıfır tüpünün tüm içeriğini, çalışma konsantrasyonunda 20 mililitre 37 santigrat derece lize/sabitleme tamponu içeren etiketli bir konik tüpe pipetleyin. Hücre geri kazanımını optimize etmek için, tüpü lize / fix tamponu ile durulayın ve konik tüpü ters çevirerek karıştırın.Lizis ve fiksasyona izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı boşaltın ve peleti parçalamak için hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın.Ardından, konik tüpü PBS ile 15 mililitrelik bir hacme kadar doldurun. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Peleti parçalamak için hücreleri bir mililitre CSM'de yeniden süspanse edin.Ardından, antikor boyaması için numuneyi etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücreleri 10 mikrolitrelik bir örnekle sayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti yaklaşık 60 mikrolitre kalıntı içinde bırakın. Diğer koşullardan gelen numuneler işlemeyi tamamlayana kadar bu peleti buz üzerinde tutun. T'de 30 dakikaya eşit, tüp rafını doku kültürü başlığına aktarın.T six plus R848 tüpüne mikrolitre başına 0.1 gramda 10 mikrolitre R848 ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, T six plus LPS tüpüne mikrolitre başına 0.01 mikrogram hızında 10 mikrolitre LPS ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, T altı, T altı artı beş R ve T altı artı LPS etiketli tüplere dört mikrolitre protein taşıma inhibitörü ekleyin ve numuneleri T altı saate eşit olana kadar inkübatöre geri koyun.Numuneleri her iki saatte bir P1000 pipetle iyice karıştırın. T iki saate eşit olduğunda, T six plus R848 tüpüne dört mikrolitre protein taşıma inhibitörü kokteyli ekleyin. Tüm numuneleri karıştırın ve T altı saate eşit olana kadar rafı inkübatöre geri koyun.T dört saate eşit olduğunda, numuneleri bir P1000 pipeti ile bir kez daha karıştırın. T'de altı saate eşittir, T sıfır numunesi için tarif edildiği gibi T altı, T altı artı LPS, T altı artı R848 ve T altı artı beş R kan numunesi tüpünü işleyin. Ardından, peletleri daha sonra işlemek için eksi 80 santigrat derecede kalan CSM hacminde saklayın.Parçalanmış, sabitlenmiş hücreleri barkodlamak için, eksi 80 santigrat derece depodaki numuneleri buz üzerinde yavaşça çözün. 10X barkodlama perma tamponunu PBS ile bir ila 10 oranında seyreltin ve numune başına üç mililitre için yeterli tampon yapın. Steril olmayan bir oluğu CSM ile ve diğerini bir X barkodlama perma tamponu ile doldurun.Ardından, taze çözülmüş numunelere bir mililitre buz gibi soğuk CSM ekleyin, iyice karıştırın ve ilgili önceden etiketlenmiş polipropilen küme tüplerine aktarın. Şimdi, 10 mikrolitrelik bir numune alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Fazla hücre hacmini çıkararak her küme tüpündeki hücre sayımlarını normalleştirin.Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri çok kanallı bir pipet ile bir mililitre bir X barkodlama perma tamponunda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin.Numunenin barkoduyla eşleşmesi için küme tüplerini bir raf üzerinde barkod anahtarında belirtildiği sırayla hizalayın. Hücre kaybını azaltmak için hücre peletine dokunmadan küme tüplerindeki tüm numunelere çok kanallı pipet ile 800 mikrolitre bir X barkodlama perma tamponu ekleyin. Ardından, küme tüplerinin bulunduğu rafı bir kenara koyun.20 plex paladyum barkodlama kiti tüp şeritlerini eksi 20 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. 100 mikrolitre bir X barkodlama perma tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve yeniden askıya alınan barkod karışımının 120 mikrolitresini küme tüplerindeki ilgili hücre örneklerine aktarın. Ayrı ayrı barkodlu numuneler arasında çapraz kontaminasyon olmaması için çok kanallı pipetle iyice karıştırın.Barkodların hücreleri etiketlemesine izin vermek için küme tüplerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, ardından bir mililitre CSM'de yeniden askıya alın.Daha sonra, CSM'de tekrar santrifüjleyin ve yeniden askıya alın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tek bir pipetle ve aynı ucu kullanarak, yaklaşık 70 ila 80 mikrolitre artık hacimdeki tüm hücre peletlerini bir polistiren tüpe aktarın.Pipet ucunu çıkarmayın. Bu uçla tek pipeti bir kenara koyun. Çok kanallı bir pipet ve yeni uçlarla, hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için her bir orijinal küme tüpüne 100 mikrolitre CSM ekleyin.Ucu bir kenara bırakılmış olan tek pipeti kullanarak, 100 mikrolitre artık hacimdeki tüm hücre peletlerini aynı polistiren tüpe aktarın. Polistiren tüpü yaklaşık üç mililitreye kadar tamamlamak için CSM ekleyin. Havuza alınan barkod setinin hücre numarasını sayın ve kaydedin.Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Barkodlu numuneleri aynı gün boyamaya devam edin. Bu şema, kan örneği alikotlarının tahsisi, stimülasyon ajanlarının eklenmesinin zamanlaması, protein taşıma inhibitörü kokteyli ve kırmızı kan hücresi lizisi ve fiksasyonuna kadar inkübasyon süreleri dahil olmak üzere periferik kan örneklerinin uyarılması ve işlenmesi için iş akışını gösterir.Uyarıcı ajanların seçimi, değerlendirme için hedeflenen sinyalleme ve sitokin yollarına bağlı olacaktır. Fiksasyon ve RBC lizizini takiben, sağlıklı bir donörden alınan bireysel parçalanmış, sabit hücre örnekleri barkodlandı, yüzey belirteçlerine karşı 26 antikor ile etiketlendi, geçirgen hale getirildi ve sitokinlere karşı 14 antikor ile boyandı. CD14 yüksek monositlerinin tanımlanmasını temsil eden sınırlı geçit stratejisi burada gösterilmiştir.Soldan sağa, temsil edilen her 2B çizim, 2B çizimden hemen sola doğru geçitli olan üst popülasyondan bir popülasyon alt kümesidir. Sekiz immün hücre alt setinde temsili olarak CD14 yüksek monositleri kullanılarak, sıfır zamanında ve TLR agonisti LPS ve R848 ve T hücresi aktivatörü PMA iyonomisin ile stimülasyonu takiben sağlıklı bir donörden alınan periferik kan örnekleri üzerinde bir kütle sitometrisi analizi yapıldı. CD14 yüksek monositlerinde sitokin indüksiyonunun bir örneği gösterilmiş ve kullanılan uyarıcı ajana özgüllüğü olan seçilmiş sitokinler gösterilmiştir.R848, CD14 yüksek monositlerinde IL-12p40 alt birimini ve MCP1'i seçici olarak indüklerken, LPS bunu yapmaz. Buna karşılık, PMA iyonomisin CD14 yüksek monositlerinde sitokinleri indüklemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, kan stimülasyonları yaklaşık yedi saat içinde yapılabilir ve barkodlama adımı yaklaşık bir saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, adımların zamanlamasına dikkat etmek ve buna göre önceden plan yapmak önemlidir. Bu prosedürü uyguladıktan sonra, kendi araştırma amaçlarınıza özgü bağışıklık hücresi tepkilerini değerlendirmek için kütle sitometrisi panelindeki kan stimülasyon koşullarını değiştirmeyi düşünebilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, tam kan örneklerinden sitokin yanıtlarının nasıl ortaya çıkarılacağını ve kütle sitometrisi analizi için birden fazla örneğin barkodlu bir sette nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız.

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu raporda, biz büyük doğal ve adaptif lökosit popülasyonlarının numaralandırmak için taze tam kan üzerinde gerçekleştirilen bir feno testinin boyama ve analiz adımları göstermektedir. Biz çok merkezli klinik çalışma kapsamında bu işlemler gerçekleştirmek için konuları vurgulamaktadır.

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on...

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Bu video, farklı hücre barkodlaması için ağır metal konjuge antikorlar kullanan tek hücreli bir proteomik yöntemi vurgulamaktadır. Daha sonra, insan tam kan kaynaklı immün hücrelerdeki immün fenotipik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için immün boyama ve kitle sitometrisi uygulanır.

İmmün Hücrelerin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu için Bir Barkodlama Testi

Tam kan İmmünofenotiplemesi, insan bağışıklık sistemini izlemek için vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, gerekli reaktiflerin sayısı ve önceden karıştırılmış kokteyllerdeki spesifik florokromların kararsızlığı, günlük reaktif hazırlığını gerektirir. Burada, boyama antikor kokteylinin yarı otomatik olarak hazırlanmasının, reaktif dağıtımındaki değişkenliği en aza indirerek güvenilir immünofenotipleme oluşturmaya yardımcı olduğunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Bu makale, kütle sitometrisi analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HCC) hem sistemik hem de lokal immün yanıtları değerlendirmek için kapsamlı bir kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) analiz yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Yaklaşım, tümör mikro çevresi ve ilişkili bağışıklık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış sunarak HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında bilgi sağlamayı amaçlamaktadır.

Hepatosellüler Karsinomda Sistemik ve Lokal İmmün Yanıtların Kütle Sitometrisi Analizi

Bu protokol, yenidoğan ve pediatrik hastalardan alınan kan örneklerinin toplanmasını ve korunmasını ve bu örneklerdeki bağışıklık hücre popülasyonlarını karakterize etmek için scRNA-seq, proteomik ve spektral akış sitometrisinin uygulanmasını açıklar.

Bebek Bağışıklığını Minimum Girdiyle Haritalama: Bütünleşik Tek Hücreli ve Multiomik Profilleme

Öğrenin, kitle sitometrisi ile periferik tam kan örneklerinde tek hücreli immünofenotip ve sitokin üretimini analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım, otoimmün hastalıklardaki immün düzenlenme bozukluklarını değerlendirmek için uygundur.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Daha fazla video keşfet