Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Bu yöntem, otoimmün hastalık ortamında hücre frekansı anormalliklerinin ve anahtar sitokinlerin üretimi gibi fonksiyon farklılıklarının tanımlanması gibi otoimmünite alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, kolayca elde edilebilen bir periferik kan örneğinden geniş bir repertuarı veya farklı hücre tiplerini ve fonksiyon farklılıklarını yakalayabilmesidir. Genel olarak, bu sürece yeni başlayan kişiler, kan işleme adımlarının zamanlamasını doğru yapmak, antikor paneli tasarımı, barkodlama işleminin kendisi ve yüksek boyutlu tek hücre verilerinin analizi ile mücadele edebilir.

Bu sistem immünolojisi yaklaşımı, özellikle periferik kanda immün disregülasyonun yaygın ve belirgin olduğu SLE gibi otoimmün hastalıklar için uygundur. Bu yöntemin görsel gösterimi, adımların zamanlamasını açıklığa kavuşturmak ve ayrıca kütle sitometri analizinden önce birden fazla numunenin nasıl barkodlanabileceğini ve bir araya getirilebileceğini göstermek için önemlidir. Bu prosedüre başlamak için, tam kan işleme için beş farklı koşula sahip etiketli yuvarlak tabanlı polistiren tüpleri bir rafa yerleştirin.

Ardından, her tüpe bir mililitre 37 santigrat derece RPMI ekleyin. Ardından, her tüpe bir mililitre tam kan ekleyin ve RPMI ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, T altı artı beş R etiketli tüpe 10 mikrolitre önceden seyreltilmiş ruxolitinib ekleyin ve iyice karıştırın.

Tüp rafını inkübatöre 37 santigrat derecede yerleştirin ve inkübasyonu zamanlamaya başlayın. T sıfır numunesini işlemek için, T sıfır tüpünün tüm içeriğini, çalışma konsantrasyonunda 20 mililitre 37 santigrat derece lize/sabitleme tamponu içeren etiketli bir konik tüpe pipetleyin. Hücre geri kazanımını optimize etmek için, tüpü lize / fix tamponu ile durulayın ve konik tüpü ters çevirerek karıştırın.

Lizis ve fiksasyona izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı boşaltın ve peleti parçalamak için hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın.

Ardından, konik tüpü PBS ile 15 mililitrelik bir hacme kadar doldurun. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Peleti parçalamak için hücreleri bir mililitre CSM'de yeniden süspanse edin.

Ardından, antikor boyaması için numuneyi etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücreleri 10 mikrolitrelik bir örnekle sayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti yaklaşık 60 mikrolitre kalıntı içinde bırakın. Diğer koşullardan gelen numuneler işlemeyi tamamlayana kadar bu peleti buz üzerinde tutun. T'de 30 dakikaya eşit, tüp rafını doku kültürü başlığına aktarın.

T six plus R848 tüpüne mikrolitre başına 0.1 gramda 10 mikrolitre R848 ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, T six plus LPS tüpüne mikrolitre başına 0.01 mikrogram hızında 10 mikrolitre LPS ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, T altı, T altı artı beş R ve T altı artı LPS etiketli tüplere dört mikrolitre protein taşıma inhibitörü ekleyin ve numuneleri T altı saate eşit olana kadar inkübatöre geri koyun.

Numuneleri her iki saatte bir P1000 pipetle iyice karıştırın. T iki saate eşit olduğunda, T six plus R848 tüpüne dört mikrolitre protein taşıma inhibitörü kokteyli ekleyin. Tüm numuneleri karıştırın ve T altı saate eşit olana kadar rafı inkübatöre geri koyun.

T dört saate eşit olduğunda, numuneleri bir P1000 pipeti ile bir kez daha karıştırın. T'de altı saate eşittir, T sıfır numunesi için tarif edildiği gibi T altı, T altı artı LPS, T altı artı R848 ve T altı artı beş R kan numunesi tüpünü işleyin. Ardından, peletleri daha sonra işlemek için eksi 80 santigrat derecede kalan CSM hacminde saklayın.

Parçalanmış, sabitlenmiş hücreleri barkodlamak için, eksi 80 santigrat derece depodaki numuneleri buz üzerinde yavaşça çözün. 10X barkodlama perma tamponunu PBS ile bir ila 10 oranında seyreltin ve numune başına üç mililitre için yeterli tampon yapın. Steril olmayan bir oluğu CSM ile ve diğerini bir X barkodlama perma tamponu ile doldurun.

Ardından, taze çözülmüş numunelere bir mililitre buz gibi soğuk CSM ekleyin, iyice karıştırın ve ilgili önceden etiketlenmiş polipropilen küme tüplerine aktarın. Şimdi, 10 mikrolitrelik bir numune alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Fazla hücre hacmini çıkararak her küme tüpündeki hücre sayımlarını normalleştirin.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri çok kanallı bir pipet ile bir mililitre bir X barkodlama perma tamponunda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin.

Numunenin barkoduyla eşleşmesi için küme tüplerini bir raf üzerinde barkod anahtarında belirtildiği sırayla hizalayın. Hücre kaybını azaltmak için hücre peletine dokunmadan küme tüplerindeki tüm numunelere çok kanallı pipet ile 800 mikrolitre bir X barkodlama perma tamponu ekleyin. Ardından, küme tüplerinin bulunduğu rafı bir kenara koyun.

20 plex paladyum barkodlama kiti tüp şeritlerini eksi 20 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. 100 mikrolitre bir X barkodlama perma tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve yeniden askıya alınan barkod karışımının 120 mikrolitresini küme tüplerindeki ilgili hücre örneklerine aktarın. Ayrı ayrı barkodlu numuneler arasında çapraz kontaminasyon olmaması için çok kanallı pipetle iyice karıştırın.

Barkodların hücreleri etiketlemesine izin vermek için küme tüplerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, ardından bir mililitre CSM'de yeniden askıya alın.

Daha sonra, CSM'de tekrar santrifüjleyin ve yeniden askıya alın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tek bir pipetle ve aynı ucu kullanarak, yaklaşık 70 ila 80 mikrolitre artık hacimdeki tüm hücre peletlerini bir polistiren tüpe aktarın.

Pipet ucunu çıkarmayın. Bu uçla tek pipeti bir kenara koyun. Çok kanallı bir pipet ve yeni uçlarla, hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için her bir orijinal küme tüpüne 100 mikrolitre CSM ekleyin.

Ucu bir kenara bırakılmış olan tek pipeti kullanarak, 100 mikrolitre artık hacimdeki tüm hücre peletlerini aynı polistiren tüpe aktarın. Polistiren tüpü yaklaşık üç mililitreye kadar tamamlamak için CSM ekleyin. Havuza alınan barkod setinin hücre numarasını sayın ve kaydedin.

Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Barkodlu numuneleri aynı gün boyamaya devam edin. Bu şema, kan örneği alikotlarının tahsisi, stimülasyon ajanlarının eklenmesinin zamanlaması, protein taşıma inhibitörü kokteyli ve kırmızı kan hücresi lizisi ve fiksasyonuna kadar inkübasyon süreleri dahil olmak üzere periferik kan örneklerinin uyarılması ve işlenmesi için iş akışını gösterir.

Uyarıcı ajanların seçimi, değerlendirme için hedeflenen sinyalleme ve sitokin yollarına bağlı olacaktır. Fiksasyon ve RBC lizizini takiben, sağlıklı bir donörden alınan bireysel parçalanmış, sabit hücre örnekleri barkodlandı, yüzey belirteçlerine karşı 26 antikor ile etiketlendi, geçirgen hale getirildi ve sitokinlere karşı 14 antikor ile boyandı. CD14 yüksek monositlerinin tanımlanmasını temsil eden sınırlı geçit stratejisi burada gösterilmiştir.

Soldan sağa, temsil edilen her 2B çizim, 2B çizimden hemen sola doğru geçitli olan üst popülasyondan bir popülasyon alt kümesidir. Sekiz immün hücre alt setinde temsili olarak CD14 yüksek monositleri kullanılarak, sıfır zamanında ve TLR agonisti LPS ve R848 ve T hücresi aktivatörü PMA iyonomisin ile stimülasyonu takiben sağlıklı bir donörden alınan periferik kan örnekleri üzerinde bir kütle sitometrisi analizi yapıldı. CD14 yüksek monositlerinde sitokin indüksiyonunun bir örneği gösterilmiş ve kullanılan uyarıcı ajana özgüllüğü olan seçilmiş sitokinler gösterilmiştir.

R848, CD14 yüksek monositlerinde IL-12p40 alt birimini ve MCP1'i seçici olarak indüklerken, LPS bunu yapmaz. Buna karşılık, PMA iyonomisin CD14 yüksek monositlerinde sitokinleri indüklemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, kan stimülasyonları yaklaşık yedi saat içinde yapılabilir ve barkodlama adımı yaklaşık bir saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, adımların zamanlamasına dikkat etmek ve buna göre önceden plan yapmak önemlidir. Bu prosedürü uyguladıktan sonra, kendi araştırma amaçlarınıza özgü bağışıklık hücresi tepkilerini değerlendirmek için kütle sitometrisi panelindeki kan stimülasyon koşullarını değiştirmeyi düşünebilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, tam kan örneklerinden sitokin yanıtlarının nasıl ortaya çıkarılacağını ve kütle sitometrisi analizi için birden fazla örneğin barkodlu bir sette nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız.