Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi Vibrio parahaemolyticus Ve Diğer Vibrio Türler

Bu prosedürün genel amacı, geleneksel besiyerine kıyasla Vibrio parahaemolyticus'u tespit etme ve izole etme yeteneği için yeni bir kromojenik ortamın duyarlılığını ve özgüllüğünü değerlendirmektir. Bu yöntem, Vibrio türlerinin gıda ve hasat ortamlarındaki yaygınlığı gibi gıda ve çevre mikrobiyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürümüzün temel avantajı, bir gıda matrisinin varlığı da dahil olmak üzere birçok bakteri izolatının kullanılabilmesidir.

Bakterileri kültürlemeden önce, tüm agar ortamını otoklavlayın. Daha sonra agarı bir su banyosunda 45 ila 50 santigrat dereceye kadar soğutun. Agar hazır olduğunda, boş petri plakalarını beş ila altı plakalık yığınlar halinde düzenleyin.

Daha sonra, yığının dibinden başlayarak, erimiş agarı yaklaşık yarısı dolana kadar her bir plakaya dökün ve döktükten sonra kapakları değiştirin. Agarın oda sıcaklığında en az 12 saat katılaşmasına izin verin. Mikrobiyal suş kültürlerini kurmak için, agar hazır olduğunda, kültürleri seçici olmayan uygun agar plakalarına aktarmak için steril bir aşılama halkası kullanın ve bakterileri izole kolonilerin gözlemlenmesine izin verecek bir düzende çizin.

Tüm koloniler kaplandıktan sonra, mikroaerofilik bir ortam oluşturmak için bir gaz torbası içeren kapalı kapaklı bir kavanozda inkübe edilmesi gereken Campylobacter türleri hariç, kültürleri 35 ila 37 santigrat derecede 48 saate kadar baş aşağı inkübe edin. Kuluçka sonunda koloni morfolojisini gözlemleyin. Saf kültürler, benzer bir koloni morfolojisi sergileyen koloniler vermelidir.

Seçici ve diferansiyel ortamlarda ilgilenilen kolonileri büyütmek için, birkaç izole koloniyi uygun et suyunun beş mililitresine aktarın ve kültürleri 35 ila 37 santigrat derecede 16 ila 24 saat boyunca yeniden inkübe edin. Ertesi gün, 35 ila 37 santigrat derecede 96 saate kadar inkübasyon için en az bir Tiyosülfat-Sitrat-Safra-Tuzları-Sükroz veya TCBS, agar plakası ve en az bir kromojenik agar plakası üzerine gece boyunca kültürlerin bir ilmek dolusu çizgisini çizin. Kuluçka süresinin sonunda, suşların genel büyümesini belirlemek için hem plaka üzerindeki kültür yoğunluğunu hem de izole edilen kolonilerin boyutunu inceleyin, kolonilerin rengini uygun şekilde ortam veya UV ışığı altında kaydedin ve kolonilerin diğer önemli özelliklerini not edin.

Bir kurtarma testi yapmak için, genç Vibrio parahaemolyticus kültürlerini yüzde iki sodyum klorür veya TSBS ile takviye edilmiş beş mililitre triptik soya suyuna aşılayın ve tüpleri 16 ila 24 saat boyunca 35 ila 37 santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün, gece boyunca kültürleri girdaplayın ve bir çarpı 10'a negatif olana, bir çarpı 10'a kadar PBS'deki bakterilerin negatif yedi dilüsyonunu ayarlayın. Bir çarpı 10 ila negatif dört ila bir çarpı 10 ila negatif yedi seyreltme kullanarak, her seyreltmenin 100 mikrolitresini ayrı ayrı kromojenik, TCBS ve yüzde iki sodyum klorür agar veya TSAS ile takviye edilmiş triptik soya agar üzerine eşit şekilde plakalayın.

Tüm plakaları 35 ila 37 santigrat derecede 96 saate kadar inkübe edin. Daha sonra, sayılamayacak kadar çok koloni taşıyan veya 25'ten az koloni içeren plakaları göz ardı ederek kolonileri sayın. Bir yarışma testi yapmak için, TCBS'de beklenen turkuaz kolonilerini ve kromojenik agarda camgöbeği kolonilerini ve V olmayan bir V.Parahaemolyticus suşunu seçin.

Her iki ortamda da büyümeyen veya farklı bir koloni rengi sergileyen Parahaemolytius türleri. Bir TSAS tarımından birkaç izole edilmiş V. Parahaemolyticus ve V. Metschnikovii kolonisini, 35 ila 37 santigrat derecede 16 ila 24 saatlik inkübasyon için beş mililitre TSBS'ye aktarın. Beyin Kalp İnfüzyonundan veya BHI, agardan birkaç izole Shigella sonnei kolonisini 35 ila 37 santigrat derecede 16 ila 24 saat boyunca beş mililitre BHI suyuna aktarın.

Ertesi gün, her suş için bir seri seyreltme gerçekleştirin, gece boyunca kültürlerin mililitresi başına koloni oluşturan birimleri belirlemek için seyreltmeleri seçici olmayan agar plakalarına kaplayın. Daha sonra, farklı hacimlerde bir V. Parahaemolyticus suşu ve bir V olmayanı karıştırmak için gece boyunca kültürleri ve seyreltme tüplerini kullanın. Parahaemolyticus türleri ve 100 mikrolitre bakteri karışımını bireysel kromojenik, TCBS ve TSAS agar plakalarına yayın.

35 ila 37 santigrat derecede 96 saate kadar sonra, kolonileri kromojenik ve TCBS plakalarındaki büyüme ve morfoloji farklılıklarına göre sayın. İstiridye homojenatlarının seçici ve diferansiyel ortamlar üzerindeki bakteri üremesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, önce et ve likör dahil olmak üzere en az 12 yumuşakça kabuklu balığından en az 50 gram istiridye eti tartın. Daha sonra istiridye dokularına eşit miktarda PBS ekleyin ve karışımı 90 saniye boyunca yüksek hızda karıştırın.

Daha sonra, 400 gram PBS'ye 100 gram seyreltilmiş istiridye homojenatı ekleyin ve karışımı bir dakika boyunca yüksek hızda karıştırın. Ardından homojenatı otoklavlayın. Soğuduktan sonra, her gece 100 mikrolitre V.Parahaemolyticus ve V olmayan V.

Parahaemolyticus kültürünü istiridye bulamacına ekleyin ve bakteri hücrelerini istiridye homojenatı ile karıştırmak için bir homojenleştirici kullanın. Gösterildiği gibi PBS'de çivili istiridye homojenatının bir çarpı 10 üzeri negatif bire bir çarpı 10 yapın ve her seyreltmenin 100 mikrolitresini ayrı ayrı kromojenik, TCBS ve TSAS plakalarına yayın. 35 ila 37 santigrat derecede 96 saat sonra, kromojenik ve TCBS agarlarındaki gerçek koloni sayımlarını, gece boyunca kültürler üzerinde gerçekleştirilen standart plaka sayımından çıkarılan beklenen koloni sayımlarıyla karşılaştırın.

Bu çalışmada kullanılan suşların büyümesini ve koloni morfolojisini belirlemek için, bakteriler seçici ve diferansiyel ortamlarda büyütüldü. TCBS, turkuaz V. Parahaemolyticus ve sarı V. Cholerae dahil olmak üzere bazı Vibrio türlerinin izolasyonu için kullanılan geleneksel ortamdır. Gıda ve çevresel örneklerden klinik olarak ilgili Vibrio türlerini seçmek için kromojenik ortamın kullanılması, camgöbeği V. Parahaemolyticus ve macenta V. Cholerae'nin üretilmesine neden olur.

İstiridye homojenat varlığında kromojenik agar plakaları üzerinde yetiştirilen V. Parahaemolyticus kolonileri, seçici olmayan ortamdakilere benzer sayılarda gözlenir, bu da kromojenik ortamın tespit sınırının, bir gıda matrisinin varlığında bile seçici olmayan ortamınkine benzer olduğunu düşündürür. V. Parahaemolyticus'un büyümesi ve iyileşmesi, V olmayan bir varlığın varlığından da etkilenmez. Parahaemolyticus türleri, diferansiyel ve seçici ortamlar için önemli bir özelliktir, çünkü çevresel numuneler, özellikle bir zenginleştirme prosedüründen sonra, yüksek sayılarda çeşitli Vibrio türleri içerir.

Ayrıca, TCBS ve kromojenik agarların termolabil hemolizin PCR ile karşılaştırılması, kromojenik agar için daha yüksek bir duyarlılık ve özgüllük ortaya koymaktadır, bu da V. Parahaemolyticus'u tespit etmek ve tanımlamak için bu diferansiyel ve seçici ortam için genel olarak daha iyi bir performans olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yaklaşık 50 suşun test ve inkübasyon süreleri de dahil olmak üzere tüm prosedür, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde 30 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, tüm kültürleri özenle etiketlemeyi ve her zaman aseptik tekniği kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, aşağıdaki gibi ek soruları yanıtlamak için koloni PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir: Bu spesifik izolat bir virülans geni taşıyor mu? Geliştirilmesinden sonra bu teknik, gıda güvenliği ve halk sağlığı alanındaki araştırmacıların kabuklu deniz hayvanlarında ve nehir ağzı ortamında Vibrio türlerinin tespitini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, standart bir plaka sayımının nasıl yapılacağını ve bir büyüme ortamının duyarlılığını, özgüllüğünü ve tespit sınırını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Patojenler ve sıcak ortamla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu giysi giymek, açık yaraları örtmek ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları ayırmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.