Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir kromojenik besiyerinin Vibrio parahaemolyticus'u tespit etme ve izole etme yeteneğinin, geleneksel besiyerleri ile karşılaştırılarak duyarlılık ve özgüllüğünün değerlendirilmesidir. Bu yöntem, gıda ve çevresel mikrobiyoloji alanındaki "gıda ve hasat ortamlarında Vibrio türlerinin yaygınlığı nedir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürümüzün temel avantajı, gıda matrisi varlığındakiler de dahil olmak üzere birçok bakteriyel izolatın kullanılabilmesidir.

Bakterileri kültüre etmeden önce, tüm agar medyalarını otoklavlayın. Ardından agarı bir su banyosunda 45 ila 50 °C'ye soğutun. Agar hazır olduğunda, boş petri plaklarını beşli veya altılı yığınlar halinde düzenleyin.

Ardından, yığının altından başlayarak, eritilmiş agarı her bir plak yaklaşık yarıya dolana kadar dökün ve dökme işleminden sonra kapakları kapatın. Agarın oda sıcaklığında en az 12 saat boyunca katılaşmasını bekleyin. Mikrobiyal suş kültürlerini hazırlamak için, agar hazır olduğunda, kültürleri uygun seçici olmayan agar plakalara aktarmak üzere steril bir ekim özesi kullanın ve bakterileri izole kolonilerin gözlemlenmesine izin verecek bir düzenle çizin.

Tüm koloniler ekildikten sonra, mikroaerofilik bir ortam oluşturmak için gaz paketi içeren kapalı kapaklı bir kavanozda inkübe edilmesi gereken Campylobacter türleri hariç, kültürleri 35 ila 37 °C'de baş aşağı şekilde 48 saate kadar inkübe edin. İnkübasyon sonunda koloni morfolojisini gözlemleyin. Saf kültürler, benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler vermelidir.

İlgilenilen kolonileri seçici ve ayırıcı besiyerlerinde büyütmek için, birkaç izole koloniyi beş mililitre uygun besiyerine aktarın ve kültürleri 35 ila 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca yeniden inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu büyütülen kültürlerden bir öze yardımıyla alınan örneği, en az bir Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose (TCBS) agar plakasına ve en az bir kromojenik agar plakasına ekerek 35 ila 37 °C'de 96 saate kadar inkübe edin. İnkübasyon sonunda, suşların genel büyümesini belirlemek için plaktaki kültür yoğunluğunu ve izole kolonilerin boyutunu inceleyin; kolonilerin rengini duruma göre ortam ışığı veya UV ışığı altında kaydedin ve kolonilerin diğer önemli özelliklerini not edin.

Bir geri kazanım testi gerçekleştirmek için, Vibrio parahaemolyticus'un genç kültürlerini, yüzde iki sodyum klorür ile desteklenmiş beş mililitre triptik soya brotu (TSBS) içine inoküle edin ve tüpleri 35 ila 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca bekletin. Ertesi gün, gece boyunca inkübe edilen kültürleri vorteksleyin ve bakterilerin PBS içinde 1 × 10⁻¹ ile 1 × 10⁻⁷ arasındaki dilüsyonalarını hazırlayın. 1 × 10⁻⁴ ile 1 × 10⁻⁷ arasındaki dilüsyonları kullanarak, her bir dilüsyondan 100 µL'yi sırasıyla ayrı kromojenik, TCBS ve yüzde iki sodyum klorür ile desteklenmiş triptik soya agar (TSAS) plaklarına eşit şekilde ekleyin.

Tüm plakaları 35 ila 37 °C'de 96 saate kadar inkübe edin. Ardından, sayılamayacak kadar çok koloni içeren veya 25'ten az koloni barındıran plakaları dikkate almadan kolonileri sayın. Bir rekabet analizi gerçekleştirmek için, TCBS'de beklenen turkuaz kolonileri ve kromojenik agarda siyan kolonileri veren bir V.Parahaemolyticus suşu ve bir V. dışı

Her iki besiyerinde de büyümeyen veya farklı koloni rengi sergileyen Parahaemolytius türleri. İzole edilmiş birkaç V.Parahaemolyticus ve V.Metschnikovii kolonisini TSAS agarından, 35 ila 37 °C'de 16 ila 24 saatlik inkübasyon için beş mililitre TSBS'ye aktarın. İzole edilmiş birkaç Shigella sonnei kolonisini Brain Heart Infusion veya BHI agarından, 35 ila 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca beş mililitre BHI broth'a aktarın.

Ertesi gün, gece boyu inkübe edilen kültürlerin mililitre başına koloni oluşturan birimlerini belirlemek için her suş için seri dilüsyon uygulayın ve dilüsyonları seçici olmayan agar plaklarına ekin. Ardından, bir V.Parahaemolyticus suşu ile V. Parahaemolyticus olmayan bir türün farklı hacimlerini karıştırmak için gece boyu inkübe edilen kültürleri ve dilüsyon tüplerini kullanın ve bakteri karışımının 100 µL'sini ayrı kromojenik, TCBS ve TSAS agar plaklarına yayın.

35 ila 37 derece Celsius'ta 96 saate kadar bekledikten sonra, kromojenik ve TCBS plakalarındaki büyüme ve morfoloji farklılıklarına göre kolonileri sayın. İstiridye homojenatlarının seçici ve ayırıcı besiyerlerinde bakteriyel büyüme üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, önce et ve sıvısı dahil olmak üzere en az 12 molluska kabuklu deniz canlısından en az 50 gram istiridye eti tartın. Ardından, istiridye dokularına eşit kütlede PBS ekleyin ve karışımı 90 saniye boyunca yüksek hızda karıştırın.

Ardından, seyreltilmiş istiridye homojenatının 100 gramını 400 gram PBS'ye ekleyin ve karışımı bir dakika boyunca yüksek hızda karıştırın. Daha sonra homojenatı otoklavlayın. Soğuduktan sonra, gece boyunca inkübe edilmiş her bir V.Parahaemolyticus ve non-V örneğinden 100 mikrolitre ekleyin.

Parahaemolyticus kültürünü istiridye bulamacına ekleyin ve bakteri hücrelerini istiridye homojenatıyla karıştırmak için bir homojenizatör kullanın. Gösterildiği gibi, PBS içerisinde ekleme yapılmış istiridye homojenatının 1x10⁻¹ ile 1x10⁻³ arası dilüsyonlarını hazırlayın ve her dilüsyondan 100 µL'yi ayrı kromojenik, TCBS ve TSAS plaklarına yayın. 35 ila 37 °C'de 96 saat beklettikten sonra, kromojenik ve TCBS agarları üzerindeki gerçek koloni sayılarını, gece boyu inkübe edilen kültürlerde gerçekleştirilen standart plak sayımından elde edilen beklenen koloni sayılarıyla karşılaştırın.

Bu çalışmada kullanılan suşların büyümesini ve koloni morfolojisini belirlemek için bakteriler seçici ve ayırıcı besiyerlerinde büyütülmüştür. TCBS, turkuaz renkli V.Parahaemolyticus ve sarı renkli V.Cholerae dahil olmak üzere bazı Vibrio türlerinin izolasyonu için kullanılan geleneksel besiyeridir. Gıda ve çevre örneklerinden klinik olarak ilgili Vibrio türlerini seçmek için kromojenik besiyeri kullanımı, siyan renkli V.Parahaemolyticus ve magenta renkli V.Cholerae oluşumuyla sonuçlanır.

İstiridye homogenatı varlığında kromojenik agar plaklarında büyütülen V.Parahaemolyticus kolonileri, seçici olmayan besiyerlerindekiyle benzer sayılarda gözlemlenmiştir; bu durum, kromojenik besiyerinin saptama sınırının, gıda matriksi varlığında bile seçici olmayan besiyerlerininkine benzer olduğunu göstermektedir. Ayrıca, V.Parahaemolyticus'un büyümesi ve geri kazanımı, V. Parahaemolyticus dışındaki türlerin varlığından etkilenmemektedir; bu durum, özellikle bir zenginleştirme prosedüründen sonra çevresel örneklerin yüksek sayılarda çeşitli Vibrio türleri içermesi nedeniyle, ayırıcı ve seçici besiyerleri için temel bir özelliktir.

Ayrıca, TCBS ve kromojenik agarların termolabil hemolizin PCR ile karşılaştırılması, kromojenik agar için daha yüksek bir hassasiyet ve özgünlük ortaya koymakta; bu durum, V.Parahaemolyticus'un saptanması ve tanımlanması için bu diferansiyel ve selektif besiyerinin genel olarak daha iyi bir performans sergilediğini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, yaklaşık 50 suşun test ve inkübasyon süreleri dahil olmak üzere tüm prosedürü, uygun şekilde yürütüldüğünde 30 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tüm kültürlerin titizlikle etiketlendiğini hatırlamak ve her zaman aseptik teknik kullanmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, "Bu spesifik izolat bir virülans geni taşıyor mu?" gibi ek soruları yanıtlamak için koloni PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gıda güvenliği ve halk sağlığı alanındaki araştırmacıların kabuklu deniz ürünlerinde ve haliç ortamında Vibrio türlerinin tespitini araştirmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, standart bir plak sayımının nasıl yapılacağı ile bir besiyerinin hassasiyetinin, özgüllüğünün ve tespit limitinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Patojenlerle ve sıcak besiyeriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu kıyafet giymek, açık yaraları kapatmak ve biyotehlikeli atıkları ayırmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.