Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Protokolümüz, RNA izolasyonuna ihtiyaç duymadan RT-qPCR verilerini doğrudan tek veya küçük toplu numunelerden elde etmek için hem verimi hem de zaman verimliliğini artırdı. Bu protokolü kullanarak, standart 96 kuyulu qPCR kullanılarak tipik olarak yaklaşık beş hafta sürecek bir süreç olan sadece iki günlük tezgah çalışmasında 9.000'den fazla RT-qPCR sonucu elde edilebilir. Bu protokol, izojenik solucanlar arasındaki gen ekspresyonundaki bireyler arası değişkenliği izlemek için ideal olan C.elegans'ta daha hızlı, sağlam ve oldukça hassas bir RT-qPCR testi sağlar.

Solucanları bakteri çimlerinden taze tohumlanmamış nematod büyüme ortamı plakasına toplayarak ve solucanların plakanın etrafında beş dakika hareket etmesine izin vererek başlayın. Solucanlar iklimlenirken, RNaz içermeyen bir başlıkta, 10 mikrolitre lizis tamponunu numune başına bir ila 100 Dnase I ile karıştırın ve bir PCR şeridinin kapağını bir diseksiyon dürbünü platformuna baş aşağı yerleştirin. Daha sonra, kubbeli PCR tüp kapaklarına 10 mikrolitre lizis karışımı ekleyin ve kapağın her bir yuvasına bakteri bulaşmasını önlemek için solucanları plakadan alın.

Tüm solucanlar transfer edildiğinde, kapakları kapatın ve tüpleri bir Dewar sıvı nitrojen şişesine yerleştirmeden önce tüpleri beş saniye döndürün. Son beş saniyeden sonra, dondurma / çözme prosedürünü dokuz kez daha tekrarlamadan önce tüpleri 40 santigrat derece su banyosunda çözdürün. Son donma/çözülme döngüsünden sonra, parçalanmış numuneleri bir termal karıştırıcı üzerinde dört santigrat derecede ve dakikada yaklaşık 1800 devirde 20 ila 30 dakika karıştırın.

Karıştırma inkübasyonunun sonunda, numuneleri gösterildiği gibi döndürün ve her tüpe bir mikrolitre taze çözülmüş durdurma çözeltisi ekleyin. Yığın sıcak numunelerin ters transkripsiyonu için, RNaz içermeyen bir başlıkta, bir enzim tampon ana karışımı hazırlayın ve her numunenin 11 mikrolitresine 14 mikrolitre ana karışım ekleyin. Numuneleri, belirtilen ters transkripsiyon programını kullanarak bir termodöngüleyiciden geçirin ve elde edilen cDNA ürününü nükleaz içermeyen suda bir ila dört oranında seyreltin.

Hedefe özgü preamplifikasyon için, 96 oyuklu bir plakada numune başına bir oyuğa 3,75 mikrolitre preamplifikasyon ana karışımı ekleyin ve ana karışımın her bir oyuğuna her bir cDNA çözeltisinden 1,25 mikrolitre ekleyin. Tüm numuneler yüklendiğinde, plakayı sızdırmazlık bandı ile örtün ve numuneleri santrifüjleme ile döndürmeden önce kısa bir süre vorteksleyin, ardından plakayı bir termodöngüleyiciye yükleyin ve programı belirtildiği gibi çalıştırın. Dahil edilmemiş primerleri ön amplifikasyondan çıkarmak için, termosiklasyonun sonunda numune plakasını santrifüjleyin ve contayı dikkatlice çıkarın.

Her bir ön amplifikasyon reaksiyonuna iki mikrolitre eksonükleaz I ana karışımı ekleyin ve yeniden kapatın, santrifüjleyin ve plakayı tekrar termocycler'a yükleyin. Döngünün sonunda, numuneleri 18 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile seyreltin. Çok dizili bir çip kurmak için, 384 oyuklu bir plakada numune başına bir oyuklu içine 3,6 mikrolitre tahlil yükleme ana karışımı ve 0,4 mikrolitre 50 mikromolar ileri ters astar ekleyin.

Daha sonra 2.2 mikrolitre numune ana karışımı ve 1.8 mikrolitre önceden amplifiye edilmiş eksonükleaz I ile muamele edilmiş numuneyi plakanın uygun kuyucuklarına ekleyin. Tek dizili bir çip kurmak için, ikinci bir 384 oyuklu plakanın numunesi başına bir oyuka 5,4 mikrolitre tahlil yükleme ana karışımı ve 0,6 mikrolitre ileri ters astar ekleyin, ardından 3,3 mikrolitre numune ana karışımı ve 2,7 mikrolitre önceden amplifiye edilmiş eksonükleaz I ile muamele edilmiş numuneyi hazırlanan tek dizili plakanın uygun kuyucuklarına ekleyin. Nanoakışkan çipi ilk çalıştırma için astarlamak için, çipi 45 derecelik bir açıyla yavaşça ve dikkatlice 150 mikrolitre kontrol hattı sıvısını çipin akümülatörlerine enjekte edin.

Sıvının tamamı yüklendiğinde, çipin altındaki mavi koruyucu filmi çıkarın ve çipi, barkod dışa bakacak şekilde nanoakışkan PCR hazırlama makinesine yerleştirin. Ardından Prime(153x) komut dosyasını çalıştırın. Astarlamadan sonra, çipi karanlık bir yüzeye yerleştirin ve her bir tahlil veya bir numune karışımı yüklenirken, gerekirse ilgili bariyer tapalarını çıkarın ve deney planına göre nanoakışkan çipin ilgili girişlerine uygun hacimde tahlil veya numune karışımı ekleyin.

Yüklemeden sonra, çipi nanoakışkan termocycler'a yerleştirin ve veri toplama yazılımında uygun protokolü çalıştırın. Çok dizili yonganın tamamı kullanılmıyorsa, kalan yonga dizilerinin aşağı akış kullanımına izin vermek için bir komut dosyası sonrası çalıştırması gerçekleştirin. Solucan-Ct protokolünün geçerli bir cDNA ekstraksiyon yöntemi olup olmadığını test etmek için, yöntem standart guanidyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldı.

Küresel olarak, 100 nanogram toplam RNA başına hsp-70 mRNA ekspresyon seviyeleri, hem fenol-kloroform hem de solucan-Ct yöntemleri kullanılarak karşılaştırılabilirdi. Bununla birlikte, en yüksek hsp-70 ekspresyonu durumlarında, ekspresyon solucan-Ct yöntemiyle daha yüksekti ve bu da gelişmiş bir duyarlılığı gösteriyordu. Toplu numunelerin guanidyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu için, hsp-70, kontrollere kıyasla hsf-1 mutantlarında 82.7 ve sıcak-CT için% 92.3 azalmıştır, bu da azalmanın iki yöntem arasında karşılaştırılabilir olduğunu gösterir.

Yöntemler, 25 solucanın toplu örneklerinden veya ortalama 36 tek solucan örneğinden elde edilen cDNA'yı kullanarak, test edilen tüm şaperonlar için karşılaştırılabilir ekspresyon seviyeleri tespit etti ve bu da tek solucanlardan elde edilen parametrelerin güvenilir olduğunu gösterdi. Burada, kısa bir ısı şokunu takiben tek solucanlardan elde edilen çoklu hsp transkriptlerinin ortalama ifadesi gösterilmektedir. Gözlemlendiği gibi, transkriptlerin ekspresyonundaki değişkenlik, farklı genler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir.

Tek solucan örnekleri kullanılarak test edilen her transkript için, teknik değişkenlik katsayıları biyolojik değişkenlik katsayılarından daha düşüktü, bu da tek solucanlar üzerinde qPCR gerçekleştirildiğinde parametre tahmini için teknik üçlülerin gerekli olmadığını gösteriyor. Bu protokolü gerçekleştirirken, küçük hacimleri doğru bir şekilde pipetlemek ve nanoakışkan çipe ters pipetlememek önemlidir. Bu protokol, daha sonra Excel veya R komut dosyaları kullanılarak istenildiği gibi dışa aktarılabilen ve işlenebilen büyük RT-qPCR veri kümeleri elde etmek için kullanılabilir.