Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Bu deneyin genel amacı, tek hücrelerde çoklu gen ekspresyonunu gözlemlemektir. Bu yöntem, bir hücre popülasyonu içindeki moleküler imzaların heterojenliği veya nadir bir moleküler imza gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, en az 48 farklı gene sahip spesifik moleküler imzaların aynı anda birçok hücrede değerlendirilebilmesidir.

Bu prosedüre, 1.5 mililitrelik bir tüpte 48 reaksiyon için bir ön amplifikasyon karışımı hazırlayarak başlayın. Tüpe 240 mikrolitre spesifik retrotranskripsiyon tamponu, 62.4 mikrolitre düşük EDTA'lı TE tamponu ve 9.6 mikrolitre Taq DNA polimeraz ekleyin. Elektronik bir pipet kullanarak, 6.5 oyuklu, tek hücreli bir plakada 48 kuyucuğun her birine 96 mikrolitre ön amplifikasyon karışımı dağıtın.

Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir tüpte 0,2x'lik bir tahlil karışımı hazırlayın. Tüpe her astardan 1.4 mikrolitre ekleyin. Düşük EDTA TE tamponu ile son hacmi 140 mikrolitreye ayarlayın.

Elektronik bir pipet kullanarak, 0,2x tahlil karışımının 2,5 mikrolitresini, ön amplifikasyon karışımını içeren 96 oyuklu, tek hücreli ayırma plakasındaki 48 oyuğa dağıtın. Plakayı bir kapak filmi ile kapatın. Plakayı girdaplayın ve bir dakika boyunca 280 kez g'de döndürün.

Tek hepatik doğuştan gelen lenfoid hücreler veya ILC'ler, floresanla aktive edilen hücre sıralaması ile sıralanacaktır. Test olarak 96 oyuklu boş bir plaka kullanarak bu prosedüre başlayın. Test plakasını, bir kuyucuk solda ve deneyciye doğru olacak şekilde plaka tutucusuna yerleştirin.

Doğrulama boncukları ile bir kuyunun ortasında bir damla elde etmek için plaka tutucuyu ayarlayın. Düzgün bir şekilde ayarlandığında, tahlil karışımını ve ön amplifikasyonu içeren 96 oyuklu, tek hücreli ayırma plakasını plaka tutucusuna yerleştirin. Plaka düzenini çizin ve kapılı popülasyonun her kuyusu için bir hücreyi sıralayın.

Her hücrenin 96 kuyucuklu, tek hücreli sıralama plakası üzerinde uygun şekilde konumlandırılması esastır ve bir plaka düzeni bir elektronik tablo yazılımında tutulmalıdır. Girişsiz kontrol olarak hücresiz 0.2x tahlil karışımı ve ön amplifikasyon karışımı içeren bir kuyu bırakın. İsteğe bağlı olarak, primer verimliliği için kontroller olarak cDNA seyreltmesi için altı kuyudan oluşan iki sıra bırakın.

Tek hücreli sıralamadan hemen sonra, 96 oyuklu, tek hücreli ayırma plakasını girdap haline getirin ve aşağı doğru döndürün. Plakayı termocycler'a yerleştirin. Belirtildiği gibi ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon gerçekleştirin.

Yeterli materyale sahip olmak için sıralanmış tek hücreler üzerinde spesifik hedef genlerin önceden amplifikasyonu gereklidir. Her bir oyuğa 36 mikrolitre düşük EDTA'lı TE tamponu ekleyerek önceden amplifiye edilmiş numuneleri seyreltin. Bu prosedüre başlamak için, 175 mikrolitre qPCR Master Mix ve 17,5 mikrolitre numune yükleme reaktifini 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyerek 191 mikrolitre Master Mix hazırlayın.

96 oyuklu yeni bir plakada, 48 oyuğun her birine 3,6 mikrolitre Master Mix dağıtın. Bu 96 oyuklu numune plakasıdır. 2,9 mikrolitre önceden amplifiye edilmiş cDNA'yı 96 oyuklu, tek hücreli ayırma plakasından yeni 96 oyuklu numune plakasına aktarın ve iki plaka arasındaki her numune için aynı konumu koruyun.

Yeni bir 96 oyuklu plaka üzerinde 48 oyuğun her birine üç mikrolitre tahlil yükleme reaktifi dağıtarak 96 oyuklu bir tahlil plakası hazırlayın. Her kuyucuğa üç mikrolitre astar ekleyin. 96 oyuklu tahlil plakasındaki her bir astarın uygun şekilde konumlandırılması çok önemlidir.

Bir elektronik tablo yazılımında bir plaka düzeni tutun. Bu prosedüre başlamak için, entegre mikroakışkan devresini veya IFC'yi tezgahın üzerine yerleştirin ve bir şırınga kullanarak valfleri kontrol edin. Şırınganın kapağını çıkarın, bir valfe dik olarak yerleştirin ve sıkıca bastırın.

O-ring hareket etmelidir. Çipi kontrol hattı sıvısıyla doldurun. İkinci valf ile önceki adımları tekrarladıktan sonra, siyah filmi çipin altından çıkarın.

Çipi IFC denetleyicisine yükleyin. IFC denetleyicisi ekranında Prime'ı seçin ve ardından çalıştırın. Ardından, çipi çıkarın ve çipin altındaki siyah filmi tekrar kapatın.

Sekiz kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu tahlil plakasından beş mikrolitreyi çipin bir veya sol tarafına aktarın. Çipin her bir kuyucuğu için uçları değiştirin. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının ve kabarcıklar ortaya çıkarsa, bunları çıkarmak için 10 mikrolitrelik uçlar kullanın.

Çipin sol tarafını belirtildiği gibi doldurun. Aynı şekilde, 96 oyuklu numune plakasından beş mikrolitre kullanarak çipin sağ tarafını doldurun. Bu deneyin başarısı için, IFC çipinin IFC kontrolörüne uygun şekilde yüklenmesi için uygun şekilde doldurulması önemlidir.

Çipin altındaki mavi filmi çıkarın ve çipi IFC denetleyicisine yükleyin. IFC denetleyicisi ekranında, yük karışımını seçin ve ardından çalıştırın. Tamamlandığında, çipi çıkarın ve çipin altındaki mavi filmi yeniden kapatın.

Çipi çalıştırmak için önce mikroakışkan qPCR bilgisayarında veri toplama yazılımını seçin. Başladıktan sonra yeni çalıştırma'yı seçin. Çipi çıkarın, çıkarın ve yükleyin.

Yazılımı metin protokolünde açıklandığı gibi kurduktan sonra, çalıştırmayı başlat'ı seçin. Reaksiyon yaklaşık 90 dakika sürecektir. Veri analizine başlamak için gerçek zamanlı PCR analiz yazılımını açın, dosyayı seçin ve açın, deney klasörünü bulun ve chip run dot b m one dosyasını seçin.

Analiz görünümüne, sonuç tablosuna ve ısı haritası görünümüne tıklayın. X ile işaretlenmiş kutular eşik algılama seviyesinin altındadır ve/veya kötü amplifikasyon eğrilerine sahiptir. Örnekleri adlandırın.

Örnek kurulumuna gidin ve yeni SBS 96'yı seçin. Haritalamaya tıklayın ve 96 kuyulu numune plakası düzenine göre numune düzenini seçin. Elektronik tablo yazılımından örnek düzen tasarımını kopyalayıp yapıştırın.

Yapıştırılan düzeni örnek adı olarak tanımlayın. Tahlilleri adlandırmak için aynı prosedürü kullanın. Dedektör kurulumuna astar adlarını girin ve yapıştırılan düzeni dedektör adı olarak tanımlayın.

Analiz görünümüne tıklayın ve analiz edin. Dosyayı seçin, dışa aktarın ve ısı haritası sonuçları olarak kaydedin. Akış sitometrisi kullanılarak, hepatik ILC popülasyonları, yaygın olarak eksprese edilen ILC belirteçlerine göre sıralandı ve üç farklı popülasyon tanımlandı.

Düzgün yüklenmiş tek hücreli, multipleks gen ekspresyon çipi, her reaksiyon odası dolu ve aynı boyutta olacak şekilde düz çizgiler ve sıralarla görünmelidir. Yanlış yüklenmiş bir çip, boş hatlara ve reaksiyon odası sıralarına ve ayrıca bükme hatlarına sahip olacaktır. Düzgün yüklenmiş bir çipin bu floresein amid figürü, birkaç döngüden sonra ortaya çıkan reaksiyon odası parlaklığındaki farklılıkları gösterir.

Amplifikasyon sinyaline sahip reaksiyon odaları, amplifikasyon sinyali olmayan veya düşük amplifikasyon sinyaline sahip reaksiyon odalarından daha parlak görünür. Uygun hücre sıralaması, ön amplifikasyon ve yüklemeden sonra, ILC popülasyonu yetişkin, vahşi tip farelerin karaciğerinde gen ekspresyonu için heterojen göründü. Solda, değişiklik yapılmamış bir ısı haritası var.

Sağ tarafta, numune ve tahlil adı tanımlamasından sonra elde edilen modifiye edilmiş ısı haritası yer almaktadır. Çevrimiçi yazılım kullanılarak, hücreye özgü gen ekspresyon imzaları ve hücre popülasyonu ilişkileri tanımlandı. Her çizgi bir geni temsil eder ve her satır aynı hücreyi temsil eder ve üç hücre popülasyonu mavi, kırmızı ve yeşil renkle temsil edilir.

Bir ustalaşan bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dokuz saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücre ve astar dağılımları için plakanın yönünü dikkatlice takip etmek önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacının hücre popülasyonlarındaki nadir ve spesifik moleküler imzaları keşfetmesinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, uygun hücre sıralaması, ön amplifikasyon ve yüklemeden sonra aynı anda birçok tek hücrede çoklu gen ekspresyonunun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.