İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Bu prosedürün genel amacı, dahili standartlara sahip mikroakışkan qPCR kullanarak tek tek hücrelerdeki mRNA seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, tek hücre biyolojisi alanında, hücrelerin hücre popülasyonlarının bir uyarana karakteristik olarak farklı şekillerde tepki verip vermediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerde RNA-Seq'ten daha düşük bir maliyetle RNA FISH'ten daha fazla genin ekspresyonunu ölçebilmesidir.

Bu yöntem için ilk olarak, mikroakışkan qPCR ile tek hücrelerde gen ekspresyonunu ölçmek için protokolleri araştırırken aklımıza geldi. Tek hücrelerdeki farklı transkriptlerin mutlak sayısını daha doğru bir şekilde tahmin etmek için mevcut yöntemleri değiştirmek istedik. Hücre sıralama prosedürünü gösteren, laboratuvarım tarafından kullanılan akış sitometrisi tesisinin yöneticisi William Telford olacak.

Metin protokolüne göre ilgilenilen genlerden amplikonlar ürettikten ve saflaştırdıktan sonra, her saflaştırılmış amplikonun 18 mikrolitresini 2.0 mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin, daha sonra 1.800 mikrolitreye kadar DNA süspansiyon tamponu ekleyin, böylece her amplikonun konsantrasyonu beş kez 10 ila altıncı molekül mikrolitre başına olur. 5e6 standardını iyice girdap haline getirin ve düşük bağlayıcı PCR tüplerinde 20 mikrolitrelik alikotlara bölün. MCF7 p53-Venüs hücrelerini metin protokolüne göre kapladıktan sonra, hücrelere mililitre başına 400 nanogram neokarzinostatin ekleyin ve üç, 8.5, 14 veya 24 saat boyunca tedavi edin.

Lizis tamponu yapmak için bu tabloda listelenen reaktifleri birleştirin. Amplikon standartları için lizis tamponu olarak hizmet etmek üzere 92.4 mikrolitre tamponu ayrı bir tüpe aktarın. Kalan lizis tamponu hücreler için olacaktır.

Metin protokolüne göre hücreler için lizis tamponuna E.coli DNA'sını hazırlayın ve ekleyin. Standartları hazırlamak için altı düşük bağlayıcı santrifüj tüpünü etiketleyin. 5e5 tüpüne 90 mikrolitre DNA süspansiyon tamponu ekleyin.

Diğer beş tüpün her birine mikrolitre E.coli DNA'sı başına 6.2 pikogram içeren 90 mikrolitre tampon ekleyin ve tüm tüpleri buz üzerinde tutun. 5e6 standardının bir alikotunu depodan çıkardıktan sonra, tüpü kısaca girdaplayın, ardından sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için döndürün, ardından düşük bağlayıcı bir pipet ucu kullanarak, 5e5 tüpüne 10 mikrolitre 5e6 standardı ekleyin. Girdap, döndürün ve tüpü tekrar buzun üzerine koyun.

Daha sonra, 5e5 tüpünden 5e4 tüpüne 10 mikrolitre pipetleyin, ardından tüpü kısaca girdaplayın, döndürün ve tüpü tekrar buzun üzerine koyun. Tüm tüpler standart bir seyreltme elde edene kadar önceki tüpten 10 mikrolitre alarak her tüple seri seyreltmeleri tekrarlayın. Lizis tamponlu PCR tüplerini hazırladıktan sonra, 12 kanallı bir pipet kullanarak, PCR tüpleri sırasından dokuz mikrolitre hücre lizis tamponunu bir PCR plakasının ilk yedi sırasının her bir oyuğuna dağıtın.

Plakanın son sırasının her bir oyuğuna yedi mikrolitre standart lizis tamponu dağıtın, ardından düşük bağlayıcı pipet uçları kullanarak, plaka haritasına göre alt sıranın her bir oyuğuna iki mikrolitre standart ekleyin. 10 hücre ve 100 hücre kuyucuğuna mikrolitre E.coli DNA başına iki mikrolitre 3.1 pikogram ekleyin, daha sonra mikrolitre E.coli DNA'sı başına iki mikrolitre 6.2 pikogram ekleyin. Floresanla aktive edilmiş hücre sıralayıcıyı, plaka haritasına göre 96 oyuklu bir plakaya sıralamak üzere programladıktan sonra, makineyi hedeflemek için boş bir PCR plakasını kapatın ve damlacıkları ve PBS'yi boş plakanın contasına sıralamak için test akışını kullanın.

Damlacıklar doğru konuma düşmezse, bunları contanın yüzeyinden silin, hücre sıralayıcıyı makine üreticisinin talimatlarına göre yeniden kalibre edin ve sıralama akışındaki damlacıklar doğru şekilde birikene kadar tekrarlayın. Hücreleri tripsinizasyon ile hasat edin ve% 2 FBS ile 0.5 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin, daha sonra bir akış sitometri tüpüne aktarın. Hücreleri sıralamak için, hücre süspansiyonlu tüpü hücre sıralayıcıya yerleştirin, lizis tamponu plakasındaki contayı açın ve ilgilenilen hücreleri plaka haritasına göre plakaya dikkatlice sıralayın.

Tek hücrelerin maksimum saflıkta sıralandığından emin olmak için, makineyi tek hücre modunda çalıştırın ve ileri ve yan saçılmaya dayalı standart akış sitometrisi geçitini kullanın. Çalıştırmanın ardından, plakayı kapatmak için yeni bir steril termal conta kullanın ve bir dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin, ardından plakayı termal döngüleyiciye yerleştirin ve önceden hazırlanmış RT-STA programını çalıştırın. Tamamlanmış RT-STA plakasını döndürdükten sonra, plakanın her bir oyuğuna 3,6 mikrolitre seyreltik eksonükleaz I dağıtmak için 12 kanallı bir pipet kullanın.

Plakayı kapatın ve kısa bir süre döndürün, ardından plakayı termal döngüleyiciye yerleştirin ve exo I programını çalıştırın. Her bir numunedeki temizlik gen ekspresyonunu ölçmek için, seçilen temizlik genlerinden birinden primerler kullanarak 96 reaksiyon için 900 mikrolitre DNA bağlayıcı boya qPCR ana karışımı hazırlayın. 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna dokuz mikrolitre ana karışım dağıtın, ardından numune plakasından PCR plakasının ilgili oyuğuna bir mikrolitre numune ekleyin.

Ana karışım üreticisi tarafından önerilen bir termal döngü protokolünü kullanarak veya standart bir protokolü izleyerek plakayı gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın, ardından numuneleri analiz edin ve metin protokolüne göre bir numune karışım plakası haritası yapın. Bir plaka numune karışımlarını etiketleyin ve ardından sekiz kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 3,3 mikrolitre ana karışım numune yükleme reaktif karışımını dağıtın. Numunelerin her bir PCR plakası için, plakayı 10 saniye boyunca girdaplayın ve 10 saniye boyunca 500 kez g'de döndürün.

Kapağı çıkarın ve her bir pozitif tek hücreli numunenin 2.7 mikrolitresini, plaka haritasında belirtilen tek hücreli kuyucuklar için numune karıştırma plakasındaki karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Yeni bir mikroakışkan qPCR çipinin altındaki etiketi soyun, ardından kapak hala açıkken bir kontrol hattı sıvısı şırıngası kullanarak, gevşetmek için her bir akümülatör yayını aşağı doğru itin ve her akümülatöre 100 ila 200 mikrolitre kontrol hattı sıvısı enjekte edin. Çipi yükleme makinesine yerleştirin ve ana komut dosyasını çalıştırın, ardından sekiz kanallı bir pipet kullanarak, her bir tahlil karışımından 4,5 mikrolitreyi mikroakışkan qPCR çipinin sol tarafına aktarın.

Kuyuların dibinde hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmak çok önemlidir. Bu, yükleme sorunları yaratacaktır. Bunu önlemek için, pipet uçlarını kuyunun yan tarafına dokundurun, ardından yalnızca ilk durağa kadar pipetleyin.

Her numune karışımından 4,5 mikrolitreyi mikroakışkan qPCR çipinin sağ tarafına aktarın, ardından çipi yükleme makinesine yerleştirin ve yük karışımı komut dosyasını çalıştırın. Yük karışımı komut dosyası tamamlandığında, çip boyunca bir yükleme sorununa işaret edecek hiçbir çizgi olmadığını doğrulayın, ardından çipteki toz parçacıklarını dikkatlice çıkarmak için bant kullanın, ardından çipi mikroakışkan gerçek zamanlı PCR makinesine yerleştirin ve veri toplama komut dosyasını çalıştırın. Son olarak, verileri metin protokolüne göre analiz edin.

Bu şekil, hangi kuyucukların tek bir hücre aldığını belirlemek için qPCR ile ölçülen bir temizlik geninin ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Bir hücre alan numuneler düşük CT değerlerine sahiptir. Hücresiz numuneler çok daha yüksek CT değerlerine sahiptir.

Amplikon standardı için kuyucuklar, eşit aralıklı amplifikasyon eğrileri göstermelidir. Hücresiz, 10 hücreli ve 100 hücreli kuyular için eğrilerde de net bir ayrım olmalıdır. Gerçek hücreleri temsil eden tohum DNA örnekleri, birden fazla sıralanmış 96 oyuklu plakadan kiraz toplanır ve mikroakışkan qPCR'ye hazırlanmak için tek bir plakada birleştirilir.

Bu ısı haritası, mikroakışkan qPCR sonuçlarını özetlemektedir. Her sütundaki renk değişimi, farklı hücreler arasındaki her bir genin ifadesindeki değişkenliği gösterir. Diğerlerinden çok daha koyu olan iki satır, büyük olasılıkla kötü örnekleri temsil eder.

Bu prosedürü denerken, özellikle standartları ve lizis tamponunu yaparken, çalışma alanınızı RNaz ve DNA içermez durumda tutmanız önemlidir. Bu protokolün PCR öncesi kısımları kontaminasyona karşı hassastır. Bu videoyu izledikten sonra, tek tek hücrelerde ilgilenilen birden fazla genin ekspresyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, tek hücrelerde mRNA bolluğunun ölçümlerini doğrulamak için tek moleküllü RNA FISH gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.