Name: İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Öğrenin, tek hücreli biyolojide mikroakışkan qPCR ve iç standartlar kullanarak bireysel hücrelerdeki mRNA seviyelerini mutlak sayı olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, RNA-Seq'e göre daha düşük maliyetle çoklu gen ifadesi analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında hücre sıralama yapmadan onu yardım için CCR ETIB Sitometrisi Core V. Kapoor teşekkür etmek istiyorum. Biz de bu protokolün geliştirilmesi sırasında qPCR performans onların yardım M. Raffeld ve CCR LP Moleküler Tanı Ünitesi ve J. Zhu ve NHLBI DNA Dizilimi ve Genomik Çekirdek teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu kültür içinde yetiştirilen yapışan hücreler popülasyonundan tek tek memeli hücrelerini izole etmek için, her hücrede yaklaşık 96 gen ekspresyonunu analiz etmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem iyi çalışması için iyi bir ön hazırlık çok önemlidir. primerler tek hücreli ölçümlerin kalitesini belirlemek olarak, özellikle ilgi transkriptleri (1.2-1.3 adımlar) özgü tasarımı ve test primer çiftleri, zaman alıcı ama önemli adımlardır. güvenilir bir primer çiftleri elde edildikten sonra, bu ilgi transkript cDNA yı çoğa...

Nüfusu tek tek hücrelerin tek tip bir fizyolojik uyarıcı, 1, 2, 3, 4 çok farklı tepkiler gösterebilirler. Bir popülasyonda hücrelerin genetik varyasyonu bu tepkilerin çeşitli mekanizmalardan biri olmakla birlikte, daha hücre klonal popülasyonunda, yanıtların çeşitliliğini artırmak olmayan çeşitli genetik faktörler de vardır. Örneğin, tek tek proteinlerin ve diğer önemli sinyal molekülleri seviyeleri, aşağı doğru gen sentezleme profillerinin değişimine yol açan, bir hücre tarafından hücre bazında değişebilir. Buna ek olarak, gen aktivasyon kaymasının 7, 8, 9 her transkript, nispeten az sayıda sınırlı olabilir transkript 5, 6 kısa süreli patlamaları oluşabilir. böyleGen aktivasyon stochasticity büyük ölçüde biyolojik yanıt değişikliklere katkıda ve fizyolojik bir uyarıcıya yanıt mikroorganizmalar 10 ve memeli hücrelerinde 1 2 seçici bir avantaj sağlayabilir. Nedeniyle değişkenlik hem genetik hem de genetik olmayan kaynaklara, bir uyarıcıya tepki olarak belirli bir hücre gen tanımlama profili dökme yanıtın ölçülmesi elde edilen ortalama gen tanımlama profili büyük ölçüde farklılık gösterebilir. tek tek hücreler bir uyarıcıya tepki olarak değişkenlik göstermektedir ne ölçüde belirlenmesi tek tek hücrelerin izole edilmesi için teknikler gerektirir, ilgi konusu transkript için ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi, ve elde edilen sentezleme verilerinin sayısal analizi. maliyetleri geniş bir kaplama, tek bir hücre içinde gen ekspresyonunu analiz etmek için çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır transkriptlerin sayısı problanmış veölçümü doğruluğu. Örneğin, tek hücreli RNA Seq transkript içerisinde ve tek tek hücreler en yüksek ölçüde sentezlenen genler için farklı transkript binlerce ölçmek için yeteneği geniş bir derinliğe sahiptir; maliyetler düşmeye devam rağmen, ancak böyle bir sıralama derinliği ile ilişkili maliyet, engelleyici olabilir. Bunun aksine, in situ hibridizasyon (smRNA FISH), tek bir molekül, RNA floresan için transkriptlerin kesin miktarının sunar daha düşük ifade ilgili gen başına makul bir maliyetle genleri; Bununla birlikte, hedef genlerin sadece az sayıda bu yaklaşım, belirli bir hücre içinde analiz edilebilir. Bu protokol açıklanan kantitatif PCR bazlı deneyler, bu teknikler arasında bir orta yol sağlar. Bu deneyler kadar 96 hücrelerinde aynı anda ilgi 96 transkript kadar ölçmek için mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi kullanmaktadır. Yukarıda bahsedilen yöntemlerin her biri, gerekli donanım maliyetlerini olsa da, herhangi bir tek tek qPCR tahlilinde maliyeti nispetendüşük. Bu protokol, mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi üreticisi (Protokol ADP 41, Fluidigm) önerdiği bir uyarlanmıştır. PCR-temelli yaklaşımla her transkript mutlak sayısının tahmini etkinleştirmek için, birden fazla deneyler arasında kullanılabilir Hazırlanan hedef gen amplikonlarının iç kontrollerin faydalanmak için protokol genişlettik. Bu tekniğin bir örneği olarak, MCF-7 insan göğüs karsinoma hücrelerinde tümör baskılayıcı p53&#39;ün düzenlenen genlerin ifadesinin ölçümü 11 tarif edilmiştir. Hücreler DNA çift iplikli tatili uyaran bir kimyasal madde ile zorlanmaktadır. Daha önceki çalışmalar, DNA çift iplikli kırılmalara p53 yanıt hem de p53 seviyeleri 12 açısından ve farklı hedef genlerin 11 aktivasyonu tek tek hücrelerin heterojenlik büyük bir sergilediğini göstermiştir. Ayrıca, p53 100 ekspresyonunu düzenleyenHücre döngüsü tutuklama, apoptozi ve yaşlanma 13, 14 dahil olmak üzere birçok aşağı akış yolakları, yer alan hedef genlerin iyi karakterize edilir. Her bir hücrede p53 aracılı tepki kompleksi hem değişken hem de olduğu bir yaklaşım sistem faydaları analizi teknikleri, yaklaşık 100 hedef genler, aşağıda anlatıldığı gibi, tek tek hücrelerin, eş zamanlı olarak incelenebilir. (Örneğin, tek hücreli izolasyonu ve liziz alternatif yöntemler olarak) hafif değişiklikler, protokol kolaylıkla memeli hücre tipleri, transkriptlerin ve hücresel tepkilerin bir geniş bir çalışma için adapte edilebilir. Uygun önceden hazırlık, hücre sıralama ve gen ifadesi ölçüm yuvarlak üç günlük bir süre boyunca bu protokole göre yapılabilir. Aşağıdaki zamanlama önerilmektedir: önceden, ilgi transkript seçin belirlemek ve bu TRANSCR cDNA yükseltmek primer çiftleri doğrulamakIPTS ve standartları ve bu primerler kullanılarak primer karışımları hazırlayın. Gün 1, hücre tedavisi, hasat takip ve hücreleri sıralamak, ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon gerçekleştirmek ve adi primerler kaldırmak için bir eksonükleaz ile örnekleri davranın. 2. Gün, qPCR kullanılarak sıralanır hücreleri üzerinde kalite kontrolünü yapmak. Son olarak, 3. gün, mikroakışkan qPCR kullanılarak sıralanır hücrelerinde gen ifadesini ölçün. Şekil 1 ilgili adımları özetlemektedir.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>RNase İnhibitörü</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz ile Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Yüksek Hassasiyetli dsDNA Test Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml düşük yapışmalı mikrosantrifüj tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA Süspansiyon Tamponu</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml Maxymum Geri Kazanım İnce Duvar PCR Tüpleri</td><td>Corning</td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dinamik Dizi DNA Bağlayıcı Boya Örneği & Test Yükleme Reaktif Kiti</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 ortamı</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı (ABD)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik Çözelti</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neokarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELİMİNaz</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect Tek Adımlı qRT-PCR Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Sızdırmazlık Filmi, Steril</td><td>Excel Bilimsel</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tripsin% 0.05</td> <td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Eksonükleaz I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr>Düşük ROX <td>Bio-Rad</td> ile<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Gen İfadesi için Dinamik Dizi IFC (mikroakışkan qPCR çipi)</td> <td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Kontrol Cihazı HX (yükleme makinesi)</td> <td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark veya BioMark HD (mikroakışkan qPCR makinesi)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Analiz yazılımı&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB yazılımı</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İç standartları facs ve qpcr kullanma tek hücreli gen İfadesi profil

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Toplu hücre popülasyonlarından elde edilen gen ekspresyon ölçümleri, bu popülasyonlar içindeki tek tek hücrelerin önemli transkriptomik varyasyonunu gizleyebilir. Tek hücreli gen ekspresyonu ölçümleri, gen ekspresyonundaki gürültünün rolünü değerlendirmeye, gen çiftlerinin ekspresyonundaki korelasyonları tanımlamaya ve bir uyarana farklı tepki veren hücre alt popülasyonlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Burada, doku kültüründe büyüyen bir popülasyondan izole edilen tek memeli hücrelerinde 96'ya kadar genin ekspresyonunu ölçmek için bir prosedür açıklıyoruz. Hücreler, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) ile lizis tamponuna sıralanır ve ilgilenilen mRNA türleri ters kopyalanır ve amplifiye edilir. Gen ekspresyonu daha sonra, bir seferde 96 numuneye kadar 96'ya kadar qPCR testi gerçekleştiren bir mikroakışkan gerçek zamanlı PCR makinesi kullanılarak ölçülür. Ayrıca, her bir transkriptin mutlak sayısının tahmin edilmesini sağlamak için PCR amplikon standartlarının oluşturulmasını ve kullanılmasını da açıklıyoruz. Tek hücrelerde gen ekspresyonunu ölçmenin diğer yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, RNA-Seq'ten daha düşük bir maliyetle RNA FISH'ten daha farklı transkriptlerin nicelleştirilmesine izin verir.

Protokol genel bir bakış hücre tedavisi, FACS ile tek hücrelerin izolasyonu için adımları da dahil olmak üzere Şekil 1 &#39;de gösterilen üretim ve tek hücre lizatları, tek hücreli bir cDNA kütüphanelerinin onay cDNA kütüphanelerinin ön amplifikasyon sıralı oyuklar ve qPCR gen ifadesinin ölçümü. tek hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için hazırlanırken, ilk önce her bir ilgi hedef genin geçerli oligonü...

Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Bu prosedürün genel amacı, iç standartlar içeren mikroakışkan qPCR kullanarak tekil hücrelerdeki mRNA seviyelerini nicelleştirmektir. Bu yöntem, hücre popülasyonlarının bir uyarana karakteristik olarak farklı şekillerde yanıt verip vermediği gibi, tek hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil hücrelerde RNA FISH'ten daha fazla genin ekspresyonunu, RNA-Seq'ten daha düşük bir maliyetle ölçebilmesidir.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, mikroakışkan qPCR ile tek hücrelerde gen ifadesini ölçmek için protokolleri araştırırken edindik. Tek hücrelerdeki farklı transkriptlerin mutlak sayısını daha doğru tahmin etmek için mevcut yöntemleri modifiye etmek istedik. Hücre ayıklama prosedürünü, laboratuvarım tarafından kullanılan akış sitometrisi tesisinin yöneticisi William Telford gösterecektir.Metin protokolüne uygun olarak ilgili genlerden amplikonlar üretilip saflaştırıldıktan sonra, her bir saflaştırılmış amplikondan 18 mikrolitre 2,0 mililitrelik düşük bağlanma özellikli bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin, ardından her bir amplikonun konsantrasyonu 5x10⁶ molekül/mikrolitre olacak şekilde DNA süspansiyon tamponu ile 1.800 mikrolitreye tamamlayın. 5e6 standart çözeltisini iyice vorteksleyin ve düşük bağlanma özellikli PCR tüplerine 20 mikrolitrelik alikotlar halinde bölün. MCF7 p53-Venus hücrelerini metin protokolüne uygun olarak ekim yaptıktan sonra, hücrelere 400 nanogram/mililitre neokarzinostatin ekleyin ve hücreleri 3, 8,5, 14 veya 24 saat boyunca işleme tabi tutun.Lizis tamponunu hazırlamak için bu tabloda listelenen reaktifleri birleştirin. Amplikon standartları için lizis tamponu olarak kullanılmak üzere tamponun 92.4 µL'sini ayrı bir tüpe aktarın. Geriye kalan lizis tamponu hücreler için kullanılacaktır.Metin protokolüne uygun olarak, hücreler için lizis tamponuna E.coli DNA'sını hazırlayıp ekleyin. Standartları hazırlamak için altı adet düşük bağlanma özellikli santrifüj tüpünü etiketleyin. 5e5 tüpüne 90 µL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.Diğer beş tüpün her birine, mikrolitre başına 6,2 pikogram E.coli DNA'sı içeren 90 µL tampon ekleyin ve tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Saklama alanından 5e6 standart örneğinin bir alikotunu çıkardıktan sonra tüpü kısa süreli vorteksleyin, ardından sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için santrifüjleyin; daha sonra düşük bağlanma özellikli bir pipet ucu kullanarak 5e5 tüpüne 10 µL 5e6 standart ekleyin. Vorteksleyin, santrifüjleyin ve tüpü tekrar buz üzerine yerleştirin.Ardından, 5e5 tüpünden 10 µL alarak 5e4 tüpüne pipetleyin, ardından tüpü kısaca vorteksleyin, santrifüjleyin ve tüpü tekrar buza koyun. Tüm tüpler standart bir dilüsyona sahip olana kadar, bir önceki tüpten 10 µL alarak seri dilüsyonları her tüp için tekrarlayın. Lizis tamponu içeren PCR tüplerini hazırladıktan sonra, 12 kanallı bir pipet kullanarak, PCR tüpleri sırasındaki dokuz µL hücre lizis tamponunu bir PCR plakasının ilk yedi sırasındaki her kuyucuğa dağıtın.Plakanın son sırasındaki her kuyucuğa yedi µL standart lizis tamponu dağıtın, ardından düşük bağlanma özellikli pipet uçları kullanarak plaka haritasına göre alt sıradaki her kuyucuğa iki µL standart ekleyin. 10 hücreli ve 100 hücreli kuyucuklara 3,1 pg/µL E.coli DNA'sından iki µL ekleyin, ardından hücre içermeyen kuyucuklara 6,2 pg/µL E.coli DNA'sından iki µL ekleyin. Floresan aktive hücre ayırıcısını plaka haritasına göre 96 kuyucuklu bir plakaya ayıracak şekilde programladıktan sonra, cihazı hizalamak için boş bir PCR plakasını mühürleyin ve test akışını kullanarak damlacıkları ve PBS'yi boş plakanın mührü üzerine ayırın.Damlacıklar doğru konuma düşmüyorsa, onları mühür yüzeyinden silin, hücre ayırıcıyı makine üreticisinin talimatlarına göre yeniden kalibre edin ve ayırma akışındaki damlacıklar doğru şekilde yerleşene kadar işlemi tekrarlayın. Hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat edin ve %2 FBS içeren 0,5 mililitre PBS içinde yeniden süspande edin, ardından bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Hücreleri ayırmak için, hücre süspansiyonunun bulunduğu tüpü hücre ayırıcıya yerleştirin, lizis tamponu plakası üzerindeki mührü açın ve ilgili hücreleri plaka haritasına uygun olarak dikkatlice plakaya ayırın.Tek hücrelerin maksimum saflıkta ayrıştırıldığından emin olmak için, cihazı tek hücre modunda çalıştırın ve ileri ve yan saçılmaya dayalı standart akış sitometrisi kapılama yöntemini kullanın. Çalışmanın ardından, plakayı mühürlemek için yeni bir steril termal mühür kullanın ve plakayı 4 °C'de, 400 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin; ardından plakayı termal döngüleyiciye yerleştirin ve önceden hazırlanmış RT-STA programını çalıştırın. Tamamlanan RT-STA plakası döndürüldükten sonra, seyreltilmiş ekzonükleaz I'den 3,6 µL'yi plakanın her bir kuyucuğuna dağıtmak için 12 kanallı bir pipet kullanın.Plakayı mühürleyip kısa süreliğine santrifüj edin, ardından plağı termal döngüleyiciye yerleştirin ve exo I programını çalıştırın. Her örnekteki housekeeping gen ekspresyonunu ölçmek için, seçilen housekeeping genlerinden birine ait primerleri kullanarak 96 reaksiyon için 900 mikrolitre DNA bağlayıcı boyalı qPCR master mix hazırlayın. 96 kuyucuklu bir PCR plağının her kuyucuğuna dokuz mikrolitre master mix dağıtın, ardından örnek plağındaki her bir örnekten bir mikrolitre ilgili PCR plağı kuyucuğuna ekleyin.Plakayı, master mix üreticisi tarafından önerilen bir termal döngü protokolü kullanarak veya standart bir protokolü takip ederek gerçek zamanlı PCR cihazında çalıştırın, ardından örnekleri analiz edin ve metin protokolüne uygun bir örnek karışım plak haritası oluşturun. Bir plakayı örnek karışımları olarak etiketleyin ve ardından sekiz kanallı bir pipet kullanarak, 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 3.3 µL master mix örnek yükleme reaktifi karışımı dağıtın. Örneklerin bulunduğu her bir PCR plakası için, plakayı 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 500 ×g hızında 10 saniye boyunca santrifüjleyin.Kapağı çıkarın ve her bir pozitif tek hücre örneğinden 2,7 µL'yi, plaka haritasında belirtilen tek hücre kuyucukları için örnek karışım plakasındaki ilgili kuyucuğa aktarın. Yeni bir mikroakışkan qPCR çipinin altındaki etiketi soyun, ardından kapağı hala kapalı olan kontrol hattı sıvısı yüklü bir şırınga kullanarak, her bir akümülatör yayını gevşetmek için aşağı doğru bastırın ve her akümülatöre 100 ila 200 µL kontrol hattı sıvısı enjekte edin. Çipi yükleme makinesine yerleştirin ve hazırlama (prime) betiğini çalıştırın, ardından sekiz kanallı bir pipet kullanarak, her bir analiz karışımından 4,5 µL'yi mikroakışkan qPCR çipinin sol tarafına aktarın.Kuyu diplerinde hava kabarcığı oluşmasını önlemek kritik önem taşır. Bu durum, yükleme sorunlarına yol açacaktır. Bunu önlemek için pipet uçlarını kuyunun kenarına değdirin ve ardından yalnızca ilk durak noktasına kadar pipetleme yapın.Her bir örnek karışımından 4,5 microliter miktarı mikroakışkan qPCR çipinin sağ tarafına aktarın, ardından çipi yükleme makinesine yerleştirin ve karışım yükleme scriptini çalıştırın. Karışım yükleme scripti tamamlandığında, yükleme sorunu olduğunu belirtebilecek olan çip üzerinde herhangi bir çizgi bulunmadığını doğrulayın, ardından bant kullanarak çip üzerindeki tüm toz partiküllerini dikkatlice temizleyin, daha sonra çipi mikroakışkan gerçek zamanlı PCR makinesine yerleştirin ve veri toplama scriptini çalıştırın. Son olarak, verileri metin protokolüne göre analiz edin.Bu şekil, hangi kuyucukların tek bir hücre içerdiğini belirlemek için qPCR ile ölçülen bir housekeeping geninin ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Hücre içeren örnekler düşük CT değerlerine sahiptir. Hücre içermeyen örnekler ise çok daha yüksek CT değerlerine sahiptir.Amplikon standardı için kuyucuklar, eşit aralıklı amplifikasyon eğrileri göstermelidir. Ayrıca hücre içermeyen, 10 hücreli ve 100 hücreli kuyucukların eğrileri arasında belirgin bir ayrım olmalıdır. Gerçek hücreleri temsil eden tohum DNA örnekleri, sıralanmış birden fazla 96 kuyucuklu plakadan seçilerek mikroakışkan qPCR hazırlığı için tek bir plakada birleştirilir.Bu ısı haritası, mikroakışkan qPCR sonuçlarını özetlemektedir. Her sütundaki renk değişimi, her bir genin farklı hücreler arasındaki ekspresyon değişkenliğini göstermektedir. Diğerlerinden çok daha koyu olan iki satır, büyük olasılıkla hatalı örnekleri temsil etmektedir.Bu prosedürü uygularken, özellikle standartları ve lizi tamponunu hazırlarken çalışma alanınızı RNaz ve DNA'dan arındırılmış tutmanız önemlidir. Bu protokolün PCR öncesi bölümleri kontaminasyona karşı hassastır. Bu videoyu izledikten sonra, tekil hücrelerde ilgilenilen birden fazla genin ekspresyonunun nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürün ardından, tek hücrelerdeki mRNA bolluğu ölçümlerini doğrulamak için tek molekül RNA FISH gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Sentetik Maya Genom projesi, Sc2.0'ın tasarımcı kromozomları, varlık/yokluk uç noktasına sahip PCRTagging adı verilen PCR tabanlı bir genotipleme testi kullanılarak doğal muadillerinden ayırt edilebilir. Burada, PCRTag genotiplemesi için yüksek verimli bir gerçek zamanlı PCR tespit yöntemini açıklıyoruz.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Bu yöntem, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) RNA örneklerinden elde edilebilen sıra verilerinin kalitesini ve miktarını artırmaya yönelik adımları açıklar. FFPE-RNA örneklerinin kalitesini daha doğru değerlendirmek, sıralama kitaplıkları hazırlamak ve FFPE-RNA örneklerinden elde edilen verileri analiz etmek için metodolojiyi tanımlıyoruz.

Bozulmuş FFPE-RNA Örneklerinin Dizileştirilmesi ve Analizi için Optimizasyon

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Öğrenin, tek hücreli biyolojide mikroakışkan qPCR ve iç standartlar kullanarak bireysel hücrelerdeki mRNA seviyelerini mutlak sayı olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, RNA-Seq'e göre daha düşük maliyetle çoklu gen ifadesi analizi sağlar.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Daha fazla video keşfet