Name: Kişiye özel Prekürsorler tarafından Modifikasyon ve Guanidin Grubu işlevselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin guanidin fonksiyonelleştirilmiş peptitlerin sentezi için kişiye özel prekürsörlerle modifikasyon yöntemini. Bu teknik kas peptit kimyası ve kişiselleştirilmiş tıpta hedefli tedaviler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

TGK maddi destekleri için Technische Universität München Fen ve Mühendislik (IGGSE) Uluslararası Enstitüye kabul eder. HK destekleri için Entegre Protein Bilim Münih için Merkezini (CIPSM) kabul eder.

Not: Bütün reaktifler ve çözücüler, ticari tedarikçilerden elde edildi ve daha fazla saflaştırılmadan kullanıldı. Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili güvenlik bilgi formuna (MSDS) başvurun. Kimyasal sentezleri (örneğin, davlumbaz, güvenlik gözlüğü, eldiven, laboratuvar önlüğü, boy pantolon ve kapalı parmak ayakkabılardan) gerçekleştirirken tüm uygun güvenlik ekipmanlarını kullanın. Guanidinylation Öncülerinin 1. sentezi <ol><li> Alkile türler <ol><li> Metilli türler <ol><li> Kuru, 10 mL (PPh3, 3.8 mmol, 1.2 eşi.), N, N &#39;1.0 g eritin-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin (3.2 mmol, 1 eşd.) Ve 1.0 g trifenilfosfin oda sıcaklığında (RT), bir kauçuk septum ile bir inert atmosfer içinde bir 50-mL yuvarlak dipli bir şişede tetrahidrofuran (THF). bir şırınga (4.8 mmol, 1.5 eş.) ve l kullanılarak kuru metanol 194 mcLve bu, oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Ayrı olarak, küçük bir cam şişe içinde kuru THF, 2 mL diizopropil azodikarboksilat 747 uL (DIAD, 3.8 mmol, 1.2 eşi.) Içeren bir çözelti hazırlanmıştır. Karıştırılırken, bir şırınga (15 dakika boyunca) kullanılarak N, N&#39;-N&#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin, PPh3, ve metanol çözeltisine damla damla THF içinde DIAD çözeltisi ilave edilir. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile çözelti karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın ve 1 mL diklorometan (DCM) içerisinde ham ürün çözülür. Bir pentan çözeltisi içinde% 10 etil asetat içinde 100 g silis (EtOAc) ile bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin. kolon üzerinde çözülmüş ham ürün yüklenir ve basınçta (1.5 bar) altında çözücü ekleyin. </li><li> (Çözücü sistemi: izokratik% 10 pentan içinde EtOAc) fraksiyonları toplayın, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile istenen bileşik nokta belirlemek ve (Rf = 0.4, EtOAc / pentan 1: 9, UV) toplayın. istenilen birleştirinfraksiyonlar san, yapışkan bir yağ (2.6 mmol,% 81 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 0.85 gramını elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır ve. ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında vermiştir bileşik saklayın. </li></ol></li><li> Heksilamin modifiye türler <ol><li> N 1.0 g çözülür, N&#39;-Di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin (3.2 mmol, 1.0 eşi.), DDE-6-aminoheksanol Sentezi (3.8 mmol, 1.2 eşi.), 0.9 g, ve 1.0 g atıl bir atmosfer içinde 50 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir şişede kuru 10 mL THF içinde PPh3 (3.8 mmol, 1.2 eşd.) oda sıcaklığında bir kauçuk bölüm ile. </li><li> Ayrı olarak, küçük bir cam şişe içinde DIAD 747 uL (3.8 mmol, 1.2 eşi.), Kuru THF içinde 2 mL bir çözelti hazırlanmıştır. Karıştırılırken, N solüsyonuna damla damla THF içinde DIAD çözeltisi ekleyin, bir şırınga kullanılarak N &#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin, PPh3, ve DDE-6-aminoheksanol Sentezi (boyunca 15 dk) . Oda sıcaklığında 2 saat süre ile çözelti karışmaya bırakıldı. </li><li>Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın ve 1 mL DCM içerisinde ham ürün toplanır. pentan / EtOAc çözeltisi içinde 100 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yük (2: 1). kolon üzerinde çözülmüş ham sürün ve basınçta (1.5 bar) altında solvent ekleyin. </li><li> Fraksiyonların kazan (çözücü sistemi: izokratik 2: 1 pentan / EtOAc), TLC ile istenen fraksiyonu belirlemek ve bunları toplamak (Rf = 0.66, 2: 1 pentan / EtOAc, UV). İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve bir sarı zor akışlı bir yağ (2.8 mmol,% 88 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 1.6 gramını elde etmek üzere döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında vermiştir bileşik saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Asile türleri (2 reaksiyon adımıyla) <ol><li> S -methylisothiuronium hemisülfatın 1.4 g (10 mmol, 1.0 eşi.) Ve di (tert-butil) dikarbonat 2.2 g çözülür (10 mmol, 1.0 eq.) Kuvvetli bir şekilde karışmaya içindeDCM iki fazlı çözelti halka / sat. su. NaHCO 3 ve oda sıcaklığında 24 saat süre ile karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir ayırma hunisi içinde Tabakaları ayırın ve DCM ile sulu faz üç kez ekstrakt edin. Organik fazlar birleştirilir, Na2 SO 4 ile kuru ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. heksan 1 mL Ham ürün toplanır. </li><li> 1 heksan / EtOAc: 4 bir çözelti içinde 100 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin. kolon üzerinde çözülmüş ham ürün yüklenir. basınç altında çözücü ekleyin. (Rf = 0.30) 254 nm), ve bunları toplamak: 4: 1 izokratik heksan / EtOAc (saptama UV TLC (çözücü sistemi ile istenen fraksiyonu belirlenmesi. </li><li> İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve bir sarı zor akışlı bir yağ (5.8 mmol,% 58 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 1.1 gramını elde etmek üzere döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. (Tert-butoksikarbonil) - - reaktifi, N Mağaza S -meDaha fazla kullanım için oda sıcaklığında thylisothiourea. </li><li> N 250 mg çözülür - bir inert atmosfer içinde bir 50-mL yuvarlak dipli bir şişeye S -methylisothiourea (1.3 mmol, 1.0 eşi.), Kuru N, N-dimetilformamid (DMF), 10 ml de - (tert-butoksikarbonil) RT. Bir şırınga kullanılarak, N, N-diizopropiletilamin (DIPEA), 440 uL (2.6 mmol, 2 eş.) ilave edilir. Karıştırılırken, Ac2O (5.2 mmol, 4.0 eşi.) 245 mcL bir şırınga kullanılarak damla damla ve oda sıcaklığında 1 saat karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir şırınga kullanılarak karışıma metanol aşırısı (2 mL) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika karışmaya bırakıldı. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın. 1 mL DCM içerisinde ham ürün toplanır. </li><li> 1 heksan / EtOAc 3: 3&#39;ün bir çözelti içinde 60 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin 1. kolona çözülmüş ham ürün uygulanır. Ekle çözücü (3: 1 heksan / EtOAc) ve basınçta (1.5 bar). (1: heksan / EtOAc, UV: 220 nm 3), ve sütun TLC istenen fraksiyonlar belirlenmesibunları (Rf = 0.62) Lect. </li><li> İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve (0.9 mmol,% 70 verim) beyaz bir katı olarak başlıkta adı geçen bileşiği 210 mg olarak elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. Daha fazla kullanım için oda sıcaklığında bileşik saklayın. </li></ol></li></ol> Siklik Peptit Öncülerinin 2. sentezi <ol><li> Yükleme ve TCP reçine kapatma <ol><li> bir cam hamuru ile plastik bir 20 mL&#39;lik bir şırıngaya 2-chlortriyl klorür (CTC) reçinesi (0.9 mmol / g) ve Fmoc-Gly-OH (1.2 eq.) 320 mg, 1.00 g ekleyin. Kuru DCM 5 mL DIPEA 313 uL (2 eşi.) ihtiva eden bir çözelti hazırlanması ve bir şırıngaya ekleyin. Bu, döner bir ünite ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca dönüşümlü olsun. </li><li> (; Örtücü çözeltisi h / h) 1 metanol / DIPEA: Bu arada, 5 2 ml solüsyon hazırlanır. şırıngaya kapatma çözüm ekleyin ve 15 dakika daha çevirin edelim. DCM (5 x) ve DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde<ol><li> 5 dakika boyunca, daha sonra 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Gly tedavi ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> On-reçinesi yerine Fmoc-Orn (DDE) bağlanması -OH <ol><li> Fmoc-L-Orn (Dde) -OH 934 mg ekleyin (2 eşi.), 1- 684 mg [bis (dimetilamino) metilen] -1 H-1,2,3-triazolo [4,5-b] piridinyum 3-oksit (HATU) (2 eşi.) ve 1-hidroksi-7-azabenzotriazol (HOAt) 245 mg (2 eş.), küçük bir cam şişeye ve 5 mL DMF içinde çözülür. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı Gly Bu solüsyon ilave edin ve 1 saat boyunca dönmesine izin verin. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> 5 dakika daha sonra -Gly 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Orn (Dde) ve Treat ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc-Val-OH On-reçine bağlama <ol><li> (2 eşi.), Fmoc-Val-OH 610 mg ekleme, 6HATU 84 mg (2 eşd.), Ve 245 bir küçük cam şişeye HOAt mg (2 eq.) Ve 5 mL DMF içinde çözülür. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Bu çözüm, Fmoc koruma grubu çıkarılır yıkandı, ve reçineye bağlı Orn (Dde) -Gly ve 1 saat boyunca dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> 5 dakika daha sonra -Gly 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Val-Orn (Dde) ve Treat ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> On-reçine N-metillenmesi <ol><li> DCM (3x) ile reçine yıkayın. DCM içinde 2-nitrobenzen sulfonilklorid (O -NBS-CI, 4 eş.) 887 mg çözülür ve 2,4,6-kollidin 1.2 mL eklemek (10 eşi.). </li><li> resin bağlı peptite solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> CH2C! 2 (3x) ile ve THF (5x) ile reçine yıkanır. PPh3, 1.18 g (5 eşi.) Ve THF içinde bir metanol 365 uL bir çözelti hazırlayın. bu çözümü ekleşırınga. </li><li> 2 mL THF içindeki bir DIAD 883 uL olan bir çözelti hazırlanır ve şırıngaya ekleyin. 15 dakika boyunca kuluçkaya edelim. THF (5x) ile ve DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> O -NS koruma kaldırma <ol><li> merkaptoetanol 570 uL (10.0 eşi.) ve 2 mL DMF içerisinde diazabicycloundecen 672 uL (DBU) ile bir çözelti hazırlayın. şırıngaya bu çözümü ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe izin verin. </li><li> koruma kaldırma adımı tekrar edin ve daha sonra DMF (5x) ile reçinenin yıkanması. </li></ol></li><li> Fmoc-D-Phe-OH üzerine reçine bağlama <ol><li> Fmoc-D-Phe-OH 697 mg ekleyin (2 eşi.), HATU 684 mg (2 eşd.) Ve küçük bir cam şişeye HOAt (2 eşi.) 245 mg ve 5 mL DMF içinde çözülür . DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı peptidi bu solüsyonu ekleyin ve 1 st için dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> Reçine-b tedaviound DMF içinde% 20 piperidin, 10 dakika boyunca ve daha sonra 5 dakika süre ile birlikte peptit. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc-Asp (Ot-Bu) -OH On-reçine bağlama <ol><li> 5 mL içinde (2 eq.) Fmoc-Asp (Ot-Bu) -OH 741 mg ekleme, HATU 684 mg (2 eşd.) Ve küçük bir cam şişeye HOAt 245 mg (2 eşd.) Ve çözülür DMF. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı peptidi bu solüsyonu ekleyin ve 1 st için dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Reçineden doğrusal peptidin bölünmesi <ol><li> DCM&#39;de (HFIP) içindeki bir çözeltisi 10 ml hazırlamak, daha sonra DCM (3x) ile reçine yıkanır ve (1: 4 v / v). </li><li> reçineye çözüm ekleyin ve 15 dakika dönmesine izin verin. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde çözelti toplayın. bölünmesini tekrar edin ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılır. </li></ol></li><li> Lineer peptid siklizasyonu <ol><li> DiNaHCO 3 (5.0 eq.) ve 50 mL DMF içerisinde difenilfosforil azit 582 uL (DPPA) (3.0 eşi.) 384 mg ssolve ve ham ürün ekleyin. Bu, gece boyunca karışmaya olsun ya da doğrusal bir peptid, ESI-MS (10 saat) 17 ile gözlenen kadar. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı kullanılarak küçük bir hacme azaltır. NaCl (tuzlu su), doymuş bir sulu çözelti hazırlayın. Pasteur pipeti kullanılarak, bir santrifüj tüpü içinde NaCI doymuş sulu solüsyon, 40 mL siklize peptid damla damla ilave edilir. </li><li> süspansiyonu (5.000 x g, 5 dakika) santrifüj ve HPLC-grade, su (2x) ile bir çökelti yıkayın. Ürünü liyofilize edin. </li></ol></li></ol> Çözeltide 3. Guanidinylation ve korumasının bozulması <ol><li> Kişiye özel öncüleri ile Guanidinylation <ol><li> DMF, küçük bir hacim içinde (örneğin, 25 mg), dik olarak koruması siklik peptid küçük bir miktar içinde çözündürülür (örneğin, 2 mL) eklenmiştir. 2 eq ekleyin. guanidinylation ön ve 2 ek. ve çözeltiye DIPEA bu ​​oda sıcaklığında 2 saat karışmaya bırakıldı. </li><li> HPLC-MS ile reaksiyon ilerleme izleyin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, asetonitril çözücü yeniden çözülür guanidinylated siklik peptid kaldırmak ve yarı preparatif HPLC saflaştırma 16 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Asit labil yan zincir koruma gruplarının çıkarılması <ol><li> trifluoroasetik asit (TFA), su, ve triisopropilsilan (TIPS) ihtiva eden bir çözeltiye, 2 mL hazırlama (95 / 2.5 / 2.5 v / v / v). küçük bir cam şişe içinde saflaştırılmış ürün, bu solüsyonu ekleyin ve en az 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışmaya bırakıldı. ESI-MS 17 ile tam deproteksiyon dikkate alınmalıdır. </li><li> küçük bir hacme kadar indirgenmiş basınç altında çözücüyü buharlaştınn. buz soğukluğunda eter hazırlamak ve bir 50-ml santrifüj tüpü içinde 10 mL ekleyin. ekleyerek bir Pasteur pipeti kullanılarak, buzla soğutulmuş eter içinde deprotekte Peptidi çöktürmekilave edildi. bir pelet elde etmek üzere süspansiyonu (5.000 x g, 5 dakika) santrifüj. </li><li> (5000 xg, 5 dakika, 2 x), buz soğukluğunda eter ile çökelti yıkanır ve santrifüj. HPLC-grade 2 mL su içinde ürününü ve yarı preparatif HPLC 16 ile saflaştırılması. </li></ol></li></ol> 4. Analitik Veriler ve Arıtma için parametreler <ol><li> Analitik HPLC-ESI-MS <ol><li> Bir C 18 sütunu (12 nm gözenek büyüklüğü, 3-um parçacık büyüklüğü, 125 mm x 2.1 mm) ya da bir C8 sütunu (20 nm gözenek boyutlu ve 5 mikron partikül kullanarak bir LCQ kütle spektrometresi ile analitik HPLC-ESI-MS gerçekleştirme büyüklüğü, taşıyıcı olarak, H2O (% 0.1 v / v formik asit) / asetonitril (% 0.1 v / v formik asit) ile 250 mm 2,1 mm x). </li></ol></li><li> Yarı hazırlayıcı HPLC, <ol><li> bir ODS-A sütunu (20 x 250 mm, 5 um), 8 ml / dakikalık bir akış oranı ve lineer değişim dereceleriyle bir HPLC aleti kullanılarak yarı-preparatif HPLC gerçekleştirmeH2 (TFA hac% 0.1 v /) (% 0.1 TFA hac h /) ve asetonitril. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saczewski, F., Balewski, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19780701">Biological activities of guanidine compounds.</a> Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).</li>
<li>Saczewski, F., Balewski, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23617396">Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update.</a> Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).</li>
<li>Wirth, T. H., Davidson, N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01074a018">Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).</li>
<li>Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+and+biology+of+organic+guanidine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">The chemistry and biology of organic guanidine derivatives.</a> Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).</li>
<li>Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001005075">Arginine mimetics.</a> Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).</li>
<li>Peterlin-Mašič, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+mimetic+structures+in+biologically+active+antagonists+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors.</a> Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Liddington, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+aspects+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural aspects of integrins.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).</li>
<li>Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10801897">Ligand binding to integrins.</a> J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).</li>
<li>Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cause%2C+great+impact+-+modification+of+guanidine+group+in+RGD+controls+subtype+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).</li>
<li>Xiong, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+extracellular+segment+of+integrin+alpha+Vbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3.</a> Science. 294, 339-345 (2001).</li>
<li>Xiong, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+extracellular+segment+of+integrin+alpha+Vbeta3+in+complex+with+an+Arg-Gly-Asp+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand.</a> Science. 296 (5565), 151-155 (2002).</li>
<li>Nagae, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+%CE%B15%CE%B21+integrin+ectodomain%3A+atomic+details+of+the+fibronectin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor.</a> J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitched+Cell+Adhesion+on+Surfaces+with+RGD+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).</li>
<li>Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorradini%2C+D+%22Handbook+of+HPLC%22">Handbook of HPLC</a>. , CRC Press. (2011).</li>
<li>de Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ade+Hoffmann%2C+E+%22Mass+Spectrometry%3A+Principles+and+Applications%22">Mass Spectrometry: Principles and Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Frank, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Control+of+Integrin-Subtype+Selectivity+in+isoDGR+Peptide+Motifs%3A+A+Biological+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).</li>
<li>Rossiter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+substrate-based+inhibitors+of+mammalian+dimethylarginine+dimethylaminohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase.</a> J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).</li>
<li>Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28G%29-Acyl-argininamides+as+NPY+Y%281%29+receptor+antagonists%3A+Influence+of+structurally+diverse+acyl+substituents+on+stability+and+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity.</a> Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).</li>
<li>Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. <a target="_blank" href="https://www.thieme-connect.com/products/ejournals/abstract/10.1055/s-0032-1316789">Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor.</a> Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Guanidinylation için ön-madde ((N-Me) V) C (OrnD (Ot-Bu) Gf), katı-faz peptid sentezi (SPPS) içindeki bir standart Fmoc protokolü tarafından sentezlenmektedir olan bir ortogonal olarak koruması siklik peptit türevidir. Ornıtın peptid iskele siklizasyonu DMF içinde hidrazin ile koruması kaldırılabilir ortogonal korumalı türevinin, (Fmoc-Orn (Dde) ve OH), olarak kullanıldı. Peptid ön-madde bileşiği çökeltme ve bunu takiben liyofilizasyon ile saflaştırılır. Guanidinyl...

Doğal ligandlar en bol pharmacophoric gruplar arasında birden fazla etkileşimleri 1, 2 katılır guanidin grubudur. Örneğin, hidrojen bağ etkileşimleri potansiyel dört kat hidrojen vericisi olarak hizmet vermekte ve tuz köprüleri veya katyon π etkileşimleri, elektrostatik etkileşimleri, yer almaktadır. Ilaç kimyası alanında, bu grup, guanidin mimetikleri 5, 6 olarak çok sık birlikte, ilaçlar ve ilaç adayları 4 bulunur. guanidin mimetiklerinin tercih edilme sebebi her yerde, pozitif yüklü guanidin grubunun çıkarılması, hem de ligand lipofilisitesinin ayarlanmasıdır. peptidik ligandlarda, sadece guanidin grubu ihtiva eden bir amino asit, bu nedenle genellikle peptid ligandlar biyolojik olarak aktif bölgesinde bulunan, hangi arginindir. Çok prBir arginin içeren ligand ailesi için ominent örneğin bir RGD bağlama integrinlerin alt familyasıdır. Genelde, integrinler bütün yüksek organizmalarda önemli işlevleri devralacak hücre yapışması reseptörlerinin, bir sınıfıdır. Bu işlevlerden bazıları hücre yapışması, göçü ve hücre yaşamını kapsar. Böylece, aynı zamanda, kanser ve fibroz gibi patolojik endikasyonlar, katılmaktadırlar. İntegrinler, 24 bilinen integrin alt türlerini oluşturmak, bir a- ve bir β-alt-birimini kapsayan transmembran heterodimerik proteinlerdir; 8 tanesi ligandları 7 tripeptid sırası Arg-Gly-Asp (= RGD) tanır. Bağlama bölgesi hücre dışı parçası, sözde integrin baş grubu 8, bu iki alt-tip arasındaki ara yüzeyde yer alır. RGD iki yaygın etkileşimleri tarafından kabul edilmektedir: beta alt bulunur ve ligandlar olarak karboksilik asit bağlandığı metal iyonu bağımlı yapışma bölgesini (MIDAS) bölge, (yan cha) Asp arasında; ve alfa alt bulunur ligandlar guanidin grubudur. Integrin alt tipleri çoğu rasgele ve onların doğal hücre-dışı matrisi (ECM) 9 ligandları en azından bir kısmını paylaşır. Böylece yapay integrin ligandları gelişimi için, temel odak noktası yüksek bağlama eğilimi, alt tip seçiciliği yanında olduğunu. guanidin grubu: Son zamanlarda, alt tip-selektif ligandların elde edilmesi için önemli bir unsur ortaya çıkarmak mümkün. Belirgin değişiklikler aracılığıyla, αv- ve için biselective ligandlar a5 içeren integrin alt tiplerinin daha sonra farklı α alt birimleri 10 ayırt edilebilir, guanidin grubu, basit modifikasyonlarla seçici bileşikler haline dönüştürülebilir. Αv bir cebinde, guanidin grubu Asp218 11, 12 ile iki dişli bir tuzu köprüsü üzerinden yan taraflarının etkileşime girer. Bu etkileşim, CBir de (a5 olarak Asp227 ile, burada) α5β1 gözlemlenebilir, ancak ek olarak, bir uç-üzerinde Gln kalıntısının (Gln221) ile guanidin grubunun etkileşim yoktur 13 görülmektedir. Guanidin, N w metilasyonu ile, guanidin grubunun N ö metilasyonu ile yan üzerinde etkileşimi bloke ederek, bir durumda, ve diğer durumda: Bu şekilde, iki zıt yönden guanidin grubu değiştirilmiş sonu ile etkileşimini bloke eder. Şaşırtıcı bir şekilde, bu küçük bir değişiklik ligandlar tam bir seçicilik kaymasına yol açtı. alkilasyonu ek olarak, yeni bir fonksiyonlandırmalar yöntem bu yayında tanıtıldı. Pentapeptidic ligand bu tür klasik fonksiyonalizasyon yöntemi bağlanmada rol oynamayan bir amino asidin yan zinciri, konjugasyon yoluyla (örneğin, c K (RGDfK)) 14, 15. İşte,bağlanma için önemli olduğu - - bir asil ya da alkile edilmiş bir bağlayıcı ile biz işlevselleştirme guanidin değiştirerek de mümkün olduğunu göstermektedir. Bağlanma için gerekli olan pozitif yük muhafaza edilir, ve model bağlama cebinden uzun zincirli noktaları, böylece daha fazla bağlayıcıların bağlanması için ideal bir imkanı sağlanması ve (birimleri etiketleme göstermektedir, örneğin, bir flüoresan etiket veya molekül için bir şelatör görüntüleme). Bu çalışmada, arginin ihtiva eden ligandlarla guanidin grubunun modifikasyonu için hazırlık aşamalarına konsantre. Bu daha uzun bir bağlayıcı birimleri ile N ω metillenmiş türlerin sentez ve aynı zamanda guanidin içerir. farklı modifikasyon asil ve alkil grupları ihtiva eder.

<table><tbody><tr><td>N, N & asal; -Di-Boc-1H-pirazol-1-karboksamidin,% 98 &</td><td>Sigma Aldrich</td><td>434167&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Trifenilfosfin,% 99</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T84409&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran, >%99,5</td> <td>Carl Roth</td><td>4745</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran susuz, %99,8Carl</td> <td>Roth</td><td>5182</td><td></td></tr><tr><td>Susuz Metanol, %99,8</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>322415&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diizopropil azodikarboksilat, %98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>225541&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diklormetan, sentez için,% 99.5</td> <td>Carl Roth</td><td>8424</td><td></td></tr><tr><td>Flaş kromatografi için silika jel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60738&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>ve Pentan,% 99</td> <td>Carl Roth</td><td>8720</td><td></td></tr><tr><td>n-Heksan,% 99</td> <td>Carl Roth</td><td>CP47</td><td></td></tr><tr><td>Etilasetat,% 99.5</td> <td>Carl Roth</td><td>7338</td><td></td></tr><tr><td>Aminoheksanol,% 95</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A56353 & nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>em >S-Metilizotioüre hemisülfat,% 98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M84445 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butil dikarbonat,% 99</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>205249&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>em>N, N-Dimetilformamid, %99,8</td> <td>Carl Roth</td><td>A529</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diizopropilamin, %99,5</td> <td>Carl Roth</td><td>2474</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit, %99</td> <td>Carl Roth</td><td>4483</td><td></td></tr><tr><td>Klortritil reçine</td><td>Karbolüsyon</td><td>CC11006</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH, %98</td> <td>Karbolusyon</td><td></td><td></td>CC05014</tr><tr><td>Piperidin, %99Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>104094&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Orn (Dde) -OH</td><td>Iris-Biotech</td><td>FAA1502</td><td></td></tr><tr><td>HATU,% 99</td> <td>Karbolüsyon</td><td>CC01011</td><td></td></tr><tr><td>HOAt,% 99</td> <td>Karbolusyon</td><td>CC01004</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Karbolusyon</td><td>CC05028</td><td></td></tr><tr><td>2-Nitrobenzensülfonil klorür,% 97</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>N11507 & nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-Collidine, %99</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>27690&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetanol, %99&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diazabicycloundecen, %98Sigma</td> <td>Aldrich 139009</td><td>&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-D-Phe-OH, %98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>47378&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asp (OtBu) -OH,% 98</td> <td>Karbolusyon</td><td>CC05008</td><td></td></tr><tr><td>Heksafloroizopropanol</td><td>Karbolüsyon</td><td>CC03056</td><td></td></tr><tr><td>Difenilfosforil azid,% 97</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>178756&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>TFA, %99,9</td> <td>Carl Roth</td><td>P088</td><td></td></tr><tr><td>Triizopropilsilan, %98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>233781&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, HPLC sınıfı</td><td>Carl Roth</td><td>HN44</td><td></td></tr></tbody></table>

kişiye özel prekürsorler tarafından modifikasyon ve guanidin grubu işlevselleştirilmesi

Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

quanidin grubu tıbbi kimyada en önemli pharmacophoric gruplarından biridir. bir guanidin grubunu taşıyan yalnızca bir amino asit arginindir. Bu makalede, peptidik ligandlardaki guanidin grubunun modifikasyonu için kolay bir yöntem olup bir RGD bağlama integrini ligandlann bir örnek temin edilmiştir. Son zamanlarda, bu ligandların guanidin grubunun farklı modifikasyon (αv alt tipleri ve a5 arasında, örneğin) alt-tipinin seçici modülasyonuna izin verir olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, guanidin grubu vasıtasıyla işlevselleştirilmesi için eskiden bilinmeyen bir strateji ortaya konmuştur ve sentetik yaklaşım, bu belgede gözden geçirilmiştir. Burada tarif edilen modifikasyonlar (N-ω) alkile ve asetile guanidin grupları terminal içerir. sentezi için, ısmarlama haberci molekülleri daha sonra ön transfer etmek için bir ortogonal olarak koruması amin ile, bir reaksiyona tabi olan, sentezlenirmodifiye edilmiş guanidin grubudur. Alkile guanidinler sentezi için, ön-N göre, N&#39;-Di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin asillenmiş bileşikleri, seçim, N-Boc- S uygun bir asilleştirilmiş türevidir habercisi sentezlenmesi için kullanılır - Bir ve iki aşamalı reaksiyonla elde edilebilir metilizotiyoüre.

siklik peptit ön-madde, bir lineer peptid gibi sentezlenmiştir siklize ve ortogonal Dde-korumasız hale getirilmiştir. Çökelmesinden sonra, bileşiğin saflığı HPLC-MS (Şekil 1) ile analiz edilmiştir. Reaksiyonun ilerlemesini izlemek için, bir HPLC analizi 2-saatlik reaksiyon süresinden (şekil 2) sonra gerçekleştirilmiştir. guanidin grubu daha büyük artıkları için, 2 saat tepkime süresi, çoğu zam...

tekabül eden ön bileşikler kullanımına dayalı alkil-modifiye edilmiş guanidinler sentezi için bir protokol verilmektedir.

Kişiye özel Prekürsorler tarafından Modifikasyon ve Guanidin Grubu işlevselleştirilmesi

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

Bu prosedürün genel amacı, guanidin işlevselleştirilmiş peptitlere uygun bir sentetik erişim sağlamaktır. Bu yöntem, integrin ligandlarının veya GPCR ligandlarının geliştirilmesi gibi kas peptit kimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, SPPS ile tamamen uyumlu, işlevselleştirilmiş guanidinlere kolay, sentetik bir erişim sağlamasıdır.Teknoloji, dokunsal moleküller için özellikle değerli olacaktır, çünkü modifiye edilen fonksiyonel gruplar tipik olarak bozulan biyomoleküllerdir. Olgumuzda, bireysel kanserlerin farklı özelliklerinin fpr moleküler görüntülemesi ve spesifik tedavisi için kullanılabilecek molekülleri hedefliyoruz; Kişiselleştirilmiş tıp için önemli bir konu. Bu özel prosedüre başlamak için, 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye bir gram boc-pirazol karboksamaidin ve bir gram PPh3 ekleyin.Daha sonra, kauçuk bir septum yoluyla inert bir atmosferde 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye 10 mililitre kurutulmuş THF ekleyin. Bir şırınga kullanarak 194 mikrolitre kuru metanol ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında karıştırın.Bir şırınga kullanarak, THF içinde 15 dakika boyunca damla damla hazırlanmış bir diizopropi

modification-functionalization-guanidine-group-tailor-made

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bir HMBA reçineden Yarılma Prosedürü: "emniyet yakalamak" kullanılarak, bir fonksiyonlandırılmış bis-peptit trimerininkinden verimli bir katı-faz peptid sentezi açıklanmaktadır.

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi &quot;Güvenlik&quot; Catch Kullanımı

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Bu video zincir polimerizasyonların gizlenmemesi ve hidrojel sentezini sağlayan, poli (etilen glikol), metakrilat, hızlı, verimli bir yöntem gösterecektir. Bu benzer, fonksiyonlandırmalar verimliliğini değerlendirmek giderme ve gelişmiş değişiklikler için öneriler sunmak ve tipik hidrojel karakterizasyon teknikleri göstermek için peptidler, detay ortak analitik yöntemler içine metakrilamit işlevlerini tanıtmak için nasıl gösterecektir.

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Burada, aminoguanidin içeren küçük organik moleküllerin hızlı toplam sentezini sağlayan doğrudan, erken aşama guanidinilasyon için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak bir kan pıhtılaşma faktörü XIa inhibitörünün sentezinde kullanılan gelişmiş bir sentetik ara ürün hazırlandı.

Karmaşık Aminoguanidine içeren Doğal Ürünler Sentezi için bir Direct, Erken Evre Guanidinylation Protokolü

2-aminobenzofenonlar, tiyoüre ve dimetil sülfoksitten 4-sübstitüe kinazolin türevlerinin kolay hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

4-Değiştirildi Kinazolin Türev kolay hazırlanması

Hücre ve ilaç iletimi için cihazlar olarak RGD ile işlevselleştirilmiş hidrojellerin sentezi için bir protokol sunuyoruz. Prosedür, alkin ile modifiye edilmiş poliakrilik asit (PAA) ile bir RGD-azid türevi arasında bakır katalizli alkin-azid siklo ilavesini (CuAAC) içerir. Hidrojeller, mikrodalga destekli polikondensasyon kullanılarak oluşturulur ve fizikokimyasal özellikleri araştırılır.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

Nsentezi için temsil edici deneysel prosedürler-(2-alkoxyvinyl) sülfonamidler ve sonraki phthalan ve fenetilamin türevleri için ayrıntılı olarak sunulmaktadır.

Nhazırlanması-(2-alkoxyvinyl) N- tosyl-1,2,3-triazoles ve yerine Phthalans ve fenitilaminler sonraki dönüşüm sülfonamidler

Burada, bir geçici koruma ribonucleosides ile regioselective O- glikozilasyon tarafından iletişim kuralları disaccharide nükleozitler sentezi için mevcut onların 2', döngüsel bir boronic ester kullanan 3'-diol moieties. Bu yöntem Adenozin, guanozin sitidin Üridin 5-methyluridine ve ilgili disaccharide nükleozitler vermek 5-fluorouridine gibi birkaç korumasız nükleozitler uygulanır.

Regioselective O- glikozilasyon nükleozitler üzerinden geçici 2', 3'-Diol koruması tarafından Boronic Ester Disaccharide nükleozitler sentezi için

Trikarbonil(tropon)demire amin nükleofillerin eklenmesi ve ortaya çıkan komplekslerin sonraki demetallasyonu için temsili deneysel prosedürler ayrıntılı olarak sunulmuştur.

Trikarbonil(tropon) demir ilerbulu 6-aminosiklohepta-2,4-dien-1-bir Türevlerinin hazırlanması

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

Öğrenin guanidin fonksiyonelleştirilmiş peptitlerin sentezi için kişiye özel prekürsörlerle modifikasyon yöntemini. Bu teknik kas peptit kimyası ve kişiselleştirilmiş tıpta hedefli tedaviler geliştirmeye yardımcı olur.

Kişiye özel Prekürsorler tarafından Modifikasyon ve Guanidin Grubu işlevselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet