Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying

Bu analizin genel amaçları, mısır yaprak büyümesinin hücresel temelini belirlemek ve gelişimsel, evreye özgü örnekleme stratejileri uygulayarak bu verileri moleküler büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için kullanmaktır. Bu yöntem, bitki gelişim biyolojisindeki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Hücre bölünmesi ve hücre genişlemesi, tüm organ büyümesindeki farklılıklara nasıl katkıda bulunur?

Bu yaklaşım, tüm bitki organının büyümesinin temelini oluşturan biyokimyasal moleküler ve fizyolojik süreçlerin araştırılmasına ve uzaysal olarak haritalandırılmasına olanak tanır. Bu sistem mısır yaprak büyümesi hakkında bilgi sağlayabilse de, teknik diğer sistemler için de kullanılabilir. Buna diğer ot türleri ve organlar dahildir.

Bu yöntemlerin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir. Hasat, örnek bi-blasyon ve ölçüm adımlarının bu gösterim olmadan gerçekleştirilmesi zordur. Prosedürü Katrien Sprangers ve Viktoriya Avramova gerçekleştirecektir.

Laboratuvarımdan iki doktora öğrencisi. Tek çeneklilerde yaprak büyümesinin tam kinematik analizini gerçekleştirmek için, her bir işlem ve genotip için bir büyüme odasında, kontrollü koşullar altında en az 15 bitki yetiştirin. İlgilenilen yaprak ortaya çıktığında, yaprak tamamen genişleyene kadar her gün bir cetvel kullanarak yaprağın uzunluğunu, yani topraktan yaprak ucuna kadar olan mesafeyi ölçün.

İlgilenilen gelişim aşamasında, meristematik bölgeyi sağlam tutmak için, en az beş temsili bitkinin toprak üstü kısmını köklere mümkün olduğunca yakın bir noktadan kesin. Ardından, dış yapraklardan başlayarak, ilgilenilen yaprağa kadar tüm yaprakları tek tek nazikçe açın. Yaprakları ayırmak için gerektiğinde taban kısmından birkaç ekstra milimetre kesin.

Ardından, apeksi ve ilgili yaprak tarafından çevrelenen küçük yaprakları çıkarın ve orta damarın bir yanındaki tabandan başlayarak yapraktan üç santimetrelik bir segment kesin. Yaprağı tam olarak gövdeye bağlandığı noktadan kesmek kritik öneme sahiptir; çünkü çok yukarıdan kesmek, meristem boyutunun olduğundan küçük tahmin edilmesine yol açar.

Segmenti, üç iki bir hacimce hacim oranında mutlak etanol asetik asit çözeltisi ile doldurulmuş 1.5 mililitrelik bir test tüpünde, dört derece Celsius'ta 24 saatten birkaç aya kadar saklayın. Venin diğer tarafından, tabandan itibaren 11 santimetrelik bir segment kesin ve pigmentleri uzaklaştırmak için bu segmenti mutlak etanol ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir tüpte, dört derece Celsius'ta en az altı saat saklayın. Dört derece Celsius'ta mutlak etanol içinde geçirilen ikinci bir 24 saatlik sürenin ardından, etanolü saf laktik asit ile değiştirin ve segmenti dört derece Celsius'ta başka bir 24 saat boyunca veya ileri analizlere kadar saklayın.

Meristemi ölçmek için, öncelikle üç santimetrelik yaprak segmentini taze hazırlanmış durulama tamponuna 20 dakika boyunca aktarın. İnkübasyonun sonunda, segmenti Dapi boyama çözeltisi bulunan bir kaba aktarın ve buz üzerinde, karanlıkta iki ila beş dakika bekletin. Ardından, dokuyu hızla bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve segmentin üzerini bir lamelle kapatın.

UV floresans kullanarak, epidermal hücrelerin floresansını bir mikroskop altında doğrulayın. Ardından, numuneyi yeni bir lam ve yeni bir lameli kullanarak bir damla durulama tamponu içine yerleştirin. 20 kat büyütme kullanarak segmenti mikroskoba geri yerleştirin ve proliferatif mitotik figürleri bulmak için numuneyi tarayın.

Gelişmekte olan stemmataların herhangi bir formatif hücre bölünmesini önleyin ve ardından en distal mitotik figürün konumunu belirleyin. Bir görüntü analiz yazılım programı kullanarak görüntü çerçevesinin tam uzunluğunu ölçün. Bu örnekte, 645 micrometer.

Ardından, en distal mitotik figürden yaprak tabanına kadar olan tüm meristem uzunluğunu kapsayan kare sayısını sayın ve tüm meristem uzunluğunu elde etmek için bu sayıyı bir karenin uzunluğu ile çarpın. Bir hücre uzunluğu profili elde etmek için, 11 santimetrelik segmenti laktik asitten çıkarıp tezgaha alın ve dokuyu 10 adet bir santimetrelik segmente bölmek için bir skalpel kullanın. Elde edilen yaprak segmentlerini tek bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve küçük bir damla laktik asit ekleyin.

Tüm parçalar aynı yüzeyleri yukarı gelecek şekilde yerleştirilir. Ardından, lam diferansiyel kontrast optikleriyle donatılmış bir mikroskobun altına transfer edilir. Yaprak tabanına en yakın segmentten başlayarak, her bir segment boyunca eşit aralıklı konumlarda aynı hücre tipinin tutarlı bir şekilde seçilmesini sağlamak için, stematal sıralara doğrudan komşu olan en az 20 tekrarlı epidermal hücrenin ve sıranın uzunluğunu ölçmek amacıyla uygun bir görüntü analiz yazılım programı kullanılır.

Yaprak boyunca her bir ölçüm için karşılık gelen konumu not etmeye özen gösterin. Ardından, ek dosya bir olarak sunulan R script'inde uygulanmış yerel polinom düzeltme işlemi kullanarak yaprak ekseni boyunca her milimetredeki ortalama hücre uzunluğunu belirleyin. Aşırı düzeltme yapmamaya dikkat edin.

Yumuşatma işlemi, hücre verilerindeki gürültüyü gidermeli ancak eğrinin genel şeklini etkilememelidir. Burada, iyi sulanmış bitkiler ile kuraklık stresine maruz bırakılmış bitkilerin yaprak büyümesi açısından karşılaştırması gösterilmektedir. Kontrol bitkilerinin nihai yaprak uzunluğu, daha düşük yaprak uzama hızı nedeniyle, kuraklık stresine maruz kalan bitkilerden yüzde 40 daha düşüktü.

Kuraklık stresine maruz kalan bitkilerin yaprak uzama hızı, azalan hücre üretimi nedeniyle, iyi sulanan kontrol grubuna göre yüzde 73 daha düşüktür. Bu durum ise temel olarak hücre bölünme hızındaki azalmadan kaynaklanmaktadır. Kinematik analiz, yaprak büyüme bölgesinin lokalizasyonuna dair bir harita sağlayarak, moleküler ve biyokimyasal analizler için alt bölgesel çözünürlükte örnekleme yapılmasına olanak tanır.

Örneğin, iyi sulanan kontrol ve kuraklık koşullarına maruz kalan mısır yaprağının büyüme bölgesi boyunca yapılan MDA kantifikasyonu, su kısıtlaması koşullarına yanıt olarak büyüme bölgesi genelinde bu lipid yıkım ürününün anlamlı bir şekilde arttığını göstermektedir. Kuraklığa yanıt olarak yaprağın kısalması nedeniyle, bu deneyde gelişim bölgeleri kontrol ve stresli bitkiler arasında karşılıklı olarak örtüşmemiştir. Ancak, hücre uzunluğu profili kullanılarak gelişim bölgelerinin uzunluğu belirlenebilir ve böylece münferit bölgelerdeki MDA seviyelerinin karşılaştırılması sağlanabilir.

Teknik düzgün bir şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra tek bir örnek dört saat içinde işlenebilir. Bu prosedür uygulanırken, toplama sırasında meristemin bütünlüğünün korunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Büyüme düzenlemesindeki rollerini incelemek amacıyla, bu prosedürün ardından moleküler ve biyokimyasal parametrelerin belirlenmesi gibi diğer teknikler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, büyümekte olan mısır yaprağında hücre bölünmesi ve hücre genişlemesi nasıl nicelleştirilir, farklı büyüme bölgelerinin boyutları nasıl belirlenir ve moleküler ve biyokimyasal veriler buna göre nasıl yorumlanır konularında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Laktik asit, asetik asit ve EDTA ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bu prosedürü uygularken eldiven giymek ve mikroskobun her bir evresini kullandıktan sonra temizlemek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.