Name: Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying Zea mays Yapraklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin mısır yapraklarında hücre bölünmesi ve genişlemesini nicelendirmeyi, bitki gelişim biyolojisinde büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için. Bu yöntem diğer çim türlerine de uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma VA Anvers Üniversitesi&#39;nden bir doktora bursu ile desteklenmiştir; KS Flamanca Bilim Vakfı (FWO, 11ZI916N) bir doktora bursu; FWO (G0D0514N) proje hibeleri; uyumlu bir araştırma faaliyeti (GOA) Araştırma hibe, Antwerp Üniversitesi araştırma konseyinden &quot;Yaprak Morfogenez A Sistem Biyolojisi Yaklaşımı&quot;; ve Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar (IUAP VII / 29, MARS), tüm video katkıda GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani ve Hamada AbdElgawad için Belçika Federal Bilim Politikası Dairesi (BELSPO) den &quot;Mısır ve Arabidopsis Kök ve Büyüme Vur&quot; .

NOT: kinematik analiz için aşağıdaki protokol kararlı durum büyüme sırasında yaprakları için geçerlidir. Bu, birkaç gün 6 bir süre boyunca sabit bir yaprak uzama oranı ve hücre boyu ve yaprak genişlemesinin uzamsal desen anlamına gelmektedir. 1. Bitki Büyüme ve Yaprak Uzama Oranı Ölçümleri (LER) <ol><li> kararlı hal büyümesinde bir yaprak ve ilgi gelişimsel aşaması seçin. NOT: Aynı eksen üzerinde ardışık yapraklar üzerinde benzer mekansal kalıpları ima kararlı durum büyüme ve tekrarlayan büyüme arasında bir fark yoktur. Fide büyümesinin ilk aşamalarında, ardışık yaprakları genellikle büyüme bölgesi 7 artan boyutu giderek daha hızlı nedeniyle büyür. Bir kaç yüksek yaprak pozisyonları benzer bir büyüme modeli 8 olabilir, ancak bu soruşturma kapsamında tedavi etkilenebilir geçici aşamasıdır. Çizgiler ve tr karşılaştırmak için önemlidir<html> farklı bir zamanda gelişen olabilir olsa bile, kesinlikle aynı yaprak pozisyonunda eatments. Hatta sabit bir uzama hızında, büyüme hızı profili mutlaka farklı gelişim aşamalarında aynı değildir. Nedenle, tipik olarak ortaya çıkması gün sonra sayısı ile tanımlanan aynı gelişim aşamasında 8, yaprakları analiz etmek önemlidir. </li><li> büyüme odasında kontrollü koşullar altında her tedavi ve genotip için en az 15 bitki büyümesi, monokotlarda yaprak büyüme tam kinematik analizini yapmak. </li><li> Yaprak tamamen (Şekil 1i) genişletilmiş kadar ilgi yaprak (çevreleyen yaprakların ağırşak gelen ortaya çıkması) belirir anda bir cetvel ile günlük yaprak uzunluğu ölçme başlar. Yaprak uzunluğu yaprak ucuna toprak seviyesinden uzunluğunu ifade eder. Bu büyümesini değiştirebilecek beri, kırmak veya yaprak zarar vermemek için dikkatli olun. </li></ol>1 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Mısır yapraklarından bir kinematik analiz şematik bakış ilgi yaprak Yaprak Uzama Oranı (LER) hesaplamak için üç gün boyunca bir cetvel ile ölçülür. Bundan sonra, yaprak hasat edilir ve üç santimetre kademeli bir meristem boyutunun saptanması için kullanılmaktadır. Bu DAPI boyama sonra en uzak mitotik rakam tabanından yukarıya doğru uzunluğu ölçülerek yapılır. Proliferatif mitoz ve (B) biçimlendirici mitoz (A) örnekler. ortası ven diğer tarafında yaprak tabanından ilk on santimetre hücre boyu ölçümleri için 1001 santimetre kesimleri kesmek için kullanılmaktadır. Bu ölçümler olgun hücre uzunluğu (l mat) ve meristem (l div) ayrılan hücrelerin uzunluğunu belirlemek için hizmet veren hücre uzunluğu profili oluşturmak için temel sağlar. <el div ve L mer meristem (N mer) hücrelerin sayısını hesaplamak için kullanılır ise m&gt; Ler ve l mat, hücre üretim oranı (P) hesaplanması için kullanılır. Buna karşılık, P ve N mer, hücre döngüsü süresi (T c) tersi olan ortalama hücre bölünmesi oranı (D) hesaplamak için kullanılır. Aynı renkteki oklar bu oklara aşağıdaki parametreyi hesaplamak için kullanılan parametreleri gösterir. Ölçek çubukları 40 mikron =. Roma sayılar protokol açıklanan spesifik deneysel yöntemlere başvurmak için kullanılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Hasat <ol><li> Ilgi gelişim aşamasında (örneğin, çıktıktan sonra, üçüncü gün), en az beş Örnek p tercihpartiden lants hangi kinematik analiz yapmak için. Nihai yaprak uzunluğunu belirlemek için adım 1.3 açıklandığı gibi bitkilerin dinlenme ölçüm devam edin. </li><li> Bitkinin toprak üstü bölümünü kesmek. Köklerine mümkün olduğunca yakın kesim, bozulmamış (Şekil 1ii) meristematik bölümünü tutmak için. </li><li> dış yaprakları itibaren yavaşça teker teker unrolling tüm ilgi yaprak kadar bırakır kaldırın. Gerekirse, yaprakları ayırmak için tabanından birkaç ekstra milimetre kaldırın. Ayrıca faiz (Şekil 1iii) yaprak çevrelediği apeks ve küçük yaprakları temizleyin. </li><li> ortası damarın bir tarafta tabandan başlayan bir 3 cm bölümü kesmek ve 3 ile doldurulmuş bir 1.5 mi test tüpü içinde saklayın: 1 (hacim: hacim) mutlak etanol: asetik asit solüsyonu (DİKKAT: eldiven giymek) de birkaç ay 24 saat kadar, 4 ° C (Şekil 1iv). Bu bölüm daha sonra meristem uzunluğunu belirlemek için kullanılır. </li><li> itibarendamar diğer tarafında, tabandan 11 cm bir bölümü kesilmiş (Şekil 1 V) ve pigmentlerin (Şekil 1 vi) çıkarmak için en az 6 saat boyunca 4 ° C&#39;de mutlak etanol ile doldurulmuş bir 15 ml tüp içine koyun. NOT: Daha sonra, (Tartışma) hücre uzunluğu profilini belirlemek için sadece ilk 10 cm kullanın. </li><li> En az 24 saat (Şekil 1vi) 4 ° C &#39;de temizlik bir tur için mutlak etanol yenileyin. </li><li> Son olarak, saf laktik asit ile mutlak etanol yerine (DİKKAT: eldiven giymek) temizleme ve depolama için, 4 ° C&#39;de 24 saat süre ile ya da daha sonra kullanmak (Şekil 1vi kadar). </li></ol> 3. Meristem Uzunluk Ölçümleri <ol><li> 50 mM sodyum klorür (NaCl), 5 mM etilendiamintetraasetik asit içeren bir yıkama tamponu hazırlayın (EDTA, DİKKAT: eldiven aşınma) ve 10 mM Tris (hidroksimetil) aminometan-hidroklorik asit (Tris-HCI, pH 7). </li><li> bölüm 2.4 ve böylece 3 cm segmenti alın20 dakika (Şekil 1vii) için tampon içinde ak. </li><li> beklerken, buz üzerinde ve karanlıkta tutarak, 1 ug / ml&#39;lik bir 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama solüsyonu hazırlamak için durulama tamponu kullanın. </li><li> DAPI boyama çözeltisi 2-5 dakika boyunca, meristem segmenti yerleştirerek çekirdekleri leke. Buz üzerinde ve koyu (Şekil 1vii) çalışın. </li><li> hızlı bir şekilde mikroskop camına segmenti montaj ve cam kapak ile kaplayıp floresan sinyal olup olmadığını kontrol edin. epidermal hücreler ise altta yatan hücre tabakaları olmamalı, floresan göstermelidir. </li><li> boyama yeterli değilse, bazı ekstra dakika için DAPI boyama çözeltisi geri segmenti koydu. </li><li> , Lekelenmeye durdurmak kapak camı ile bir mikroskop lamı ve kapağında tampon durulama bir damla segmentleri monte etmek için. </li><li> 1.000 Epiderm görselleştirme için izin veren bir 20X büyütmede UV floresan ile donatılmış bir mikroskop kullanınal hücreleri bir kerede. Segmenti boyunca ilerleyin ve proliferatif mitoz (metafaz, anafaz, telofaz ve sitokinez) için bakmak, ama gelişmekte olan stoma (Şekil 1viii) biçimlendirici hücre bölünmesini önlemek 9. En uzak mitotik figür bulunduğu tanımlayın. </li><li> yaprak tabanı ve en distal epidermal mitotik figür arasındaki mesafeyi ölçerek meristem uzunluğunu belirler. Resim çerçevesi tam uzunluğunu ölçmek için bir görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanın. <ol><li> (En uzak mitotik rakam yaprak tabanından) tam meristem uzunluğunu kapsayan kare sayısını ve tam meristem uzunluğu (Şekil 1IX) elde etmek için bir çerçeve uzunluğu çarpın. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Uzunluğu Profili <ol><li> laktik asit (adım 2.5) saklanır segmenti alın ve bankta dikkatlice yerleştirin. segmentler zekâ Cut1 cm her (Şekil 1x) 10 segmentlerinde ha neşter. </li><li> laktik asit, küçük bir damla bir mikroskop lamı üzerine birbirini takip eden yaprak segmentleri monte edin. sürekli polar taraf veya eksen dışı tarafı yukarı ya yüz emin olun. Prensip olarak, belirli bir tarafı için bir tercih edilmektedir. </li><li> Yaprak tabanından başlayarak, segmentleri analiz diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. sürekli aynı hücre tipini seçmek için bir görüntü analiz yazılımı ile stoma dosyalara doğrudan bitişik dosyaları en az 20 tekrarlı epidermal hücrelerin uzunluğunu ölçün. <ol><li> Segmentler (segment yeterli olurken başına 4 pozisyon) her biri boyunca eşit aralıklı pozisyonlarda bunu ve yaprak (Şekil 1xi) boyunca her ölçüm için ilgili pozisyon yazmak emin olun. </li></ol></li><li> Yerel bir polinom düzeltme s kullanarak yaprak ekseni boyunca her mm ortalama hücre uzunluğunu belirlemekrocedure, R-script (; Ek Dosya 1 Şekil 1xii) uygulanan. NOT: R-komut yumuşatma artan veri bir dizi sağlar. Gerekli düzgünleştirme miktarı sadece yerel gürültü çıkarmak, ama genel eğri etkilememelidir ideal biraz keyfi ve. bir deney içinde tüm örnekler için yumuşatma aynı miktarda kullanmaya dikkat edin. </li><li> bitkiler arasındaki her pozisyonda hücre uzunluğu ortalama ve yaprak ekseni boyunca bir hücre uzunluğu profili oluşturmak için standart hata hesaplayın. </li></ol> Kinematik Parametrelerinin 5. Hesaplamaları (Ek Dosya 2 bakınız) <ol><li> (Adım 1.3 olarak örneğin 24 saat) iki ardışık zaman noktaları arasında yaprak uzunluğu değişimi alarak ve zaman aralığı bölünerek LER hesaplayın. </li><li> Hücreler kendi olgun ce% 95 ulaşır nerede tabanından pozisyon distaline karşılık gelen büyüme bölgesi (L gz) uzunluğunu hesaplamakdüzeltilir hücre uzunluğu profilde ll uzunluğu. <ol><li> Bu konumda (Şekil 2) Aşağıdaki tüm hücre uzunluklarının ortalama düzeltilir hücre uzunluğu profili% 95 üzerindeki her pozisyon için atın. </li><li> Her pozisyonda hesaplanan% 95 hücre uzunluğu ile düzeltilir hücre uzunluklarını (adım 4.4) karşılaştırın. (; Ek Veriler 2&#39;ye bakınız Şekil 2) yaprağın tabanından başlayarak, büyüme bölgesi gerçek hücre uzunluğu aşağıdaki hücre uzunlukları% 95 eşit konumda biter. </li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Şekil 2:. Büyüme bölgesinin son belirleme meristem: yıldız simgesi ile gösterilen pozisyonda, gerçek hücre boyutu% 95&#39;inden daha az, bu konumu, aşağıdaki tüm hücrelerin ortalama hücre boyutuna (kırmızı çizgi) (kırmızı katı hat). Büyüme bölgesi (L gz sonu; ab ile gösterilir% 95 bu pozisyonda (katı mavi çizgi izleyen tüm hücrelerin ortalama hücre boyutu (noktalı mavi çizgi)) gerçek hücre boyutunu eşittir lue yıldızı) yer almaktadır. Küme bölgesi (D), uzama bölgesi (E), ve olgun bölgesi (M). Kesikli oklar, yerel boyut ve yaprak ucu bazal pozisyonlarda hareket yaprak uzak kısmı üzerinde ortalama büyüklüğü% 95 arasında yakınlaşmayı gösteriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Büyüme bölgesi (L gz) ve meristem boyutu uzunluğu arasındaki fark olarak uzama bölgesi (L el) uzunluğunu hesaplamak (L mer; 3. adımda belirlenen). </li><li> Olgun bölgede ortalama hücre uzunluğu gibi olgun hücre uzunluğu (l mat) hesaplayın. </li><li> Elde etmek için l mat LER bölünHücre üretim hızı (P). </li><li> N GZ ve N mer arasındaki fark olarak uzama bölgesi (N El) hücre sayısını hesaplayın. Meristem (N mer) hücre sayısı meristem mukabil aralıklarla yer alan hücrelerin toplam sayısına eşittir. Büyüme bölgesi (N gz) hücrelerin sayısı büyüme bölgesine tekabül eden aralıklarda bulunan hücrelerin toplam sayısına eşittir. </li><li> P / N mer olarak ortalama hücre bölünmesi oranı (D) hesaplayın. Hücre döngüsü süresi (T c) ln (2) / D eşittir. </li><li> P N el bölerek uzama bölgesi (T el) zamanı hesaplayın. Bölünme bölgesinde zaman günlüğü 2 (N mer) * T c eşittir. Meristemi ayrılan hücrelerin uzunluğu (l div)meristem sonunda düzeltilir hücre uzunluğu profilinden hücre uzunluğuna eşittir. </li><li> Ln (l mat) -ln (l div)] / T el: ortalama aşağıdaki formül kullanılarak hücre genişleme oranı (R el) hesaplayın. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

mısır yapraklarında tam kinematik analiz yaprak büyüme hücresel bazda tespitine imkan ve verimli örnekleme stratejilerinin tasarımı için izin verir. protokol nispeten basit olmasına rağmen, bazı dikkatli takip kritik adımlarda tavsiye edilir: (1) meristem uzunluğu tayini (adım 3) beri, meristemi zarar vermeden genç, kapalı yaprakları (2.3 adım) ayırmak için önemlidir tam gerektirir meristem mevcut olması. Bazı uygulama önceden gerekebilir. (2) Meristematik uzunluğu tayini mitoz yorumuna dayanmaktadır. Bu nedenle, biz bi...

Büyüme analizi yaygın çevresel faktörlere genotipi belirlenmiş büyüme farklılıkları ve / veya fenotipik yanıtları tanımlamak için bitki bilim adamları tarafından kullanılan araçlar bir dizi bağlıdır. Onlar büyümenin altında yatan mekanizmaları keşfetmek için boyut ve ağırlık tüm tesisin ölçümleri veya uzuv ve büyüme oranları hesaplamalarını içerir. Organ büyümesi hücresel düzeyde hücre bölünmesi ve genişleme ile belirlenir. Bu nedenle, analiz büyüme bu iki sürecin ölçümü de dahil olmak üzere tüm organ büyümesi 1. farklılıkları anlamanın anahtarıdır. Sonuç olarak, uzman olmayan laboratuvarlar tarafından kullanımı nispeten kolaydır hücresel büyüme parametrelerini belirlemek için uygun bir yöntem olması çok önemlidir. Kinematik analiz zaten Organ büyüme modelleri 2 geliştirilmesi için güçlü bir çerçeve sağlayarak bir yaklaşım olarak kurulmuştur. teknik lineer sistemler için optimize edilmiştir,Bu Arabidopsis thaliana kökleri ve monokotiledon yapraklar gibi, aynı zamanda bu tür çift filizli yaprak 3 arasındaki doğrusal olmayan sistemleri de olabilir. Günümüzde bu yöntem giderek nasıl genetik, hormonal, gelişimsel incelemek için kullanılıyor, ve çevresel faktörler, hücre bölünmesini ve çeşitli organlarda genişleme (Tablo 1) etkilemektedir. Sınırlamalar bitki materyali yüksek miktarda gerektiren teknikler (örneğin, metaboliti organ büyüklüğü ve mekansal organizasyon tarafından empoze edilebilir, ancak Ayrıca, aynı zamanda, bunların altında yatan, biyokimyasal, moleküler ve fizyolojik düzenlemelere (Tablo 2) hücresel süreçleri bağlamak için bir çerçeve sağlar ölçümler, proteomik, vs.). Mısır (Zea mays), yaprak, gibi monokotiledonlu yapraklar, ardışık olarak, olgun ulaşmak meristem ve uzama bölgesi boyunca geçen hücreler, uca doğru yaprak tabanından hareket içinde lineer sistemleri temsil ederbölge. Bu büyüme 4 mekansal desen nicel çalışmalar için ideal bir model sistem yapar. Ayrıca, mısır yaprağı (birkaç santimetre 5 yayılan meristemi ve uzama bölgesi) büyük büyüme bölgeleri ve diğer örgütsel düzeyde çalışmalar için olanaklar sağlar. Bu moleküler teknikler fizyolojik ölçümler, hücre biyolojisi yaklaşımları (Tablo 2), bir dizi aracılığıyla kinematik analizi ile saptanır hücre bölünmesini ve genişleme, kontrol (farazi) düzenleyici mekanizmalardan incelenmesi için izin verir. Burada, monokot yaprakları bir kinematik analizi yapmak için bir protokol sağlar. İlk olarak, biz yaprak ekseni boyunca pozisyon ve nasıl kinematik parametreleri hesaplamak için bir fonksiyonu olarak, hücre bölünmesi ve hücre uzaması hem uygun bir analiz yapmak için nasıl açıklar. İkinci olarak, bu örnekleme dizaynı için bir temel olarak kullanılabilir şeklini göstermektedir. Burada, iki vakayı tartışmak: yüksek çözünürlüklü örneklemesid sırasıyla geliştirilmiş veri yorumlama ve zaman / para tasarrufu sağlayan, örnekleme duruldu. Kinematik Tablo 1. Genel hücre bölünmesi ve çeşitli organlarda genleşme ölçümü için analiz yöntemleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> organ </td><td> referans </td></tr><tr><td> çenekli yapraklar </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> kök uçları </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> iki çenekli yapraklar </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> apikal meristemi ateş </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Kinematik Tablo 1. Genel hücre bölünmesi ve çeşitli organlarda genleşme ölçümü için analiz yöntemleri. Moleküler düzeyde düzenlemeye kinematik analizi ile saptanır hücresel süreçleri arasındaki Tablo 2. bağlantı. Çeşitli türlerde ve organlarda biyokimyasal ve moleküler deneyleri sonuçlarına hücresel süreçlerin ölçümü bağlayan çeşitli çalışmalar yapılan atıflar. Eksiloglukan endotransglucosylase (XET), malondialdehit (MDA), siklin bağımlı kinazlar (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Saksılar</td><td>Herhangi Herhangi</td><td>Bir</td><td>Saksıları aşağıdaki ölçülerde kullanıyoruz, ancak tedaviye/çalışmaya bağlı olarak farklı olabilir: alt çap: 11 cm, açıklık çapı: 15 cm, yükseklik: 12 cm. Saksı başına bir mısır bitkisi yetiştiriyoruz.</td></tr><tr><td>Dikim substratı</td><td>Herhangi Herhangi</td><td>Bir</td><td>Saksı ortamı kullanıyoruz (Jiffy, Hollanda), ancak tedaviye/çalışmaya bağlı olarak başka substratlar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Cetvel</td><td>Herhangi</td><td></td><td>Herhangi Herhangi Bitkilerin son yaprak uzunluğunu ölçmek için en az 1,5 metreyi kaplayan bir uzatma cetveli gereklidir.</td></tr><tr><td>Tohumlar</td><td>: Herhangi bir</td><td>NA</td><td>Tohumu bir yetiştiriciden sipariş edilebilir.</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>Neşter, yaprak hasadı sırasında ilgilenilen yaprağı çevresindeki yapraklardan ayırmak için ve hasattan hemen sonra hücre uzunluğu ve meristem uzunluğu ölçümleri için uygun bir numune kesmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>15 mL falcon tüpleri</td><td>Herhangi Herhangi</td><td></td> Bir <td>15 mL'lik falcon tüpleri, mutlak etanol ve laktik asit ile numune temizleme sırasında hücre uzunluğu ölçümleri için kullanılan numuneleri saklamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Herhangi Herhangi</td><td></td><td>Eppendorf tüpleri, meristem uzunluk ölçümleri için kullanılan numuneleri etanol:asetik asit 3:1 (v:v) çözeltisinde saklamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>Lateks eldiven, aşındırıcı reaktiflere karşı koruma sağlar.</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>DİKKAT: Metaller için aşındırıcı, kategori 1 Cilt korozyonu, kategori 1A, 1B, 1C Ciddi göz hasarı, kategori 1; Yanıcı sıvılar, kategori 1,2,3</td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>DİKKAT: Cilt teması (tahriş edici), göz teması (tahriş edici), soluma durumunda tehlikelidir. Cilt teması (geçirgen), yutulması durumunda hafif tehlikeli</td></tr><tr><td>Laktik asit&nbsp; >%98</td> <td>Herhangi Bir</td><td></td><td>DİKKAT: Metaller için aşındırıcı, kategori 1 Cilt aşınması, kategori 1A,1B,1C Ciddi göz hasarı, kategori 1</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>DİKKAT: Akut toksisite (oral, dermal, soluma), kategori 4 Cilt tahrişi, kategori 2 Göz tahrişi, kategori 2 Cilt hassasiyeti, kategori 1 Spesifik Hedef Organ Toksisitesi &ndash; Tek maruz kalma, kategori 3</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl)</td> <td>Herhangi</td><td></td><td>Herhangi Bu malzeme tahriş edici olabilir, göz ve cilt ile temasından kaçınılmalıdır. Tozun solunması solunum yollarını tahriş edebilir.</td></tr><tr><td>4 & prime ;, 6-Diamidin-2 & prime; -fenilindol dihidroklorür (DAPI)</td> DNA için <td>herhangi bir</td><td></td><td>Hücre geçirgen floresan minör oluk bağlama probu. Cilt tahrişine neden olur. Alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Solunum yolu tahrişine neden olabilir.</td></tr><tr><td>Buz</td><td>: Herhangi bir</td><td>NA</td><td>DAPI çözeltisi buz üzerinde tutulmalıdır.</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>AxioScope A1, Zeiss'tan Axiocam ICm1 veya diğer</td><td></td><td>Meristem uzunluğunu belirlemek için herhangi bir floresan mikroskop kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mikroskobik slayt</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Herhangi Bir</td><td>Cımbız</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Herhangi</td><td>Bir Cımbız, hücre uzunluğu ve meristem uzunluğu ölçümleri için uygun bir numuneyi kesmek amacıyla hasattan hemen sonra haddelenmiş mısır yaprağını açmak için gereklidir.</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss NA'dan görüntü analiz yazılımı Axiovision (Sürüm 4.8)</td><td></td><td>Yazılım şu adresten indirilebilir: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gibi diğer yazılımlar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>DIC</td><td>AxioScope A1, Zeiss'tan Axiocam ICm1 veya başka</td><td></td><td>bir mikroskop Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ile donatılmış herhangi bir mikroskop, hücre uzunluklarını ölçmek için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>R istatistiksel analiz yazılımı</td><td>R İstatistiksel Hesaplama Vakfı</td><td>NA</td><td>Açık kaynak; https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>R script</td><td>NA</td><td></td> adresinden indirilebilir <td>Kern Smooth paketinin çekirdek yumuşatma işlevi locpoly'sini kullanıyoruz (Wand MP, Jones MC.&nbsp; Çekirdek Yumuşatma: Chapman & Salon/CRC (1995)). Komut dosyası, ilgili yazarla görüşüldükten sonra Mac ve Windows için kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

hücre bölünmesi ve genişleme kinematik analizi: büyüme ve Örnekleme gelişim bölgeleri hücresel temeli quantifying<em&gt; zea mays</em&gt; yapraklar

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Büyüme analizleri, bitki biliminde genellikle zıt genotipleri ve çevresel koşulların etkisini araştırmak için kullanılır. Bu analizlerin hücresel yönü çok önemlidir, çünkü büyüme hücre bölünmesi ve hücre uzaması tarafından yönlendirilir. Kinematik analiz, bu iki süreci ölçmek için bir metodolojiyi temsil eder. Ayrıca, bu tekniğin uzman olmayan laboratuvarlarda kullanımı kolaydır. Burada, monokotiledonlu mısır (Zea mays) yapraklarında kinematik analiz yapmak için bir protokol sunuyoruz. İki yön sunulmaktadır: (1) hücre bölünmesi ve genişleme parametrelerinin ölçülmesi ve (2) gelişim bölgelerinin yerinin belirlenmesi. Bu, numune alma tasarımı için bir temel teşkil edebilir ve/veya yaprak büyüme bölgesinde yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip biyokimyasal ve moleküler ölçümlerin veri yorumlaması için faydalı olabilir. Mısır yapraklarının büyüme bölgesi, kararlı durum büyümesi sırasında hasat edilir. Bireysel yapraklar, bir DAPI boyası kullanılarak meristem uzunluğu tayini ve DIC mikroskobu kullanılarak hücre uzunluğu profilleri için kullanılır. Protokol, en az birkaç santimetreye yayılan büyüme bölgeleri ile kararlı durum büyümesi sırasında hasat edilen ortaya çıkan monokotiledonlu yapraklar için uygundur. Bitki büyümesi düzenlemesinin anlaşılmasını geliştirmek için, büyüme ve moleküler çalışmalara ilişkin veriler birleştirilmelidir. Bu nedenle, kinematik analizin önemli bir avantajı, moleküler düzeydeki değişiklikleri hücresel gelişimin iyi tanımlanmış aşamalarıyla ilişkilendirme olasılığıdır. Ayrıca, sınırlı bütçe veya zaman durumunda yararlı olan belirli gelişim aşamalarının daha odaklı bir örneklemesine izin verir.

Burada, biz onların yaprak büyümesi açısından kuraklık stresi koşullarında (kuraklık,% 34 SWC) tabi sulak bitkiler (kontrol,% 54 toprak su içeriği, (SWC)) ve bitkiler arasındaki bir eşleşme göstermiştir. Tüm bitkiler ° C gündüz / gece, 300-400 μEm -2 sn-1 fotosentetik aktif radyasyon (PAR). Kuraklık 25 ° C / 18, kontrollü şartlar (16 saat gün / 8 saat gece altında bir büyütme odası içinde yetiştirilmiştir doğru SWC ulaştı ve daha sonra devam edildi kadar su stopaj k...

Hücre bölünmesini ve genişlemesini ölçmek, tüm bitki büyümesinin anlaşılması için çok önemlidir. Burada, mısır yaprağı büyüme oranlarını belirleyen hücresel parametreleri hesaplamak için bir protokol sunuyoruz ve bu verilerin, gelişimsel aşamaya özgü örnekleme stratejilerini yönlendirerek moleküler büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için kullanımını vurguluyoruz.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Bu analizin genel amaçları, mısır yaprak büyümesinin hücresel temelini belirlemek ve gelişimsel, evreye özgü örnekleme stratejileri uygulayarak bu verileri moleküler büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için kullanmaktır. Bu yöntem, bitki gelişim biyolojisindeki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Hücre bölünmesi ve hücre genişlemesi, tüm organ büyümesindeki farklılıklara nasıl katkıda bulunur?Bu yaklaşım, tüm bitki organının büyümesinin temelini oluşturan biyokimyasal moleküler ve fizyolojik süreçlerin araştırılmasına ve uzaysal olarak haritalandırılmasına olanak tanır. Bu sistem mısır yaprak büyümesi hakkında bilgi sağlayabilse de, teknik diğer sistemler için de kullanılabilir. Buna diğer ot türleri ve organlar dahildir.Bu yöntemlerin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir. Hasat, örnek bi-blasyon ve ölçüm adımlarının bu gösterim olmadan gerçekleştirilmesi zordur. Prosedürü Katrien Sprangers ve Viktoriya Avramova gerçekleştirecektir.Laboratuvarımdan iki doktora öğrencisi. Tek çeneklilerde yaprak büyümesinin tam kinematik analizini gerçekleştirmek için, her bir işlem ve genotip için bir büyüme odasında, kontrollü koşullar altında en az 15 bitki yetiştirin. İlgilenilen yaprak ortaya çıktığında, yaprak tamamen genişleyene kadar her gün bir cetvel kullanarak yaprağın uzunluğunu, yani topraktan yaprak ucuna kadar olan mesafeyi ölçün.İlgilenilen gelişim aşamasında, meristematik bölgeyi sağlam tutmak için, en az beş temsili bitkinin toprak üstü kısmını köklere mümkün olduğunca yakın bir noktadan kesin. Ardından, dış yapraklardan başlayarak, ilgilenilen yaprağa kadar tüm yaprakları tek tek nazikçe açın. Yaprakları ayırmak için gerektiğinde taban kısmından birkaç ekstra milimetre kesin.Ardından, apeksi ve ilgili yaprak tarafından çevrelenen küçük yaprakları çıkarın ve orta damarın bir yanındaki tabandan başlayarak yapraktan üç santimetrelik bir segment kesin. Yaprağı tam olarak gövdeye bağlandığı noktadan kesmek kritik öneme sahiptir; çünkü çok yukarıdan kesmek, meristem boyutunun olduğundan küçük tahmin edilmesine yol açar.Segmenti, üç iki bir hacimce hacim oranında mutlak etanol asetik asit çözeltisi ile doldurulmuş 1.5 mililitrelik bir test tüpünde, dört derece Celsius'ta 24 saatten birkaç aya kadar saklayın. Venin diğer tarafından, tabandan itibaren 11 santimetrelik bir segment kesin ve pigmentleri uzaklaştırmak için bu segmenti mutlak etanol ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir tüpte, dört derece Celsius'ta en az altı saat saklayın. Dört derece Celsius'ta mutlak etanol içinde geçirilen ikinci bir 24 saatlik sürenin ardından, etanolü saf laktik asit ile değiştirin ve segmenti dört derece Celsius'ta başka bir 24 saat boyunca veya ileri analizlere kadar saklayın.Meristemi ölçmek için, öncelikle üç santimetrelik yaprak segmentini taze hazırlanmış durulama tamponuna 20 dakika boyunca aktarın. İnkübasyonun sonunda, segmenti Dapi boyama çözeltisi bulunan bir kaba aktarın ve buz üzerinde, karanlıkta iki ila beş dakika bekletin. Ardından, dokuyu hızla bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve segmentin üzerini bir lamelle kapatın.UV floresans kullanarak, epidermal hücrelerin floresansını bir mikroskop altında doğrulayın. Ardından, numuneyi yeni bir lam ve yeni bir lameli kullanarak bir damla durulama tamponu içine yerleştirin. 20 kat büyütme kullanarak segmenti mikroskoba geri yerleştirin ve proliferatif mitotik figürleri bulmak için numuneyi tarayın.Gelişmekte olan stemmataların herhangi bir formatif hücre bölünmesini önleyin ve ardından en distal mitotik figürün konumunu belirleyin. Bir görüntü analiz yazılım programı kullanarak görüntü çerçevesinin tam uzunluğunu ölçün. Bu örnekte, 645 micrometer.Ardından, en distal mitotik figürden yaprak tabanına kadar olan tüm meristem uzunluğunu kapsayan kare sayısını sayın ve tüm meristem uzunluğunu elde etmek için bu sayıyı bir karenin uzunluğu ile çarpın. Bir hücre uzunluğu profili elde etmek için, 11 santimetrelik segmenti laktik asitten çıkarıp tezgaha alın ve dokuyu 10 adet bir santimetrelik segmente bölmek için bir skalpel kullanın. Elde edilen yaprak segmentlerini tek bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve küçük bir damla laktik asit ekleyin.Tüm parçalar aynı yüzeyleri yukarı gelecek şekilde yerleştirilir. Ardından, lam diferansiyel kontrast optikleriyle donatılmış bir mikroskobun altına transfer edilir. Yaprak tabanına en yakın segmentten başlayarak, her bir segment boyunca eşit aralıklı konumlarda aynı hücre tipinin tutarlı bir şekilde seçilmesini sağlamak için, stematal sıralara doğrudan komşu olan en az 20 tekrarlı epidermal hücrenin ve sıranın uzunluğunu ölçmek amacıyla uygun bir görüntü analiz yazılım programı kullanılır.Yaprak boyunca her bir ölçüm için karşılık gelen konumu not etmeye özen gösterin. Ardından, ek dosya bir olarak sunulan R script'inde uygulanmış yerel polinom düzeltme işlemi kullanarak yaprak ekseni boyunca her milimetredeki ortalama hücre uzunluğunu belirleyin. Aşırı düzeltme yapmamaya dikkat edin.Yumuşatma işlemi, hücre verilerindeki gürültüyü gidermeli ancak eğrinin genel şeklini etkilememelidir. Burada, iyi sulanmış bitkiler ile kuraklık stresine maruz bırakılmış bitkilerin yaprak büyümesi açısından karşılaştırması gösterilmektedir. Kontrol bitkilerinin nihai yaprak uzunluğu, daha düşük yaprak uzama hızı nedeniyle, kuraklık stresine maruz kalan bitkilerden yüzde 40 daha düşüktü.Kuraklık stresine maruz kalan bitkilerin yaprak uzama hızı, azalan hücre üretimi nedeniyle, iyi sulanan kontrol grubuna göre yüzde 73 daha düşüktür. Bu durum ise temel olarak hücre bölünme hızındaki azalmadan kaynaklanmaktadır. Kinematik analiz, yaprak büyüme bölgesinin lokalizasyonuna dair bir harita sağlayarak, moleküler ve biyokimyasal analizler için alt bölgesel çözünürlükte örnekleme yapılmasına olanak tanır.Örneğin, iyi sulanan kontrol ve kuraklık koşullarına maruz kalan mısır yaprağının büyüme bölgesi boyunca yapılan MDA kantifikasyonu, su kısıtlaması koşullarına yanıt olarak büyüme bölgesi genelinde bu lipid yıkım ürününün anlamlı bir şekilde arttığını göstermektedir. Kuraklığa yanıt olarak yaprağın kısalması nedeniyle, bu deneyde gelişim bölgeleri kontrol ve stresli bitkiler arasında karşılıklı olarak örtüşmemiştir. Ancak, hücre uzunluğu profili kullanılarak gelişim bölgelerinin uzunluğu belirlenebilir ve böylece münferit bölgelerdeki MDA seviyelerinin karşılaştırılması sağlanabilir.Teknik düzgün bir şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra tek bir örnek dört saat içinde işlenebilir. Bu prosedür uygulanırken, toplama sırasında meristemin bütünlüğünün korunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Büyüme düzenlemesindeki rollerini incelemek amacıyla, bu prosedürün ardından moleküler ve biyokimyasal parametrelerin belirlenmesi gibi diğer teknikler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, büyümekte olan mısır yaprağında hücre bölünmesi ve hücre genişlemesi nasıl nicelleştirilir, farklı büyüme bölgelerinin boyutları nasıl belirlenir ve moleküler ve biyokimyasal veriler buna göre nasıl yorumlanır konularında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Laktik asit, asetik asit ve EDTA ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bu prosedürü uygularken eldiven giymek ve mikroskobun her bir evresini kullandıktan sonra temizlemek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Gelişimsel olarak önemli birçok genin hücre veya dokuya özgü ekspresyon paternleri vardır. Bu makale, mısır yaprağı bıçak-kılıf sınırında ve lg1-R mutantlarında vahşi tipe kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için LM RNA-seq deneylerini açıklamaktadır. Burada tartışılan deneysel düşünceler, diğer gelişimsel fenomenlerin transkriptomik analizleri için geçerlidir.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Burada, ateş apikal meristem'deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Mısır yaprağı primordiaları derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz.

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Öğrenin mısır yapraklarında hücre bölünmesi ve genişlemesini nicelendirmeyi, bitki gelişim biyolojisinde büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için. Bu yöntem diğer çim türlerine de uygulanabilir.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying Zea mays Yapraklar (Video) | JoVE Journal

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying

Daha fazla video keşfet