Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Bu görüntüleme sisteminin genel amacı, bitki organlarının gelişimini birkaç gün boyunca hücre altı çözünürlükte gözlemlemek için konfokal floresan mikroskobu kullanmaktır. Bu yöntem, çok hücreli organizmaların hücrelerinin organogenez sırasında büyüme ve çoğalma modellerini nasıl koordine ettiği gibi bitki morfogenezindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurulumunun basit olması ve profüzyon sistemleri gibi zaman atlamalı görüntülemede sıklıkla kullanılan özel ekipmana dayanmamasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, Littlejohn ve Love'ın New Phytologist adlı kitabında, perflorodekalinin yaprak dokularında görüntüleme için avantajlarını anlatan yayınını okuduğumuzda aklımıza geldi. Başlamak için, bir milimetre kalınlığındaki slayttan üç milimetre genişliğinde cam şeritler yapmak için bir cam kesici kullanın. Ardından, siyanoakrilat yapıştırıcı veya çift taraflı bantla, şeritleri yeni bir sürgünün genişliği boyunca yaklaşık 45 milimetre aralıklarla sabitleyin.

Kalıp görevi görmesi için aynı boyutlarda ekstra bir slayt yapın. Şimdi, gaz geçirgen PDMS sakızından aynı yükseklikte bir conta yapın. İkinci bir slaytı biraz mutlak etanol ile ıslatın ve PDMS'yi cam şeritlerin yüksekliğine kadar slayt üzerine düzleştirin.

Ardından, bir bıçağı mutlak etanol ile ıslatın ve fazla PDMS'yi kesin. Etanol ile ıslatılmış aletler PDMS'ye yapışmayacağı için bu çok önemlidir. Ardından, PDMS'yi şeridin yüksekliğine kadar yeniden düzleştirin.

Ardından, PDMS'ye fide ve agar levhasını tutacak bir boşluk açın. Tutarlı bir boşluk boyutu elde etmek için, perspecs'ten yapılmış ısmarlama bir ev yapımı kesici kullanıyoruz, ancak bunun yerine bir tıraş bıçağı kullanılabilir. Ardından, contayı yaklaşık iki milimetre kalınlığında yapmak için dış kenarın etrafını kesin.

Şimdi, PDMS contası olmayan bir sürgünün üzerine, her iki cam şeridin üzerine bir lamel koyun. Ardından, lamel altındaki boşluğa, alanı dolduracak kadar yaklaşık bir mililitre ılık sıvılaştırılmış agar ortamı pipetleyin. Agar, ilgilenilen deneysel bileşikler içerebilir.

Daha sonra, bir tüpte küçük bir hacimde PFD'yi sallayarak hava bir miktar PFD'yi dengeler. Agar sertleştikten sonra, PDMS contasına yaklaşık 200 mikrolitre PFD yükleyin, ancak tamamen doldurmayın. Lameli agar levhasından çıkarın ve PDMS jel contasının kuyusuna uyacak şekilde kesin.

Agar ve conta duvarı arasında iki ila dört milimetre boşluk bırakın. Ardından, hazneyi tamamen hava dengelenmiş PFD ile doldurun. Gravitropik birincil kökleri görüntülemek için, agar levhasının yüzeyinde fiziksel bir bariyer olarak selülozik bir zar kullanılır.

Agar levhası ayrıca %1,5 agar yerine %0,8 agar ile daha yumuşak olmalıdır. Agar bloğu ile yaklaşık olarak aynı boyutlarda olan bir zar parçası kesin. Ardından% 80 etanol ile sterilize edin ve kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, zarı sıvı büyüme ortamına batırın ve ardından agar yüzeyine aktarın. Başlamak için, agarın üzerine dikkatlice en fazla üç fide yerleştirin. Konumları çok önemlidir.

Kotiledonlar ve hipokotil, PFD'de yüzen agar kenarı üzerinde asılı kalmalıdır. Büyümeye izin vermek için fideler arasında boşluk bırakılmalıdır. Fideler, odaya sığamayacak kadar büyükse kıvrılabilir.

Ardından, seçilen hedefe uygun kalınlıkta bir lamel kullanarak hazneyi kapatın. Cam şeritlerle temas kurulması için kenar boyunca hafifçe bastırın. Lameli iki cam şerit üzerinde eşit şekilde duracak şekilde hafifçe bastırmak için başka bir cam sürgü kullanın.

Ardından, uzunlamasına ikiye kesilmiş mikro gözenekli cerrahi bant kullanarak lameli sabitleyin. Şimdi, görüntülemeden önce numunenin yaklaşık yarım saat oturmasına izin verin. Arabidopsis thaliana fidelerini odalara hazırlamak için önce tohumları% 70 etanol ile sterilize edin.

Ve sonra onları takviye edilmiş ortama yerleştirin. Ekilen tohumları iki veya dört gün boyunca dört santigrat derecede tabakalandırın. Ardından, ekilen tohumları 22 santigrat dereceye aktarın ve günlük 16 saatlik bir ışık döngüsü altında dikey olarak yönlendirin.

Yan kökleri görüntülemek için bitkileri yedi ila 10 gün boyunca büyütün ve ardından görüntüleme odalarına aktarın. Görüntüleme odalarında fizyolojik oranlarda büyüyen lateral kökler her yarım saatte bir belgelendi. Yanal kökler, karşılaştırma için aynı ortamda standart petri plakaları üzerinde de büyütüldü.

Bireysel köklerin büyüme hızı her iki kurulumda da çok değişti, ancak aralık her iki koşulda da benzerdi. Genel olarak, büyüme oranı uzunlukla birlikte arttı. Görüntüleme odalarındaki veya plakalardaki bitkilerin büyüme hızı, büyümenin ilk 27 saati boyunca ayırt edilemezdi.

Her iki grup da aynı ortalama yanal kök uzunluğu ile başladı. Plazma membran markörü ve mikro tübül markörü birlikte eksprese eden lateral kökler görüntüleme odalarında birer saat aralıklarla görüntülendi. Kökler pozisyonlarında oldukça stabildi ve birkaç saatlik konfokal görüntülemeye izin verdi.

Deney boyunca proliferasyonun görsel göstergeleri gözlendi. Meristematik hücrelerde, prefaz bantları, mitotik iğler ve phragmoplastların tümü tanımlanabilir. Üç gün boyunca, yanal kök büyümesi, ilk 48 saat boyunca petri plakalarına kıyasla görüntüleme odalarında önemli ölçüde farklı değildi, ancak 72 saat içinde ortalama büyüme oranı düştü.

Bununla birlikte, odalardaki köklerin önemli bir kısmı, 72 saat boyunca plakalardaki köklerle karşılaştırılabilir oranlarda büyüdü. Ustalaştıktan sonra, her şey yolunda giderse 15 dakika içinde iki slayt yapılabilir. Bu görüntüleme sistemini farmakolojik tedavilerin etkisini incelemek için kullanmak mümkündür, ancak yıkama deneyleri için perfüzyon sistemleri gibi daha karmaşık yöntemler gereklidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki morfogenezini destekleyen hücresel olayları takip etmek, özellikle hücre kenarlarının, arabidopsis thaliana'nın yan köklerinde organogenezi paylaşan mekansal taleplerin rolünü araştırmak için ucuz ve basit bir yol sağladı.