Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.

Bu yöntemin genel amacı, karmaşık hücre topluluklarının sıralanmış popülasyonlarının metabolizmasını ölçmek için izotop izlemeyi kullanmaktır. Dolayısıyla bu yöntemle, karmaşık hücre topluluklarının alt popülasyonları arasındaki metabolik farklılıkları ve ayrıca bu alt popülasyonlar arasındaki metabolik işbirliğini inceleyebiliriz. Bu tekniğin ana avantajı, izotop izlemeyi hücre sıralama ile birleştirerek, daha güvenilir bir metabolizma ölçümü elde edebilmemiz ve ayrıca yöntemin ne kadar güvenilir olduğunu doğrulayabilmemizdir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, farklı teknikleri birleştirdiği ve hücrelerin işlenme şekli ve prosedürün uzunluğu hücre metabolizmasını etkileyebileceği için kritiktir. Bir tabaktan metabolit ekstraksiyonu için, önce diyaliz takviyeleri içeren stabil izotop etiketli kültür ortamında altı oyuklu bir plakadaki kültür hücreleri. Hücreler% 75 birleşmeye ulaştığında, kuyucukları eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren 500 mikrolitre soğuk HBSS ile iki kez durulayın.

Daha sonra her bir kuyucuğa 600 mikrolitre% 100 kuru buz önceden soğutulmuş metanol ekleyin ve plakayı kuru buza aktarın. Hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve ardından her bir kuyucuktan ekstraktları dikkatlice ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kütle spektrometresi analizine kadar hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Sıralanmış hücrelerin metabolit ekstraksiyonu için, diyaliz takviyeleri ile etiketlenmiş kültür ortamında 100 milimetrelik bir kapta kültür hücreleri, sıralama gününe kadar% 75 birleşmeye ulaşırlar. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerin darbeli etiketlemesi için, hücreleri% 75 birleşmeye ulaşana kadar diyaliz takviyeleri içeren etiketlenmemiş ortamda kültürleyin. Ardından, ortamı taze etiketli kültür ortamıyla değiştirerek hücreleri iki saat boyunca darbeyle etiketleyin.

Çanağı eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren ılık HBSS ile durulayın ve hücreleri 37 santigrat derecede 1.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Dört dakika sonra, tripsin'i etiketli glikoz ve diyaliz takviyeleri içeren üç mililitre buz gibi soğuk HBSS ile devre dışı bırakın ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Etiketli glikoz, diyaliz takviyeleri ve EDTA içeren HBSS'deki peleti, mililitre konsantrasyonunda bir ila iki kez 10 ila altı hücrede yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten süzün

Hücreleri beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir akış sitometresinde sıralayın. Sahte sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, kalıntıları dışarı çıkarın ve sadece singletleri sıralayın. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, döküntüleri ve çiftleri dışarı çıkarın ve geminin probu floresansına bağlı olarak hücreleri G1 ve SG2M'ye ayırın.

Sıralamanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve homojen bir pelet elde etmek için peleti 50 mikrolitre buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Daha sonra 540 mikrolitre kuru buzla soğutulmuş metanol ekleyerek metabolitleri hızlı bir şekilde çıkarın. Numuneyi LCMS analizine kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Sıralanmış hücrelerden metabolitlerin ekstraksiyonu önceden iyi planlanmalı ve metabolik değişiklikleri en aza indirmek için deneysel çalışmalar mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır. Ekstrakte edilen metabolitlerin analizi için, önce iyi kalitede numune pikleri sergileyen karşılık gelen mevcut standartlara sahip bir dizi metabolit seçin. Ardından, yanlış izotopları dahil etmemeye dikkat ederek tepe noktalarının kalitesini doğrulayın.

İzotop etiketli numuneler için fraksiyonlarımızdan kütle izotopunu, fraksiyonumuzdan gelen her bir kütle izotopunun tepe alanını, fraksiyonlarımızdaki tüm kütle izotoplarının toplam tepe alanlarına bölerek hesaplayın. Ardından, karbon zenginleştirme formülünü kullanarak karbon-13'ün zenginleştirilmesi için etiketli karbon fraksiyonlarını hesaplayın. Son olarak, nitrojen zenginleştirme formülünü kullanarak nitrojen-15'in zenginleştirilmesi için etiketli nitrojen fraksiyonlarını hesaplayın.

Bu temsili deneyde, veri analizinden seçilen 66 metabolit, sahte sıralanmış hücrelerde mevcuttu ve bunların 60'ı, çanak ekstraktları ve sahte sıralanmış hücreler arasındaki dağılımlarımızdan benzer kütle izotopu ile etiketlenmiş gibi görünüyordu. Örneğin, glutamat dağılımımızdan elde edilen kütle izotopu, çanak ve sahte sıralanmış ekstraktlar arasında benzerdir, bu da dağılımımızdaki glutamat kütle izotopunun sıralanmış hücre popülasyonlarında da güvenilir olduğunu gösterir. FUCCI geminin probu kullanılarak G0, G1 veya SG2M hücre döngüsü aşamalarına ayrılan HELA hücrelerinin analizi, her iki popülasyonda da SG2M aşamasında daha yüksek bir zenginleştirme ile sitidin etiketlemesini ortaya çıkarır ve S fazı sırasında nükleotidlerin artan de novo sentezi ile tutarlıdır.

Bu deneyde, dağılımımızdaki kütle izotopu, hücre döngüsü sıralanmış fraksiyonların her ikisinde de aynı modeli sergiledi, bu da aynı sentez yolunun kullanıldığını, ancak SG2M aşamasında daha aktif olduğunu düşündürdü, bu da metabolik farklılıkların bu yöntemle kolayca tespit edilebileceğini gösterdi, yakından ilişkili alt popülasyonlar arasında bile. Bu videoyu izledikten sonra, sıralanmış fraksiyonlardan metabolitlerin nasıl çıkarılacağını iyi bir şekilde kavramalı ve uyarıları anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, hücrelerin işlenme şekli ve süresi metabolizmalarını etkileyebileceğinden, sıralama ve metabolit ekstraksiyonu sırasında hücreleri hızlı bir şekilde ele almayı hatırlamak önemlidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Örneğin, kandaki bağışıklık hücresi alt kümeleri veya bir tümör içindeki farklı hücre türleri, sıralama için çeşitli problar, antikorlar veya boyama yöntemleri kullanarak.