Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem
4 Şubat 2017
Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.
Bu yöntemin genel amacı, karmaşık hücre topluluklarının sıralanmış popülasyonlarının metabolizmasını ölçmek için izotop izlemeyi kullanmaktır. Dolayısıyla bu yöntemle, karmaşık hücre topluluklarının alt popülasyonları arasındaki metabolik farklılıkları ve ayrıca bu alt popülasyonlar arasındaki metabolik işbirliğini inceleyebiliriz. Bu tekniğin ana avantajı, izotop izlemeyi hücre sıralama ile birleştirerek, daha güvenilir bir metabolizma ölçümü elde edebilmemiz ve ayrıca yöntemin ne kadar güvenilir olduğunu doğrulayabilmemizdir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, farklı teknikleri birleştirdiği ve hücrelerin işlenme şekli ve prosedürün uzunluğu hücre metabolizmasını etkileyebileceği için kritiktir. Bir tabaktan metabolit ekstraksiyonu için, önce diyaliz takviyeleri içeren stabil izotop etiketli kültür ortamında altı oyuklu bir plakadaki kültür hücreleri. Hücreler% 75 birleşmeye ulaştığında, kuyucukları eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren 500 mikrolitre soğuk HBSS ile iki kez durulayın.
Daha sonra her bir kuyucuğa 600 mikrolitre% 100 kuru buz önceden soğutulmuş metanol ekleyin ve plakayı kuru buza aktarın. Hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve ardından her bir kuyucuktan ekstraktları dikkatlice ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kütle spektrometresi analizine kadar hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Sıralanmış hücrelerin metabolit ekstraksiyonu için, diyaliz takviyeleri ile etiketlenmiş kültür ortamında 100 milimetrelik bir kapta kültür hücreleri, sıralama gününe kadar% 75 birleşmeye ulaşırlar. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerin darbeli etiketlemesi için, hücreleri% 75 birleşmeye ulaşana kadar diyaliz takviyeleri içeren etiketlenmemiş ortamda kültürleyin. Ardından, ortamı taze etiketli kültür ortamıyla değiştirerek hücreleri iki saat boyunca darbeyle etiketleyin.
Çanağı eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren ılık HBSS ile durulayın ve hücreleri 37 santigrat derecede 1.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Dört dakika sonra, tripsin'i etiketli glikoz ve diyaliz takviyeleri içeren üç mililitre buz gibi soğuk HBSS ile devre dışı bırakın ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Etiketli glikoz, diyaliz takviyeleri ve EDTA içeren HBSS'deki peleti, mililitre konsantrasyonunda bir ila iki kez 10 ila altı hücrede yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten süzün
.Hücreleri beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir akış sitometresinde sıralayın. Sahte sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, kalıntıları dışarı çıkarın ve sadece singletleri sıralayın. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, döküntüleri ve çiftleri dışarı çıkarın ve geminin probu floresansına bağlı olarak hücreleri G1 ve SG2M'ye ayırın.
Sıralamanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve homojen bir pelet elde etmek için peleti 50 mikrolitre buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Daha sonra 540 mikrolitre kuru buzla soğutulmuş metanol ekleyerek metabolitleri hızlı bir şekilde çıkarın. Numuneyi LCMS analizine kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Sıralanmış hücrelerden metabolitlerin ekstraksiyonu önceden iyi planlanmalı ve metabolik değişiklikleri en aza indirmek için deneysel çalışmalar mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır. Ekstrakte edilen metabolitlerin analizi için, önce iyi kalitede numune pikleri sergileyen karşılık gelen mevcut standartlara sahip bir dizi metabolit seçin. Ardından, yanlış izotopları dahil etmemeye dikkat ederek tepe noktalarının kalitesini doğrulayın.
İzotop etiketli numuneler için fraksiyonlarımızdan kütle izotopunu, fraksiyonumuzdan gelen her bir kütle izotopunun tepe alanını, fraksiyonlarımızdaki tüm kütle izotoplarının toplam tepe alanlarına bölerek hesaplayın. Ardından, karbon zenginleştirme formülünü kullanarak karbon-13'ün zenginleştirilmesi için etiketli karbon fraksiyonlarını hesaplayın. Son olarak, nitrojen zenginleştirme formülünü kullanarak nitrojen-15'in zenginleştirilmesi için etiketli nitrojen fraksiyonlarını hesaplayın.
Bu temsili deneyde, veri analizinden seçilen 66 metabolit, sahte sıralanmış hücrelerde mevcuttu ve bunların 60'ı, çanak ekstraktları ve sahte sıralanmış hücreler arasındaki dağılımlarımızdan benzer kütle izotopu ile etiketlenmiş gibi görünüyordu. Örneğin, glutamat dağılımımızdan elde edilen kütle izotopu, çanak ve sahte sıralanmış ekstraktlar arasında benzerdir, bu da dağılımımızdaki glutamat kütle izotopunun sıralanmış hücre popülasyonlarında da güvenilir olduğunu gösterir. FUCCI geminin probu kullanılarak G0, G1 veya SG2M hücre döngüsü aşamalarına ayrılan HELA hücrelerinin analizi, her iki popülasyonda da SG2M aşamasında daha yüksek bir zenginleştirme ile sitidin etiketlemesini ortaya çıkarır ve S fazı sırasında nükleotidlerin artan de novo sentezi ile tutarlıdır.
Bu deneyde, dağılımımızdaki kütle izotopu, hücre döngüsü sıralanmış fraksiyonların her ikisinde de aynı modeli sergiledi, bu da aynı sentez yolunun kullanıldığını, ancak SG2M aşamasında daha aktif olduğunu düşündürdü, bu da metabolik farklılıkların bu yöntemle kolayca tespit edilebileceğini gösterdi, yakından ilişkili alt popülasyonlar arasında bile. Bu videoyu izledikten sonra, sıralanmış fraksiyonlardan metabolitlerin nasıl çıkarılacağını iyi bir şekilde kavramalı ve uyarıları anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, hücrelerin işlenme şekli ve süresi metabolizmalarını etkileyebileceğinden, sıralama ve metabolit ekstraksiyonu sırasında hücreleri hızlı bir şekilde ele almayı hatırlamak önemlidir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Örneğin, kandaki bağışıklık hücresi alt kümeleri veya bir tümör içindeki farklı hücre türleri, sıralama için çeşitli problar, antikorlar veya boyama yöntemleri kullanarak.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, çoklu hücre tiplerinin karmaşık topluluklarındaki hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar. Teknik, metabolik farklılıkları ve alt popülasyonlar arasındaki işbirliğini analiz etmek için stabil izotop izleme, hücre sıralama ve kütle spektrometrisini birleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel metabolizma
- İzotop izleme
- Kütle spektrometrisi
Arka Plan
- Karmaşık hücre topluluklarındaki metabolizmanın anlaşılması çeşitli biyolojik çalışmalar için çok önemlidir.
- İzotop izleme, metabolik yolakların ayrıntılı analizini sağlar.
- Hücre sıralama, daha doğru ölçümler için belirli hücre tiplerinin izole edilmesine yardımcı olur.
- Kütle spektrometrisi, metabolitlerin hassas tespiti sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Karmaşık hücre topluluklarındaki sıralanmış popülasyonların metabolizmasını ölçmek.
- Alt popülasyonlar arasındaki metabolik farklılıkları araştırmak.
- Farklı hücre tipleri arasındaki metabolik işbirliklerini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreleri stabil izotop etiketli ortamda kültürleyin.
- Hücre sıralama tekniklerini kullanarak belirli hücre tiplerini sıralayın.
- Metabolit analizi için kütle spektrometrisi kullanın.
- Görsel gösterimlerle yöntemin güvenilirliğini doğrulayın.
Ana Sonuçlar
- Hücre alt popülasyonlarındaki metabolik farklılıkların daha iyi anlaşılması.
- Farklı hücre tipleri arasında metabolizmadaki işbirliğinin gösterilmesi.
- Birleşik yöntemin güvenilirliğinin doğrulanması.
- Prosedürün ve hücre metabolizması üzerindeki etkisinin görsel bir çerçevesinin sağlanması.
Sonuçlar
- Yöntem, hücresel metabolizmayı incelemek için sağlam bir yaklaşım sunar.
- İzotop izlemeyi hücre sıralama ile birleştirmek, güvenilir metabolik veriler sağlar.
- Bu teknik, karmaşık hücre etkileşimlerini içeren çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
