Name: Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Öğrenin karmaşık hücre topluluklarında alt popülasyonların metabolizmasını ölçme yöntemini. Kararlı izotop izleme ve hücre sıralama ile metabolik farklılıkları ve işbirliklerini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, kütle spektrometresi yöntemlerini optimize etmedeki değerli yardımları için Dr. Anas Kamleh'e ve hücre sıralama konusundaki yardımları için Annika von Vollenhoven'e teşekkür eder. Bu araştırma İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. FFL12-0220) ve Kanser Araştırmaları Stratejik Programı (IR, RN); İsveç Kalp-Akciğer Vakfı (CEW, HG); ve Mary Kay Vakfı (JW, MJ).

1. Metabolit Ekstraksiyon <ol><li> Çanak Ekstraksiyon <ol><li> izotop etiketli kültür ortamı + diyaliz takviyeleri (serum veya diğer büyüme takviyeleri) içinde üç kopya halinde bir 6-yuvalı plaka içindeki kültür hücreleri hücreler% 75 konfluent hale gelene kadar. Not: U- 13 C-Glukoz% 40 ihtiva eden RPMI içinde 48 saat ve% 70 U 13 C, 15, N2-glutamin ve% 5 diyaliz edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu) için Buraya Kültür HeLa hücreleri. Diyaliz FBS etiketlenmiş ortamı kontamine olabilir küçük molekül ağırlıklı metabolitleri kurtulmak için kullanılır. gerçek deneyden önce diyaliz ek hücrelerin kültürlenmesi Hücreler ortam içinde normal olarak büyüme sağlamak için önerilir. Takviyeler, gece boyunca yılan derisinden diyaliz tüpü kullanılarak 0.15 M NaCI çözeltisi içinde diyalize edilmiştir. </li><li> Ekstraksiyon ıskarta kültür medya gününde, 500 uL soğuk HBSS ile iki kez kuyu durulayın ve sonra atın. NOT: Burada HBSS% 40 içeren kullanın U-13 C-Glukoz bu kültür ortamında da olduğu. </li><li> Ekle 600 uL% 100 metanol, kuru buz üzerinde ön soğutulmuştur. </li><li> kuru buz ve bir hücre kazıyıcı ile hücre malzemeyi çıkarmak için çanak aktarın. </li><li> Dikkatle kütle spektrometresi analize kadar -80 ° C &#39;de, bir mikrosantrifüj tüpü ve saklamak için hücre ekstreleri pipetle. </li></ol></li><li> Sahte sıralanmış hücrelerinin alınması <ol><li> izotop etiketli kültür ortamı + diyaliz takviyeleri üç kez 100 mm tabak kültür hücreleri. Not: 100 mm tabak 48 saat süreyle burada kültür, HeLa hücreleri, hücre sayısının (~ 4 x 10 6) 500,000 kriteri hücreleri elde etmek için gereklidir, çünkü. HeLa hücreleri özü Bu sayı metabolitlerinin iyi bir ölçüm elde etmek için gerekli oldu. Kullanılan kültür ortamı RPMI% 40 U 13 C-Glikoz ve% 70 U 13 C, 15, N2-glutamin ve diyaliz FBS,% 5 idi. </li><li> ekstraksiyon, ıskarta kültür ortamı gününde, w kuyu durulayıni 1.5 ml ılık HBSS ve sonra atın. </li><li> 37 ° C&#39;de 4 dakika için 1.5 ml tripsin / EDTA ekleyerek hücreleri ayırın. 4 ° C veya buz aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> 3 mL buz gibi soğuk HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) + diyaliz ek eklenerek tripsin devre dışı bırakır. </li><li> 3 dakika boyunca 750 x g&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj hücreleri toplamak. </li><li> 1-2 x 10 6 hücre / mL, tek hücre elde etmek için 40 mikron hücre süzgeçler geçmesine ve 5 ml tüp transfer konsantrasyonunda HBSS + diyaliz ek + 1 mM EDTA içinde pelletini. </li><li> Sıralama, sadece tekli grubu için bu hücre sıralayıcı gating arasındaki hücreler, 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 750 x g&#39;de santrifüj kriteri hücreleri. NOT: Burada sıralama HeLa enstrüman basıncı 27 psi ile bir oran 1000 olayları / s hücreleri, ve 100 mikron memesi kullanarak. HeLa hücreleri büyük yüzden mümkün olduğunca sağlam pelet almak için yavaş bir olay hızı ve geniş memede tasnif edilmelidir. throughou soğuk blok hücreleri tutunt metabolizmayı azaltmak için sıralama. Sıralama prosedürün ayrıntılı bir açıklama, daha önce 12 tarif edilmiştir. </li><li> Süpernatantı atın ve metanol eklemeden önce homojen bir pelet elde etmek için 50 uL buz dH 2 O pelletini. şirketinden pelet soğuk metanol eklenmesi tekrar süspansiyon zor katı pelet oluşturur. </li><li> kuru buzda muhafaza 540 uL metanol ilave edilerek metabolitleri ekstrakte ve sıvı kromatografisi kadar -80 ° C özler devam - yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (LC-HRMS) analizi. </li></ol></li><li> Hücre döngüsünün Ekstraksiyon hücrelerini kriteri <ol><li> Kültür ortamı + diyaliz takviyeleri üç kez 100 mm tabak kültür hücreleri. NOT: Geminin Fucci Yeşil G1 (negatif) ve SG2M (pozitif) hücrelerin sıralama için izin verir (MAG1-hGem) sondası 13 içeren Burada kültür HeLa hücreleri. Hücreler için izotop izleme ortam içinde kültive edilebilirgerektiği gibi uzun s. Burada etiketsiz medyada 46 saat boyunca onları kültürlü var, o zaman biz RPMI% 40 U- 13 C-Glikoz ve% 70 U 13 C içeren açtınız, 15 N2-Glutamin 2 saat önce sıralama başlangıç. Bu kısa bir darbe etiketleme gerektiren hücre döngüsü evreleri hakkında çalışma yapabilmek amacıyla yapıldı. </li><li> ekstraksiyon, ıskarta kültür ortamı gününde, 1.5 mL sıcak HBSS ile kuyu durulayın ve sonra atın. </li><li> 37 ° C&#39;de 4 dakika için 1.5 ml tripsin / EDTA ekleyerek hücreleri ayırın. 4 ° C veya buz aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> 3 ml buz HBSS + diyaliz takviyesi ekleyerek tripsin devre dışı bırakın. </li><li> 3 dakika boyunca 750 x g&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj hücreleri toplamak. </li><li> 1-2 x 10 6 hücre / mL, tek hücre elde etmek için 40 mikron hücre süzgeçler geçmesine ve 5 ml tüp transfer konsantrasyonunda HBSS + diyaliz ek + 1 mM EDTA içinde pelletini. </li><li> Hücre sıralayıcı g yoluyla sırala hücreleriDaha sonra, enkaz ve çiftleri dışarı ating ilgi hücre markeri için yolluk ve santrifüj sıralanmış hücreler 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 750 xg&#39;de. NOT: Burada sıralama HeLa enstrüman basıncı 27 psi ile bir oran 1000 olayları / s hücreleri, ve 100 mikron memesi kullanarak. metabolizma hızını azaltmak için sıralama boyunca soğuk bloklar hücreleri tutun. </li><li> Süpernatantı atın ve metanol eklemeden önce homojen bir pelet elde etmek için 50 uL buz dH 2 O pelletini. şirketinden pelet soğuk metanol eklenmesi tekrar süspansiyon zor katı pelet oluşturur. </li><li> kuru buzda muhafaza 540 uL metanol ilave edilerek metabolitleri ekstrakte ve LC-HRMS analize kadar -80 ° C &#39;de özler tutun. </li></ol></li></ol> 2. Kütle Spektrometre Analiz Not: Burada bir LC-HRMS sistemde hücre özleri analiz etmek için protokol açıklar. Hücre ekstrelerinin analizi için herhangi bir metabolomiks yöntemleri kullanılabilir. Tam taramaAnaliz metabolitlerin geniş bir tespit edilmesi için yararlı olabilir. <ol><li> Bir kütle spektrometresi referans kalibrasyon karışımı kullanılarak aleti kalibre edin. </li><li> 15 saniye için 30 dakika ve vorteks için buz üzerinde çözülme hücre ekstreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de 13,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile bir eğirme filtresi ve santrifüj hücre ekstresi 100 uL aktarın. </li><li> LC-HRMS sistemi üzerine süzüntü 12.5 mcL enjekte edilir. </li><li> (ZIC®-HILIC) kolonu (150 mm x 4.6 mm, 5 um partikül ebatlı) bir zitteriyonik Hidrofilik interaksiyon sıvı kromatografisi kullanılarak ayrı metabolitler% 0.1 formik bir gradyan elüsyonu kullanılarak ZIC®-HILIC kılavuz sütunun (20 mm ile 2.1 x) ile donatılmış su içinde asit (solvent A) ve asetonitril (çözücü B). Çözücü A% 20 gradyan elüsyonu başlatın ve 17 dakika içinde% 80 kadar arttırır. Sırasıyla, en az 400 uL akışı 1 ve kolon sıcaklığı ve numune tablası 23 ° C&#39;de ve 4 ° C&#39;de 4 dakika boyunca bu oran muhafaza edin. </li><li> Bir i kullanınmetabolitler algılama, iyonizasyon kaynağı olarak pozitif ve negatif mod hem de ısıtılmış bir elektrosprey (lH-ESI II) ve 70.000 tam genişliği yarı maksimum (FWHM) içindeki bir kütlenin güçte tam tarama tedarik etme kipinde kromatografik ayırma bağlanmış Nstrument ( m / z 200). </li><li> akış 45 oranında, 350 ° C&#39;de 10 Au (rasgele birim) ve set buharlaştırıcı sıcaklığında ve pozitif mod ve -3.5 kV 4 kV elektrosprey voltajında ​​kılıf gaz ve yardımcı gaz için azot (saflık&gt;% 99.995) kullanarak negatif modda. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> standartlar mevcuttur ve numunelerde kaliteli zirveleri göstermek hangi metabolitler bir sayı seçin. Kaliteli zirveleri gürültü oranı yüksek sinyal var. Zirve kalite kontrol ve yanlış izotopları dahil değil emin olmak çok önemlidir. şekil ve / veya saklama süresi farklı izotopik tepe muhtemelen yanlış. </li><li> izotop etiketli örnekleri (kütle isotopomer hesaplamak içinMI) Tüm MIS toplam pik alanları ile her MI pik alanı bölerek kesirler. </li><li> Olarak, sırasıyla, 13 ° C ve 15 N, zenginleştirme etiketli karbon / azot fraksiyonları hesaplayın <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> burada, n, metaboliti içindeki toplam karbon sayısı (ya da nitrojen, sırasıyla) &#39;dir, ve karışımı X MI bölümüdür. NOT: Tüm hesaplamalar programlama dilleri kullanılarak yapılabilir. </li></ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
<li>Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://cancerres.aacrjournals.org/content/44/6/2259">Tumor heterogeneity.</a> Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).</li>
<li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+lines+derived+from+breast+cancers+and+normal+mammary+tissues+for+the+study+of+the+intrinsic+molecular+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes.</a> Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).</li>
<li>Magistretti, P. J., Allaman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Perspective+on+Brain+Energy+Metabolism+and+Functional+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging.</a> Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).</li>
<li>Angelini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+dendritic+cells+provide+the+reducing+extracellular+microenvironment+required+for+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).</li>
<li>Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metabolic+pathways+between+cancer+cells+and+stromal+cells+in+colorectal+carcinomas%3A+A+metabolic+survival+role+for+tumor-associated+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma.</a> Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).</li>
<li>Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiles+of+human+immunodeficiency+virus+infected+CD4%2B+T+cells+and+macrophages+using+LC-MS%2FMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis.</a> Virology. 415 (2), 153-159 (2011).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li>
<li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32(2014).</li>
<li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li>
<li>Shapiro, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+H+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , Wiley-Liss. New York. (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Noack, S., Wiechert, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24708998">Quantitative metabolomics: A phantom.</a> Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bizim yöntemi hücresel metabolitleri MID bir hücrenin metabolik faaliyetleri &quot;tarihini&quot; yansıtması ilkesine dayanmaktadır. Bu, daha önceki bir hücre ayırma prosedürü, hücrelerin karmaşık eden oluştu şekilde mümkün hücrelerin alt popülasyonunda metabolik faaliyetlerini araştırmak için yapar. Buna karşılık, metabolitleri pik alanları sıralanmış hücreler ve kültür çanak 11 doğrudan çıkarma özleri arasında belirgin farklılıklar göstermektedir. Bölümünde farklı kimyasal bileşimi, kütle spekt...

Yüksek organizmalar daha karmaşık işlevleri hakkında getirmek için işbirliği farklı hücre tiplerinin karmaşık topluluklar içerir. Örneğin, tümörler de sadece kanserli hücreleri, ancak fibroblastlar, kan damarlarını oluşturan ve genellikle bağışıklık hücresi 1 infiltratlarının hücreleri içerir; Kan bağışıklık hücresi alt tiplerinin 2 onlarca karmaşık bir karışımını içerir; ve hatta kültürlenmiş hücre çizgileri, luminal ve göğüs kanseri hücrelerinin 3 taban alt tipleri gibi birden fazla alt popülasyonlarının, oluşabilirler. Metabolik &quot;işbirliği&quot; sergileyebilir arada Dahası, farklı hücre tipleri. Örneğin, beyinde, astrositler bu alt tabakayı 4 okside nöronlara ardından &quot;beslenen&quot; dir laktat, glikoz dönüştürmek için düşünülen; T lenfositleri sistein 5 kaynağı olarak bitişik dendritik hücreler göre bazı bağlamlarda vardır; ve kanser hücrelerinin Asso ile işbirliği yapabilirtümör 6 kaygılar da fibroblastlar. Bu tür sistemlerin metabolik davranışını anlamak için, ayrı ve mevcut olan çeşitli hücre tipleri metabolik etkinliklerini ölçmek için gereklidir. Bugüne kadar hücre türlerini ayırmak için en yaygın kullanılan yöntem floresan aktive hücre sıralama olduğunu. Bu yöntem, hücre tipi veya ilgi durumu floresan antikorlar, işlenmiş floresan proteinleri ifade ya da diğer boyalar kullanarak &quot;etiketli&quot; koşuluyla, geniş çapta uygulanabilir. Bir seçenek hücre sıralayıcı ile birbirinden bağımsız olarak hücre türleri, yeniden kültür elde edilen ayrı hücre tipleri için, ve daha sonra bu kültürler 7 metabolizması çalışmalar yapmak. Hücre tipi veya fenotip kültür şartlarında stabildir ve hücre döngüsü devletler, ne de ko-kültürlerde metabolik işbirliği gibi geçici davranış yakalama olamaz Ancak, bu sadece uygulanabilir. Bu gibi durumlarda, metabolizma, böylece doğrudan ölçülmelidirrted hücreleri. Bu prosedür sıralama hücre kendi metabolizmasını 8 bozulabilir gerilimlere hücreleri tabi çünkü zorlu ve biz bu yaklaşımı 9, 10 alarak sadece bir kaç çalışmalar farkındayız. Özellikle, mutlak metaboliti bolluğu ölçümleri artık güvenilir böylece amino asitler gibi önemli metabolitleri, hücre sıralama tamponunda tutulan hücrelerden sızabilir bulduk 11 (sıralı fraksiyonları arasındaki göreceli karşılaştırma hala değerli olabilir rağmen). Bu sorunları aşmak için, biz sıralama öncesinde duraylı izotop hücreleri etiket ve hücresel metabolitleri yerine metabolit bolluklarının MID odaklanmak. MID uzun zaman ölçeklerinde üzerinde oluştuğu için, daha az sıralama koşullara kısa süreli maruz kalma etkilenen edilmelidir. Biz DA sağlayacak kadar hassastır tam tarama yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak MID ölçmekhücre sıralama zamanın yaklaşık 30-60 dk gerektiren yaklaşık 500.000 sıralanmış hücrelerden başlayarak metabolitlerin yüzlerce, üzerinde ta. kültür çanak gözlenen MID orijinal kültür bulunanların temsil olmasını sağlamak için yapılır bir arasında bir karşılaştırma doğrudan kontrolü (herhangi bir özel nüfus yolluk olmadan cep sıralayıcı enstrüman geçirilerek hücreleri) ve metabolit çıkarma &quot;mock sınıflandırılmaktadır&quot;. kararlı izotop izleyicilerin seçimi bağlı olarak, çeşitli metabolik yollar bu yöntemle ele alınabilir.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>AKIŞ (inFlux v7 Sıralayıcı)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glikoz</td><td>Cambridge izotopları</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutamin</td><td>Cambridge izotopları</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (JT Baker), HPLC sınıfı</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV santrifüj filtreler. Durapore PVDF 0.1 & mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3.000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap Kütle spektrometresi</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC sütunu (150 mm x 4.6&nbsp; mm, 5 ve mikro; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC koruma kolonu (20 mm x 2,1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril Optima LC-MS, amber cam</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su</td><td>Millipore</td><td></td><td>Mili-Q Gradyan sistemi ile üretilmiştir</td></tr><tr><td>Myrsyra %99,5 Optima (Formik asit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Vidalı Flakon 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 adet</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Ambalaj 8-425 (Vidalı kapaklar)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix Sigma-Aldrich</td><td></td><td>MSCAL5</td><td>Kalibrasyon kiti</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher bilimsel</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Wolfram Araştırma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kararlı İzotop izlemeyi kullanma kompleks hücre toplulukları sıralama alt popülasyonlar metabolizma Ölçme bir yöntem

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Memeli hücre tipleri özelleşmiş metabolizma sergiler ve bir arada var olan çeşitli hücre tiplerinin metabolik işbirliği içinde olduğuna dair bol miktarda kanıt vardır. Ayrıca, tek bir hücre tipinin kültürleri bile, dinlenme veya döngü hücreleri gibi farklı metabolik durumlardaki hücreleri içerebilir. Bu tür alt popülasyonların metabolik aktivitelerini ölçme yöntemleri, hücresel metabolizmayı anlamak için değerli araçlardır. Karmaşık hücre popülasyonları en yaygın olarak bir hücre sıralayıcı kullanılarak ayrılır ve bu yöntemle izole edilen alt popülasyonlar metabolomik yöntemlerle analiz edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili bir sorun, hücre sıralama prosedürünün hücreleri metabolizmalarını bozabilecek streslere maruz bırakmasıdır.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, kararlı izotop etiketli besinlerle kültürlenen hücrelerden alınan metabolitlerin kütle izotopomer dağılımlarının (MID'ler) mutlak metabolit konsantrasyonlarından daha kararlı olma olasılığının yüksek olduğunu düşündük, çünkü MID'ler daha uzun zaman ölçeklerinde oluşur ve hücre sıralama koşullarına kısa süreli maruz kalmaktan daha az etkilenmeleri gerekir. Burada, hücre sınıflandırmayı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (LC-HRMS) ile birleştiren bu prensibe dayalı bir yöntemi açıklıyoruz. Prosedür, üç tip numunenin analiz edilmesini içerir: (1) doğrudan karmaşık popülasyondan elde edilen metabolit ekstraktları; (2) herhangi bir spesifik popülasyonu geçitlemeden hücre sıralayıcı cihazından geçirilen "sahte sıralanmış" hücrelerin özleri; ve (3) gerçek sıralanmış popülasyonların özleri. Sahte sıralanmış hücreler, gerçek sıralanmış popülasyonları analiz etmeden önce, MID'lerin gerçekten hücre sıralama prosedürünün kendisi tarafından değiştirilmediğini doğrulamak için doğrudan ekstraksiyonla karşılaştırılır. Nükleotid metabolizmasındaki değişiklikleri ortaya çıkaran, hücre döngüsü fazına göre sıralanmış HeLa hücrelerinden elde edilen örnek sonuçları gösteriyoruz.

Bir örnek olarak, burada, hücre döngüsü faz göre düzenlenmiş HeLa hücrelerinin metabolizmasını araştıran bir deney tarif eder. Her iki karbon ve nitrojen merkez metabolitlerin geniş bir etiket için, U-13C-glükoz ve U, 13C, izleyiciler olarak 15 N-glutamin ile 48 saat boyunca hücrelerin kültürü yapıldı. Izotopların ara seviyeleri daha değişik MI desen 14 üretmek eğilimindedir doğrulama deney için zengin MID elde etmek için, biz bura...

Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Bu yöntemin genel amacı, karmaşık hücre topluluklarının sıralanmış popülasyonlarının metabolizmasını ölçmek için izotop izlemeyi kullanmaktır. Dolayısıyla bu yöntemle, karmaşık hücre topluluklarının alt popülasyonları arasındaki metabolik farklılıkları ve ayrıca bu alt popülasyonlar arasındaki metabolik işbirliğini inceleyebiliriz. Bu tekniğin ana avantajı, izotop izlemeyi hücre sıralama ile birleştirerek, daha güvenilir bir metabolizma ölçümü elde edebilmemiz ve ayrıca yöntemin ne kadar güvenilir olduğunu doğrulayabilmemizdir.Bu yöntemin görsel gösterimi, farklı teknikleri birleştirdiği ve hücrelerin işlenme şekli ve prosedürün uzunluğu hücre metabolizmasını etkileyebileceği için kritiktir. Bir tabaktan metabolit ekstraksiyonu için, önce diyaliz takviyeleri içeren stabil izotop etiketli kültür ortamında altı oyuklu bir plakadaki kültür hücreleri. Hücreler% 75 birleşmeye ulaştığında, kuyucukları eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren 500 mikrolitre soğuk HBSS ile iki kez durulayın.Daha sonra her bir kuyucuğa 600 mikrolitre% 100 kuru buz önceden soğutulmuş metanol ekleyin ve plakayı kuru buza aktarın. Hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve ardından her bir kuyucuktan ekstraktları dikkatlice ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kütle spektrometresi analizine kadar hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.Sıralanmış hücrelerin metabolit ekstraksiyonu için, diyaliz takviyeleri ile etiketlenmiş kültür ortamında 100 milimetrelik bir kapta kültür hücreleri, sıralama gününe kadar% 75 birleşmeye ulaşırlar. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerin darbeli etiketlemesi için, hücreleri% 75 birleşmeye ulaşana kadar diyaliz takviyeleri içeren etiketlenmemiş ortamda kültürleyin. Ardından, ortamı taze etiketli kültür ortamıyla değiştirerek hücreleri iki saat boyunca darbeyle etiketleyin.Çanağı eşit şekilde etiketlenmiş glikoz içeren ılık HBSS ile durulayın ve hücreleri 37 santigrat derecede 1.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Dört dakika sonra, tripsin'i etiketli glikoz ve diyaliz takviyeleri içeren üç mililitre buz gibi soğuk HBSS ile devre dışı bırakın ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Etiketli glikoz, diyaliz takviyeleri ve EDTA içeren HBSS'deki peleti, mililitre konsantrasyonunda bir ila iki kez 10 ila altı hücrede yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten süzün.Hücreleri beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir akış sitometresinde sıralayın. Sahte sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, kalıntıları dışarı çıkarın ve sadece singletleri sıralayın. Hücre döngüsü sıralanmış hücrelerden metabolit ekstraksiyonu için, döküntüleri ve çiftleri dışarı çıkarın ve geminin probu floresansına bağlı olarak hücreleri G1 ve SG2M'ye ayırın.Sıralamanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve homojen bir pelet elde etmek için peleti 50 mikrolitre buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Daha sonra 540 mikrolitre kuru buzla soğutulmuş metanol ekleyerek metabolitleri hızlı bir şekilde çıkarın. Numuneyi LCMS analizine kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Sıralanmış hücrelerden metabolitlerin ekstraksiyonu önceden iyi planlanmalı ve metabolik değişiklikleri en aza indirmek için deneysel çalışmalar mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır. Ekstrakte edilen metabolitlerin analizi için, önce iyi kalitede numune pikleri sergileyen karşılık gelen mevcut standartlara sahip bir dizi metabolit seçin. Ardından, yanlış izotopları dahil etmemeye dikkat ederek tepe noktalarının kalitesini doğrulayın.İzotop etiketli numuneler için fraksiyonlarımızdan kütle izotopunu, fraksiyonumuzdan gelen her bir kütle izotopunun tepe alanını, fraksiyonlarımızdaki tüm kütle izotoplarının toplam tepe alanlarına bölerek hesaplayın. Ardından, karbon zenginleştirme formülünü kullanarak karbon-13'ün zenginleştirilmesi için etiketli karbon fraksiyonlarını hesaplayın. Son olarak, nitrojen zenginleştirme formülünü kullanarak nitrojen-15'in zenginleştirilmesi için etiketli nitrojen fraksiyonlarını hesaplayın.Bu temsili deneyde, veri analizinden seçilen 66 metabolit, sahte sıralanmış hücrelerde mevcuttu ve bunların 60'ı, çanak ekstraktları ve sahte sıralanmış hücreler arasındaki dağılımlarımızdan benzer kütle izotopu ile etiketlenmiş gibi görünüyordu. Örneğin, glutamat dağılımımızdan elde edilen kütle izotopu, çanak ve sahte sıralanmış ekstraktlar arasında benzerdir, bu da dağılımımızdaki glutamat kütle izotopunun sıralanmış hücre popülasyonlarında da güvenilir olduğunu gösterir. FUCCI geminin probu kullanılarak G0, G1 veya SG2M hücre döngüsü aşamalarına ayrılan HELA hücrelerinin analizi, her iki popülasyonda da SG2M aşamasında daha yüksek bir zenginleştirme ile sitidin etiketlemesini ortaya çıkarır ve S fazı sırasında nükleotidlerin artan de novo sentezi ile tutarlıdır.Bu deneyde, dağılımımızdaki kütle izotopu, hücre döngüsü sıralanmış fraksiyonların her ikisinde de aynı modeli sergiledi, bu da aynı sentez yolunun kullanıldığını, ancak SG2M aşamasında daha aktif olduğunu düşündürdü, bu da metabolik farklılıkların bu yöntemle kolayca tespit edilebileceğini gösterdi, yakından ilişkili alt popülasyonlar arasında bile. Bu videoyu izledikten sonra, sıralanmış fraksiyonlardan metabolitlerin nasıl çıkarılacağını iyi bir şekilde kavramalı ve uyarıları anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, hücrelerin işlenme şekli ve süresi metabolizmalarını etkileyebileceğinden, sıralama ve metabolit ekstraksiyonu sırasında hücreleri hızlı bir şekilde ele almayı hatırlamak önemlidir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Örneğin, kandaki bağışıklık hücresi alt kümeleri veya bir tümör içindeki farklı hücre türleri, sıralama için çeşitli problar, antikorlar veya boyama yöntemleri kullanarak.

a-method-for-measuring-metabolism-sorted-subpopulations-complex-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Spodoptera littoralis gut ile ilişkili aktif bakteriyel topluluk, piro sıralamadır bağlanmış kararlı-izotop-tarama (SIP) ile belirlenmiştir. Bu yöntemi kullanarak, toplum içinde aktif metabolik bakteri türlerinin belirlenmesi, yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile yapıldı.

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing<sup&gt; 13</sup&gt; C = Glukoz

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Yani, yağ asitleri asimilasyon tüm molekül ve transfer tüketici doku içine yağ asidi trofik marker yaklaşım değişiklik, engel olmayan ya da küçük küçük toprak omurgasızlar yağ asidi metabolizması bilgi boşlukları tarafından. Isotopologue profil oluşturma trofik etkileşimleri disentangle için değerli bir araç olarak sağlanır.

Yağ asidi 13C profil oluşturma Isotopologue trofik karbon Transfer ve Lipid metabolizması, omurgasız tüketicilerin sağlar

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Öğrenin karmaşık hücre topluluklarında alt popülasyonların metabolizmasını ölçme yöntemini. Kararlı izotop izleme ve hücre sıralama ile metabolik farklılıkları ve işbirliklerini analiz edin.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet