Name: Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Öğrenin zebra balığı embriyolarını uzun süreli canlı görüntüleme için monte etme yöntemini. Bu teknik, arka vücut bölgesinin normal gelişimini korurken hücresel davranışları gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estelle Hirsinger: Institut Pasteur ve Agence Nationale de la Recherche'den (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS) temel finansman. Estelle Hirsinger, Centre National de la Recherche Scientifique'den (CNRS) bir akademisyendir. Benjamin Steventon, Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), ardından bir Roux bursu (Institut Pasteur) ve ardından bir AFM-Téléthon bursu (sayı 16829) tarafından finanse edildi. Şu anda bir Wellcome Trust / Royal Society Sir Henry Dale Bursu tarafından destekleniyor.

1. Çözelti Hazırlanması ve çekti Cam İğne <ol><li> 20 mM Tris pH 8.8 içinde 4 mg / mL Tricaine (3-amino-benzoik asit etil ester, aynı zamanda adı etil 3-aminobenzoat) içindeki bir 25x stok çözeltisi yapmak ve bu çözelti, pH 4 mL mağaza tarafından 7. kısım en getirmek -20 ° C. NOT: anestetik Tricaine böylece kas seğirmesi ve hareketi 6 engelleme nöral voltaj bağımlı sodyum kanalları tercihen hareket eder. </li><li> E3 embriyo ortam içinde 0.17 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda Tricaine bir çalışma çözeltisi yapın. 7 NOT: Bu çözeltinin pH değeri sürüklenir olarak hazırlıksız bir şekilde çalışma çözeltisi Tricaine sağlayın. </li><li> Bir mikrodalga fırında çözelti ısıtılarak 50 ml bir tüp içinde E3 embriyo ortamı içinde% 1.5 bir son konsantrasyona kadar düşük erime noktası agaroz eritilir. bir su banyosu ya da tezgah üstü inkübatör ya 45 ° C - bu çözüm 42 muvazene edelim. Dikey için büyük yemekleri hazırlarken eğerIşık sayfalık görüntüleme (adım 4), agaroz E3 embriyo orta% 1 standart erime ek 25 ml yapmak. </li><li> OD 1.20 mm, ID 0.69 mm, uzunluğu 10 mm boyutları ile filaman kılcal damarlar ile borosilikat camını kullanın. </li><li> Keskin forseps bir çift ile Velocity 50, Zaman 225, Basınç 500. 120 çekin, Isı 600, break: kılcal damar Ekipman ve Kimyasalları, aşağıdaki ayarları kullanın Tablo açıklanan ısıtma filament iğne çektirmesi türüne çekilirse sadece noktadan iğne hangi o embriyolar yönlendirici ve aşırı agaroz kaldırmak için temiz ve keskin iğne oluşturmak için esner. Bir mikro-neşter ayrıca aşırı agaroz kaldırmak için kullanılabilir. </li></ol> Ters çevrilmiş veya Dikey Mikroskopi için Embriyolar 2. gömülmesi <ol><li> E3 embriyo orta uygun aşamaya embriyolar yükseltmek. 7 </li><li> binoküler dissec altında keskin forseps bir çift ile gerekli aşamada, dechorionate embriyolarting mikroskop. </li><li> Tricaine çözelti içinde en az 5 dakika boyunca dechorionated embriyolar inkübe edin. </li><li> erimiş agaroz çözelti, 45 ° C&#39;ye soğuduktan sonra, E3 orta minimum transfer 50 ml tüp içine doğrudan dechorionated embriyo transferi için bir cam Pasteur pipet kullanın. </li><li> orta montaj yaklaşık 1 ml ile embriyo çıkarın ve yak. 10 mm kuyucuklarda ile 35 mm cam tabanlı petri merkezi daire embriyo ile birlikte montaj orta 100 ul. </li><li> Montaj orta ayar gibi, dışa doğru (Şekil 1A) bakan kuyruğu ile agaroz çemberin kenarına embriyo taşıyın. Jel tamamen ayarlanana kadar istenilen yanal yönde embriyo korumak için kılcal iğne kullanın. görüntü arka gövde gelişimine, mümkün olduğunca yan bir yönde embriyo yönlendirmek için özen gösterin. Bu nedenle, dikkat Farkları bu pozisyonda embriyo muhafazaKılcal iğne ile ts. Not: gerekirse birden çok embriyo, bu noktada monte kaba ilave edilebilir. Bu durumda, ilk çanak içine agaroz düşük eritebilir aktarmak ve agaroz damla merkezine embriyolar ekleyin. Ardından, cam yüzük kenarlarına embriyoların dışarı itmek ve istenilen pozisyona yolunuzu. Altı embriyolar kadar Agaroz katılaşmış olur önce bu şekilde monte edilebilir. </li></ol> Arka Gövde Çevresi Fazla Agaroz 3. Kaldırma NOT: Bu kısım agaroz arka gövde çevresindeki bölge uzaklaştırılır prosedür açıklanmaktadır. Posterior vücut uzama durumunda, kuyruk büyümek-out normalde sağlamak için önemlidir. Embriyo tamamen agaroz ile dahil edildikten sonra agaroz kaldırarak, embriyo baş bölgesi ve yumurta sarısının yaklaşık yarısı tarafından kapalı bırakılır. <ol><li> Agaroz açılan donduktan sonra, petri di selTricaine çözelti ile sh. </li><li> iletilen ışık tabanı ile diseksiyon binoküler mikroskop altında, güçlü bir kontrast çalışması yoluyla açıkça görülebilir agaroz kesimler için izin veren şekilde ayna konumunu ve gelen ışığın açısını ayarlamak. </li><li> Kesme gerçekleştirmek için 1 (Şekil 1), sadece hücre gruplarının 5 (5. pozisyonuna oluşturucu kalp alanına posterior pozisyonda sarısı üzerinde agaroz orta yol kesmek için Kılcal iğne veya mikro-neşter kullanmak ön somite). </li><li> gösterildiği gibi şekillendirme kalbe komşu ilk kesim ve cama agaroz üzerinden tam bir şekilde başlayın. </li><li> Yukarı gördüm ve Şekil 1 gösterildiği gibi embriyo üzerinde uzun bir kesim yapmak için başlayan ederken aşağı yavaşça derin agaroz içinde kılcal veya mikro-neşter tutmak ve. embriyo ya da yumurta sarısı delmeden mümkün olduğunca embriyo yakın kesti. </li><li> Daha sonra, hale kesikler 2 ve 3 (Şekil 1 </strong&gt;), Embriyo karşı konumundan ve cam tüm yol aşağı gidiş kesim ile başlayan dipli çanak. ilk 5 Somitlerin teğet olacak şekilde arka gövdesinin tamamen ortaya dorsalward için izin, 2 kesim yapın. sarısı yüzeyi ile 90 ° açıyla 3 kesilir ve Heartfield&#39;le başlayarak olun. Not: tam blok (adım 3.6) halinde agaroz giderilmesinde yardımcı (Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi), cam dairenin kenarında kadar agaroz kesilmesi. Ancak, bu gerekli değildir. </li><li> kesikler 1 ve 3 kesiştiği noktada başlayarak, yavaş yavaş arka gövdesini çevreleyen agaroz kare çıkarmak için yukarı doğru kaldırarak ederken kesim 2 sonuna doğru yavaş bir çapraz kesim yapmak. Notlar: Bazı durumlarda, bu tek bir blok çıkacak ve işlem bir hareket içinde tamamlanır. Diğerlerinde, bu dis-lodge embriyoyu çevreleyen tüm agaroz birkaç deneme alabilir. </li><li> Keskin forseps bir çift ile, yerinden b kaldırmakEmbriyo ortamından agaroz kilitler. Bu süreçte yardımcı yemeğin yanına agaroz parçaları taşımak ve agaroz parçaları kaldırarak ederken destek olarak petri duvarını kullanmak için. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Şekil 1: Montaj Set-up Diyagramları. (A) Diyagram, bir petri çanağı içinde merkezi bir cam halka içinde monte edilen embriyo konumunu göstermektedir. Sağ tarafta agaroz dottted kırmızı çizgilerle gösterilen çevreleyen yoluyla birbirini izleyen kesim ile embriyo bir zoom. (B) monte embriyolar hem ters ve dik hedefleri için erişim kolaylığı göstererek yan görünümde diagrammed olduğunu. (C) embriyolar dikey ışık levha görüntüleme set-up için monte edilebilir gösteren benzer bir digram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">cl Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya ick. <ol start="9"><li> kas seğirmesi tam bu noktada bloke değilse, 4 mg / ml, pH 7 stok çözeltisinden Tricaine damla ekleyin. </li></ol> 4. Dikey Işık sayfalık Mikroskopi için Embriyolar montajı NOT: Bu yukarıda özetlenen yönteme bir varyasyon dikey odaklı SPIM tarafından örneklerin görüntüleme için birden hedeflerin erişim sağlar olduğunu. Bu varyasyon arkasındaki fikir, iki görüntüleme hedeflerinin kolay erişim sağlamak için, çanak alt biraz daha yüksek örnek asansör etmektir. <ol><li> montaj örneği önce, kaplama 5 mm bir yüksekliğe E3 ortam içinde% 1 agaroz ile 100 mm&#39;lik bir plastik Petri tabağı ve set sağlar. </li><li> çanağın merkezine 1 mi, düşük erime noktasına sahip agaroz bir damla yerleştirin ve ayarlamak için olanak sağlar. </li><li> Ancak bölüm 2&#39;de gibi düşük erime noktalı agaroz yerleştirme embriyolar, bu kez 50 ml tüp embriyo kaldırmakagaroz çözeltisi (0.5 mi) daha küçük bir damla ve çanağın ortasında açılan ml 1 üstünde, bu küçük bir damla yerleştirin. </li><li> küçük bir damla merkezinde embriyo yerleştirin ve jel set kadar onun doğru yönünü korumak için kılcal iğne kullanın. </li><li> Tricaine çalışma solüsyonu ile çanak sel ve 3. bölümde olduğu gibi ancak% 1 standart agaroz yastık yoluyla kesmeden aşırı agaroz çıkarın. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).</li>
<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu montaj tekniği embriyoların mikroskop ve çoklu uzunluk ölçeklerinde arka gövde uzama aşağıdaki amaçlayan üzerinde uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme deneyleri transferi sırasında hareketsiz tutulması sağlar. her iki dik olarak ters çevrilmiş mikroskop set up üzerinde görüntüleme sağlar ve bir öneri, bu daha dikey yönlendirilmiş SPIM uyarlanabilir nasıl yapılması ile Ayrıca, çok yönlüdür. Bu protokol kritik bir adım, bu yapının normal gelişimini sağlayan önemli olan arka gövdesini çevr...

Arka gövde uzama embriyo vücut eksenine büyük bir kısmını oluşturmak üzere uzandığı tarafından embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu, birden fazla hücre davranışları Bireysel dokular düzeyinde morfonogenezi oluşturmak için koordineli hareket hangi kompleks morfogenetik işlemin örneğidir. Bu diferansiyel doku deformasyonları sonra bütün yapı düzeyinde posterior vücudun uzamasını oluşturmak için birlikte hareket. Bu süreçler kontrollü ve gelişme sırasında koordine nasıl anlamak için, (moleküller, hücreler, hücre popülasyonlarının ve dokuların düzeyinde yani), birden ölçeklerde bu süreçleri takip etmek gerekir ve tüm yapının morfonogenezi doğrudan ilişkilendirmek için . optik şeffaflık ve küçük boyutlu minimal invaziv ışık görüntüleme uygulaması için izin verdiği Zebra balığı embriyolar liv için uygundur yaklaşımlar görüntüleme arka gövde uzaması için idealdire görüntüleme. 1 Bu moleküllerin seviyesinde arka gövde gelişimi üzerine ışık tutmuştur son yayınların bir dizi kanıtlanmıştır, 2 adet tek kişilik hücreler, 4 yanı sıra hücre popülasyonu ve tüm organ seviyesinde 3 ve inter-doku davranışları. 5 Böyle konfokal, çoklu foton mikroskopi ve seçici düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) gibi gelişmiş görüntüleme teknikleri hafif toksisite ve fotoğraf ağartma etkisini azalan gelişim süreçleri uzun vadeli görüntüleme sağlayan vardır. Canlı örneklerin montajı için sağlam teknikler üç hedeflere ulaşmak için gerekli olan: 1) Yeterli destek mikroskop ve satın alma sırasında nakil sırasında doğru yönde örnekleri korumak için, 2) numune hareketinin yeterli özgürlüğü büyümesi için izin vermek için normal devel etkilemeden arka vücut bölgesiopment ve nihayet 3) montaj yönteminin çok yönlülüğü içinde belirli bir dereceye kadar farklı görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin vermek. Bu protokol zebrabalıkları D. rerio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği tanıttı. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi terk ederken baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen, agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Bu şekilde, aynı zamanda, agaroz, standart ışık görüntüleme teknikleriyle sokulmuşlardır gelişmekte vücudun diğer bölgelerinde uzun süreli görüntüleme için uygun bir yöntemdir. değiştirici yönlerde embriyolar monte edilmesi de mümkündür, ancak bu protokol, bir yanal yönde embriyoların monte gösterir. Ayrıca, dik ters ve dikey ışık sayfalık mikroskobu kurulumları yöntemi uyarlamak nasıl gösterecektir.

<table><tbody><tr><td><GÜÇLÜ>SARF MALZEMELER</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı tabaklar</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri kabı, 10 mm mikro kuyu. No. 1.5 kapak camı</td></tr><tr><td>Enjeksiyon iğneleri için kılcal damarlar</td><td>&nbsp; Sutter&nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>Filamentli, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, uzunluk 10 cm olan orosilikat cam kullanıyoruz. Bununla birlikte, filament iğneleri gerekli değildir ve çoğu enjeksiyon standart iğnesi işe yaramalıdır.</td></tr><tr><td>Mikro neşter</td><td>Tüy</td><td>P-715</td><td>Plastik saplı Mikro Tüy tek kullanımlık oftalmik neşter</td></tr><tr><td>Pastör Pipetleri</td><td></td><td></td><td>230 mm</td></tr> <tr><td>uzunluğunda<güçlü>REAKTİFler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İnce forseps ve nbsp;</td><td>GÜZEL BİLİM ARAÇLARI GMBH&nbsp;</td><td>11252-30&nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>İğne çektirmesi ve nbsp;</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P97</td><td>Isıtma filament iğne çektirme</td></tr><tr><td>Binoküler diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı kalkınma uzun süreli görüntüleme için a yönlü montaj yöntemi

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı embriyolar nedeniyle erişilebilirlik ve optik şeffaflık kolaylığı karmaşık morfogenetik süreçleri incelemek için ideal bir deneysel sistem sunuyoruz. Özellikle, arka gövde uzama çoklu doku deformasyonları vücut ekseninin büyük bir kısmı oluşumunu yönlendirmek için birlikte hareket hangi embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Uzun vadeli time-lapse görüntüleme ile bu süreci gözlemlemek için yeterli destek mikroskop ve iktisap transferi sırasında doğru yönde örnekleri korumak için izin veren bir montaj tekniği kullanmak gerekir. Buna ek olarak, montaj aynı zamanda normal gelişimini etkilemeden arka gövde bölgenin büyümesi için yeterli hareket özgürlüğü sağlamak zorundadır. Son olarak, çeşitli görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin montaj yönteminin çok yönlülüğü de belirli bir ölçüde olması gerekir. Burada, arka gövde elongatio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği sunmakn Zebra balığı D. rerio içinde. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi dışarı çıkarken, baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Biz bu dik, ters ve dikey ışık sayfalık mikroskopisi set-up için adapte edilebilir gösterecektir. Bu protokol posterior vücut için görüntüleme için embriyolar montaj odaklanırken, kolayca zebrabalıkları gelişmenin birden yönlerini canlı görüntüleme için adapte edilebilir.

Yukarıda özetlenen protokol uzun vadeli time lapse görüntüleme için zebra balığı embriyolarının montajı için çok yönlü bir teknik ayrıntıları. Bunun bir örneği, Şekil 2A ve / görüntü, Şekil 1 &#39;animasyon gösterilir. Embriyolar mRNA photoconvertible floresan protein kikumeGR kodlayan 1 hücre aşamasında enjekte edilmiştir. 10X objektif bir ters konfokal mikroskop, yukarıda tarif edilen ve 12 saat boyunca görüntülenmiş olarak 15 hücre gruplarının aşaması...

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Bu yöntemin genel amacı, Zebrafish embriyolarını, posterior vücut bölgesinin normal gelişimine olanak tanıyacak şekilde canlı görüntüleme için monte etmektir. Bu yöntem, gelişmekte olan Zebrafish'in diğer bölgelerinin görüntülenmesi için de uyarlanabilir. Bu teknik, bireysel hücre davranışlarının tüm doku seviyesinde morfolojiyi nasıl yönlendirdiği gibi Gelişimsel Biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur.Bu tekniğin temel avantajı, embriyoyu doğru oryantasyonda tutarken posterior gövdenin serbestçe hareket etmesini sağlamasıdır. Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüp içindeki E3 medyumuna final konsantrasyonu 1,5% olacak şekilde düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve agarozu mikrodalgada ısıtarak çözün. Çözeltinin bir su banyosunda veya tezgah üstü inkübatörde 42 ila 45 degrees celsius sıcaklığa ulaşmasını bekleyin.Metin protokolüne göre cam iğneler çekildikten sonra, embriyoları yönlendirmek ve fazla agarozu temizlemek için temiz ve keskin bir iğne oluşturmak amacıyla, iğneyi esnediği noktanın hemen üzerinden bir pens yardımıyla kırın. Embriyoları E3 ortamında uygun aşamaya gelene kadar büyütün.Ardından binoküler bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoların koryonlarını temizlemek için bir çift keskin pens kullanın. Koryonu temizlenmiş embriyoları en az beş dakika boyunca trikain çalışma çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra, koryonu temizlenmiş embriyoyu minimum miktarda E3 ile birlikte cam bir Pasteur pipeti kullanarak doğrudan 45 °C'deki 50 mililitrelik agaroz tüpüne aktarın.Embriyoyu yaklaşık bir mililitre montaj agarozu ile birlikte çıkarın ve embriyoyu içeren ortamdan yaklaşık 100 mikrolitreyi, 35 milimetrelik cam tabanlı bir Petri kabının tabanındaki 10 milimetrelik bir mikrokuyucuğun merkezine aktarın. Montaj ortamı donarken, embriyoyu kuyruğu dışarıya bakacak şekilde agaroz dairesinin kenarına doğru hareket ettirin. Posterior vücut gelişimini görüntülemek için embriyoyu kılcal iğne kullanarak mümkün olduğunca lateral olarak konumlandırın.Ardından kapilerle, jel tamamen donana kadar embriyoyu istenilen yan yönelimde tutun. Agaroz damlası donduktan sonra, Petri kabını doldurmak için trikayn çalışma çözeltisini kullanın. Daha sonra, transmisyon ışıklı tabana sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, agarozdaki kesilerin net bir şekilde görülmesini sağlayacak güçlü bir kontrast oluşturmak için ayna konumunu ve gelen ışığın açısını ayarlayın.Birinci kesiyi gerçekleştirmek için, kılcal iğne veya mikro-skalpel kullanarak agarozu, sarının bitişiğinden ve orta hattı boyunca, kalp alanlarının oluştuğu bölgenin hemen arkasından beşinci anterior somit boyunca, cam tabana kadar tamamen testere hareketiyle kesin. Burada kritik olan, vitellus kesesi üzerindeki agaroz kesilirken embriyonun zarar görmediğinden emin olmaktır. Ardından, posterior gövdenin dorsal yönde açılmasına izin verecek şekilde, ilk beş somite teğet geçerek, embriyonun karşıdan cam tabana kadar uzanan ikinci ve üçüncü kesileri yapın.Ardından, birinci ve üçüncü kesimlerin kesiştiği noktadan başlayarak, posterior gövdeyi çevreleyen agaroz karesini yerinden çıkarmak için yavaşça yukarı doğru kaldırırken üçüncü kesimin sonuna doğru yavaş bir diyagonal kesik atın. Kesik agaroz parçalarını kaldırırken Petri kabının duvarını destek olarak kullanarak, yerinden ayrılan agaroz bloklarını embriyo ortamından keskin bir pensetle çıkarın. Numune montajı öncesinde, 100 milimetrelik plastik bir kabı beş milimetre yüksekliğe kadar kaplamak için E3 içinde %1 agaroz kullanın ve donmaya bırakın.Ardından, kabın merkezine bir mililitre düşük erime noktalı agarozdan bir damla yerleştirin ve onun da donmasını bekleyin. Embriyoları, bu videonun daha önceki kısımlarında gösterildiği gibi düşük erime noktalı agaroza gömün. Ancak bu kez, embriyoyu 50 mililitrelik agaroz tüpünden daha küçük bir çözelti damlasıyla alın ve bu küçük damlayı kabın merkezindeki bir mililitrelik damlanın üzerine yerleştirin.Embriyoyu küçük damlanın merkezine konumlandırmak ve jel donana kadar doğru yönelimini korumak için kılcal iğneyi kullanın. Son olarak, kabı doldurmak ve fazla agarozu uzaklaştırmak için trikain çalışma çözeltisi kullanın. Fotokonvertibl floresan protein kikumeGR'yi kodlayan mRNA enjekte edilmiş, ardından 15 somit aşamasında monte edilmiş ve 12 saat boyunca zaman atlamalı görüntülemeye tabi tutulmuş bir Zebrafish embriyosu örneği bu animasyonlu videoda gösterilmektedir.Arka gövdenin serbestçe hareket etmesine izin verilmiştir ve bu durum, normal kültür koşullarında korionlarından bağımsız olarak gelişmesine izin verilen embriyolarda görülen morfolojik değişikliklerle benzerlik göstermektedir. Bu videoda, embriyoların 16 hücreli evresinde, çekirdekleri işaretleyen histon 2BRFP ve hücre membranlarını işaretleyen CAAXGFP kodlayan mRNA ile enjeksiyon yapılmıştır. Kuyruk tomurcuğu oluşumu sırasındaki hücre davranışlarını görüntülemek amacıyla, 10 somit evresinden itibaren üç saat boyunca, 25X su daldırma objektifli dik konumlu bir multifoton mikroskobu ile görüntüler alınmıştır.Kuyruk tomurcuğu normal şekilde oluşurken, hücrelerin aktif çıkıntılar oluşturduğu ve yönlü hareket ettiği görülebilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yapıldığında 20 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, agaroz jel donarken embriyonun lateral pozisyonda olduğundan emin olmak önemlidir.Aksi takdirde, görüntüleme sırasında ilgi bölgesi görüş alanının dışına hızla çıkacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, posterior vücut uzamasının canlı görüntülemesi için Zebrafish embriyolarının nasıl monte edileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Bu makalede, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmenin bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve Ters Mikroskopta görüntüleme için normal cam tabanlı mikroskopi kapları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır. Montaj, farklı konsantrasyonlarda agaroz katmanları halinde gerçekleştirilir.

Katmanlı Agar Montajı: Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Ters Mikroskop ile Uzun Süreli Görüntüleme İçin Hazırlanması

Bu videoda, canlı zebra balığı embriyolarının düşük eriyik agaroz kullanılarak 6 oyuklu plakaya monte edilmesine ilişkin adım adım talimatlar açıklanmaktadır. Ayrıca canlı embriyoların görüntülerini elde etme ve yazılım kullanarak analiz etme sürecini de sağlar.

Agar Montajı: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etmenin Temel Bir Yöntemi

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin zebra balığı embriyolarını uzun süreli canlı görüntüleme için monte etme yöntemini. Bu teknik, arka vücut bölgesinin normal gelişimini korurken hücresel davranışları gözlemlemeyi sağlar.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Daha fazla video keşfet