Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Bu yöntemin genel amacı, Zebrafish embriyolarını, posterior vücut bölgesinin normal gelişimine olanak tanıyacak şekilde canlı görüntüleme için monte etmektir. Bu yöntem, gelişmekte olan Zebrafish'in diğer bölgelerinin görüntülenmesi için de uyarlanabilir. Bu teknik, bireysel hücre davranışlarının tüm doku seviyesinde morfolojiyi nasıl yönlendirdiği gibi Gelişimsel Biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur.

Bu tekniğin temel avantajı, embriyoyu doğru oryantasyonda tutarken posterior gövdenin serbestçe hareket etmesini sağlamasıdır. Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüp içindeki E3 medyumuna final konsantrasyonu 1,5% olacak şekilde düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve agarozu mikrodalgada ısıtarak çözün. Çözeltinin bir su banyosunda veya tezgah üstü inkübatörde 42 ila 45 degrees celsius sıcaklığa ulaşmasını bekleyin.

Metin protokolüne göre cam iğneler çekildikten sonra, embriyoları yönlendirmek ve fazla agarozu temizlemek için temiz ve keskin bir iğne oluşturmak amacıyla, iğneyi esnediği noktanın hemen üzerinden bir pens yardımıyla kırın. Embriyoları E3 ortamında uygun aşamaya gelene kadar büyütün.

Ardından binoküler bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoların koryonlarını temizlemek için bir çift keskin pens kullanın. Koryonu temizlenmiş embriyoları en az beş dakika boyunca trikain çalışma çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra, koryonu temizlenmiş embriyoyu minimum miktarda E3 ile birlikte cam bir Pasteur pipeti kullanarak doğrudan 45 °C'deki 50 mililitrelik agaroz tüpüne aktarın.

Embriyoyu yaklaşık bir mililitre montaj agarozu ile birlikte çıkarın ve embriyoyu içeren ortamdan yaklaşık 100 mikrolitreyi, 35 milimetrelik cam tabanlı bir Petri kabının tabanındaki 10 milimetrelik bir mikrokuyucuğun merkezine aktarın. Montaj ortamı donarken, embriyoyu kuyruğu dışarıya bakacak şekilde agaroz dairesinin kenarına doğru hareket ettirin. Posterior vücut gelişimini görüntülemek için embriyoyu kılcal iğne kullanarak mümkün olduğunca lateral olarak konumlandırın.

Ardından kapilerle, jel tamamen donana kadar embriyoyu istenilen yan yönelimde tutun. Agaroz damlası donduktan sonra, Petri kabını doldurmak için trikayn çalışma çözeltisini kullanın. Daha sonra, transmisyon ışıklı tabana sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, agarozdaki kesilerin net bir şekilde görülmesini sağlayacak güçlü bir kontrast oluşturmak için ayna konumunu ve gelen ışığın açısını ayarlayın.

Birinci kesiyi gerçekleştirmek için, kılcal iğne veya mikro-skalpel kullanarak agarozu, sarının bitişiğinden ve orta hattı boyunca, kalp alanlarının oluştuğu bölgenin hemen arkasından beşinci anterior somit boyunca, cam tabana kadar tamamen testere hareketiyle kesin. Burada kritik olan, vitellus kesesi üzerindeki agaroz kesilirken embriyonun zarar görmediğinden emin olmaktır. Ardından, posterior gövdenin dorsal yönde açılmasına izin verecek şekilde, ilk beş somite teğet geçerek, embriyonun karşıdan cam tabana kadar uzanan ikinci ve üçüncü kesileri yapın.

Ardından, birinci ve üçüncü kesimlerin kesiştiği noktadan başlayarak, posterior gövdeyi çevreleyen agaroz karesini yerinden çıkarmak için yavaşça yukarı doğru kaldırırken üçüncü kesimin sonuna doğru yavaş bir diyagonal kesik atın. Kesik agaroz parçalarını kaldırırken Petri kabının duvarını destek olarak kullanarak, yerinden ayrılan agaroz bloklarını embriyo ortamından keskin bir pensetle çıkarın. Numune montajı öncesinde, 100 milimetrelik plastik bir kabı beş milimetre yüksekliğe kadar kaplamak için E3 içinde %1 agaroz kullanın ve donmaya bırakın.

Ardından, kabın merkezine bir mililitre düşük erime noktalı agarozdan bir damla yerleştirin ve onun da donmasını bekleyin. Embriyoları, bu videonun daha önceki kısımlarında gösterildiği gibi düşük erime noktalı agaroza gömün. Ancak bu kez, embriyoyu 50 mililitrelik agaroz tüpünden daha küçük bir çözelti damlasıyla alın ve bu küçük damlayı kabın merkezindeki bir mililitrelik damlanın üzerine yerleştirin.

Embriyoyu küçük damlanın merkezine konumlandırmak ve jel donana kadar doğru yönelimini korumak için kılcal iğneyi kullanın. Son olarak, kabı doldurmak ve fazla agarozu uzaklaştırmak için trikain çalışma çözeltisi kullanın. Fotokonvertibl floresan protein kikumeGR'yi kodlayan mRNA enjekte edilmiş, ardından 15 somit aşamasında monte edilmiş ve 12 saat boyunca zaman atlamalı görüntülemeye tabi tutulmuş bir Zebrafish embriyosu örneği bu animasyonlu videoda gösterilmektedir.

Arka gövdenin serbestçe hareket etmesine izin verilmiştir ve bu durum, normal kültür koşullarında korionlarından bağımsız olarak gelişmesine izin verilen embriyolarda görülen morfolojik değişikliklerle benzerlik göstermektedir. Bu videoda, embriyoların 16 hücreli evresinde, çekirdekleri işaretleyen histon 2BRFP ve hücre membranlarını işaretleyen CAAXGFP kodlayan mRNA ile enjeksiyon yapılmıştır. Kuyruk tomurcuğu oluşumu sırasındaki hücre davranışlarını görüntülemek amacıyla, 10 somit evresinden itibaren üç saat boyunca, 25X su daldırma objektifli dik konumlu bir multifoton mikroskobu ile görüntüler alınmıştır.

Kuyruk tomurcuğu normal şekilde oluşurken, hücrelerin aktif çıkıntılar oluşturduğu ve yönlü hareket ettiği görülebilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yapıldığında 20 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, agaroz jel donarken embriyonun lateral pozisyonda olduğundan emin olmak önemlidir.

Aksi takdirde, görüntüleme sırasında ilgi bölgesi görüş alanının dışına hızla çıkacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, posterior vücut uzamasının canlı görüntülemesi için Zebrafish embriyolarının nasıl monte edileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız.