Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi
January 26th, 2017
Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.
Bu yöntemin genel amacı, arka vücut bölgesinin normal büyümesini sağlayan canlı görüntüleme için Zebra balığı embriyolarını monte etmektir. Bu yöntem, gelişmekte olan Zebra balığının diğer bölgelerinin görüntülenmesi için uyarlanabilir. Bu teknik, Gelişimsel Biyolojide, bireysel hücre davranışlarının tüm dokular düzeyinde morfogeneze nasıl yol açtığı gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur.
Bu tekniğin en büyük avantajı, embriyoyu doğru yönde tutarken arka cismin serbest momentini sağlamasıdır. Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpte E3 ortamına% 1.5'lik bir nihai konsantrasyonda düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve agarozu mikrodalgada ısıtarak çözün. Çözeltinin bir su banyosunda veya tezgah üstü inkübatörde 42 ila 45 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verin.
Metin protokolüne göre cam iğneleri çektikten sonra. Bir çift forseps ile, embriyoları yönlendirmek ve fazla agarozu çıkarmak için temiz ve keskin bir iğne oluşturmak için iğneyi büküldüğü noktadan hemen sonra kırın. Embriyoları E3 besiyerinde uygun aşamaya kadar yükseltin.
Daha sonra bir binoküler diseksiyon mikroskobu altında, embriyoları dekoryonlaştırmak için bir çift keskin forseps kullanın. Dekoryonlu embriyoları trikain çalışma solüsyonunda en az beş dakika inkübe edin. Daha sonra, minimum E3 ile dekoryonlu embriyoyu doğrudan 45 santigrat derece agarozun 50 mililitrelik tüpüne aktarmak için bir cam Pasteur pipeti kullanın.
Embriyoyu yaklaşık bir mililitre montaj agarozu ile birlikte çıkarın ve embriyo ile birlikte ortamın yaklaşık 100 mikrolitresini 35 milimetre cam tabanlı bir Petri kabının dibindeki 10 milimetrelik bir mikro kuyunun merkezine aktarın. Montaj ortamı ayarlanırken, embriyoyu kuyruk dışa bakacak şekilde agaroz çemberinin kenarına getirin. Arka vücut gelişimini görüntülemek için embriyoyu mümkün olduğunca yanal olarak yönlendirmek için kılcal iğneyi kullanın.
Daha sonra kılcal damar ile, jel tamamen ayarlanana kadar embriyoyu istenen yanal yönde tutun. Agaroz damlası sertleştikten sonra, Petri kabını doldurmak için trikat çalışma solüsyonu kullanın. Daha sonra, iletilen bir ışık tabanına sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, gelen ışığın ayna konumunu ve açısını ayarlayın, böylece güçlü kontrast agarozdaki kesiklerin net bir şekilde görülmesini sağlar.
Birinci kesimi gerçekleştirmek için, kılcal iğne veya mikro neşter kullanarak agarozu, yumurta sarısının bitişiğinde ve ortasında, beşinci ön somitin aşağısında oluşan kalp alanlarının hemen arkasında ve agarozdan cama kadar testereyle yukarı ve aşağı hareketle kesin. Burada, yumurta sarısı torbası üzerinde agarozu keserken embriyonun zarar görmemesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Daha sonra, embriyodan cama kadar, ilk beş somite teğet geçerek, arka gövdenin dorsal açılımına izin veren ikinci ve üçüncü kesimleri yapın.
Ardından, birinci ve üçüncü kesiklerin kesişme noktasından başlayarak, arka gövdeyi çevreleyen agaroz karesini yerinden çıkarmak için yavaşça yukarı kaldırırken üçüncü kesimin sonuna doğru yavaş bir çapraz kesim yapın. Bir çift keskin forseps ile, agaroz parçalarını kaldırırken Petri kabının duvarını destek olarak kullanarak yerinden çıkmış agaroz bloklarını embriyo ortamından çıkarın. Numune montajından önce, 100 milimetrelik bir plastik kabı beş milimetre yüksekliğe kaplamak için E3'te %1 agaroz kullanın ve sertleşmesine izin verin.
Daha sonra tabağın ortasına bir mililitre düşük erime noktalı agaroz damlatın ve onun da sertleşmesine izin verin. Embriyoları, bu videoda daha önce gösterildiği gibi düşük erime noktalı agaroza gömün. Bununla birlikte, bu sefer, embriyoyu 50 mililitrelik agaroz tüpünden daha küçük bir damla çözelti ile çıkarın ve bu küçük damlayı yemeğin ortasındaki bir mililitrelik damlanın üzerine yerleştirin.
Embriyoyu küçük damlanın ortasına yerleştirmek için kılcal iğneyi kullanın ve jel sertleşene kadar doğru yönünü koruyun. Son olarak, tabağı doldurmak ve fazla agarozu çıkarmak için tricaine çalışma solüsyonu kullanın. Bu animasyonlu videoda, fotokonvertibl floresan protein kikumeGR için mRNA kodlayan mRNA enjekte edilen, daha sonra 15 somit aşamasına monte edilen ve 12 saat boyunca hızlandırılmış hayal gücüne tabi tutulan bir Zebra balığı embriyosu örneği gösterilmektedir.
Arka gövdenin serbestçe hareket etmesine izin verilir ve normal kültür koşullarında koryonlarından bağımsız olarak gelişmesine izin verilen embriyolarda görüldüğü gibi morfolojide benzer değişiklikler sergiler. Bu videoda, embriyolar 16 hücre aşamasında, çekirdekleri etiketleyen histon 2BRFP ve hücre zarlarını etiketleyen CAAXGFP kodlayan mRNA ile enjekte edildi. Görüntüler, kuyruk tomurcuğu oluşumu sırasında hücre davranışlarını görselleştirmek için üç saat boyunca 10 somit aşamasından 25X suya daldırma objektifine sahip dik, çoklu foton mikroskobunda çekildi.
Kuyruk tomurcuğu normal şekilde oluşurken hücrelerin aktif çıkıntılar ve yönlü hareket oluşturduğu görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 20 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu işlemi gerçekleştirirken, agaroz jel sertleşirken embriyonun yan pozisyonda olduğundan emin olmak önemlidir.
Aksi takdirde, görüntüleme sırasında ilgilenilen bölge hızla görüş alanından çıkacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, arka vücut uzamasının canlı görüntülenmesi için Zebra balığı embriyolarının nasıl monte edileceğini net bir şekilde anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, canlı zebra balığı embriyolarının uzun süreli zaman aralıklı görüntüleme için çok yönlü bir montaj yöntemi sunar ve özellikle arka gövde gelişimine odaklanır. Teknik, normal gelişimi sağlarken morfogenez sırasında hücresel davranışların ayrıntılı gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Canlı Görüntüleme Teknikleri
- Zebra Balığı Embriyoloğu
Arka Plan
- Morfogenezin anlaşılması gelişimsel biyolojide kritik öneme sahiptir.
- Zebra balıkları, omurgalı gelişimini incelemek için bir model organizmadır.
- Canlı görüntüleme teknikleri hücresel dinamikler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Görüntüleme sırasında normal gelişimin korunması önemli bir zorluktur.
Çalışmanın Amacı
- Canlı görüntüleme için zebra balığı embriyolarını monte etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Normal gelişimi bozmadan arka gövde bölgesinin çıkıntısını gözlemlemek.
- Doku morfogenezinde bireysel hücre davranışlarının çalışmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Düşük erime noktalı agarose çözeltisinin hazırlanması.
- Görüntüleme için agarose içine zebra balığı embriyolarının yerleştirilmesi.
- Gözlem sırasında embriyoların doğru yönde tutulması.
- Yöntemin gelişmekte olan zebra balığının diğer bölgelerini görüntülemek için adapte edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, arka gövde bölgesinin serbest hareketine izin verir.
- Görüntüleme sırasında embriyoların normal gelişimi korunur.
- Anahtar hücresel davranışlar gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
- Teknik, çeşitli gelişimsel çalışmalar için uyarlanabilir.
Sonuçlar
- Bu montaj yöntemi, zebra balığı embriyolarının uzun süreli görüntülemesinde etkilidir.
- Gelişim süreçleri hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Teknik, gelişimsel biyolojideki araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In biopharma R&D, reliable live imaging of vertebrate developmental processes supports target validation and phenotypic screening by enabling observation of morphogenetic mechanisms in a physiologically relevant system. This zebrafish mounting method provides a reproducible platform for assessing compound effects on tissue elongation and cellular dynamics, contributing to mechanistic de-risking in early discovery. Its adaptability across microscopy setups enhances workflow flexibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing posterior body elongation as a disease-relevant system for morphogenetic pathway analysis.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal observation of tissue outgrowth without developmental disruption.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by linking cellular protrusions and directional movement to phenotypic outcomes in vertebrate development.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized zebrafish embryos for quantitative live imaging, ensuring consistent orientation and minimal perturbation during compound exposure.
- Reproducibility: The agarose embedding protocol allows for reliable sample preparation across upright, inverted, and light-sheet microscopy platforms.
- Scalability: Enables preparation of multiple embryos for parallel time-lapse imaging, supporting medium-throughput screening of developmental phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a vertebrate model system to study conserved morphogenetic processes applicable to human developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations of cell behaviors with preclinical validation by preserving normal development during imaging.
- Risk-Adjusted Decisions: Generates predictive confidence in target modulation by linking phenotypic changes to mechanism of action in a intact organism.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing imaging-ready models for mechanistic studies of vertebrate development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how cellular behaviors drive tissue-level morphogenesis in posterior body elongation.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantitative readouts on tissue outgrowth and cell movement, facilitating compound effect comparison.
- Analytics: Generates time-lapse datasets suitable for tracking cellular protrusions, directional migration, and morphological changes over developmental time.
- Translational Research: Connects early discovery imaging to preclinical continuity by maintaining normal embryogenesis during observation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mounting capability applicable to multiple developmental stages and regions, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vertebrate morphogenesis.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across microscopy platforms through defined agarose embedding and orientation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of developmental toxicity or pathway modulation in a whole-organism context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative phenotypic data for triage of leads affecting tissue elongation processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microsurgical techniques for embryo handling and agarose manipulation.
- Dependent on access to temperature-controlled water baths, microwells, and microscopy systems compatible with glass-bottomed dishes.
- Necessitates standardization of agarose concentration (1.5%) and equilibration temperature (42–45°C) across teams for consistent gel properties.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of embedding density and orientation constraints to preserve developmental freedom.
- Practical limitations include the 20-minute setup time per embryo and the need for careful orientation during gel setting to prevent drift of the region of interest.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Embedding Embryos for Inverted or Upright Microscopy
2:36
Removal of Excess Agarose Around the Posterior Body
4:03
Mounting of Embryos for Vertical Light-sheet Microscope
5:05
Results: Long-term Time Lapse Imaging of Mounted Zebrafish Embryos
6:15
Conclusion
