Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokolün genel amacı, zebra balığının çok parçalı hücrelerini yerinde etiketlemek ve görselleştirmektir. Bu yöntem, embriyonik zebra balığı böbreğindeki multicilyated sülfatları hangi faktörlerin düzenlediği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem protein hem de RNA transkriptlerinin aynı anda etiketlenebilmesidir, bu da zebra balığına özgü antikorların yokluğunda yararlıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, embriyoda değişiklikler yaptıktan sonra kirpiklerin varlığını analiz ederken pronephrostaki multicilyated hücreleri etiketlemeye gittiğimizde aklımıza geldi. Zebra balığı embriyolarını döllenmeden 24 saat sonra beş mililitre% 4 paraformaldehit içinde oda sıcaklığında iki ila dört saat boyunca çalkalama olmadan sabitleyerek başlayın. Daha sonra, embriyoları PBS'de %0.1 Tween 20 veya PBST ile iki kez yıkayın ve ardından beş mililitre% 100 metanol ile bir yıkama yapın.

Daha sonra, embriyoları eksi 20 santigrat derecede en az 20 dakika boyunca beş mililitre taze% 100 etanol içinde inkübe edin. Embriyoları hibridizasyona hazırlamak için, yenidoğanları beş mililitre% 50 metanol ve PBST içinde beş dakika boyunca rehidre edin, ardından beş mililitre% 30 metanol ve PBST içinde beş dakika izleyin. Embriyoları beş mililitre PBST'de her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve embriyoları beş mililitre bir ila 1.000 proteinaz K ve PBST çözeltisinde iki dakika boyunca inkübe edin, hemen ardından beş mililitre PBST'de iki yıkama daha yapın.

Embriyoları oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca beş mililitre% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından beş mililitre PBST 20'de iki yıkama yapın. Embriyolar ve hibridizasyon çözeltisi arasındaki etkileşimleri kolaylaştırmak için, embriyoları bir mikro santrifüj rafında dik düz tabanlı mikro santrifüj tüplerinde beş mililitre PBST'ye aktarın ve embriyoları her biri 1.5 mililitre hibridizasyon çözeltisinde beş dakika boyunca iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, embriyoları bir hibridizasyon fırınında 70 derecede 1.5 mililitre taze hibridizasyon solüsyonunda dört ila altı saat inkübe edin.

Ardından, 70 santigrat derecede bir gece prob hibridizasyonuna ulaşmak için hibridizasyon solüsyonunu 10 mikrolitre ilgili RNA probu ve 500 mikrolitre hibridizasyon solüsyonu ile değiştirin. Ertesi sabah, embriyoları 70 santigrat derecede yıkama başına 20 ila 30 dakika boyunca 1.5 mililitre% 50 formamid ve 2X salin-sodyum sitrat tamponu veya SSC içinde iki kez yıkayın. Daha sonra, embriyoları 15 dakika boyunca 70 santigrat derecede tek başına 1.5 mililitre 2X SSC'de bir kez yıkayın, ardından yıkama başına 20 ila 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede 1.5 mililitre 0.2X SSC'de iki yıkama yapın.

İkinci yıkamadan sonra, dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için 0.2X SSC'yi 1.5 mililitre bloke edici reaktif ile değiştirin. Ertesi sabah, blokaj reaktifini yaban turpu peroksidaz içinde 0.2 mililitre anti-digoksin ile değiştirin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında üç saatlik bir inkübasyon için bire 1.000 oranında bloke edici reaktif ile değiştirin. Daha sonra, embriyoları yıkama başına 10 ila 15 dakika boyunca 1.5 mililitre malik asit tamponunda iki ila dört kez yıkayın, ardından 1.5 mililitre taze malik asit tamponunda dört santigrat derecede bir gece inkübasyon yapın.

Ertesi sabah, malik asit tamponunu 1.5 mililitre PBS ile değiştirin ve embriyoları yıkama başına beş dakika boyunca 1.5 mililitre PBS'de iki kez yıkayın. Embriyoları 0.2 mililitre Si3 floresan duran solüsyonda 60 dakika inkübe edin, ardından 1.5 mililitre artan metanol konsantrasyonlarında dört ardışık 10 dakikalık yıkama yapın. Son inkübasyondan sonra, embriyoları oda sıcaklığında 1.5 mililitre% 1 hidrojen peroksit ve metanol içinde 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, embriyoları 1.5 mililitre azalan metanol solüsyonlarında yıkama başına 10 dakika boyunca yıkayın, ardından 1.5 mililitre PBS'de beş dakikalık iki yıkama yapın. Daha sonra, embriyoları 1.5 mililitre çift damıtılmış suda beş dakika yıkayın, ardından 1.5 mililitre eksi 20 santigrat derece asetonda yedi dakikalık bir yıkama yapın. Embriyoları 1.5 mililitre çift damıtılmış suda beş dakika boyunca yıkayın, ardından 1.5 mililitre PBST'de% 1 DMSO veya PBDT ile beş dakikalık bir yıkama yapın.

Embriyoları oda sıcaklığında 1.5 mililitre PBDT'de% 10 FBS ile iki saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. Daha sonra, dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için PBDT ve FBS'yi 1.5 mililitre birincil antikorlarla değiştirin. Ertesi sabah, embriyoları 1.5 mililitre PBDT, FBS ve 0.1 molar sodyum klorür içinde bir dakika boyunca sallanarak yıkayın, ardından 1.5 mililitre PBDT, FBS ve sodyum klorür içinde 30 dakikalık beş sallanan yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, embriyoları 1.5 mililitre PBDT ve FBS'de bir kez sadece 30 dakika boyunca sallanarak yıkayın, ardından uygun ikincil antikorların 200 mikrolitresinde ışıktan korunan dört santigrat derecede bir gece inkübasyon yapın. Ertesi sabah, embriyoları 1.5 mililitre PBDT'de iki kez hızlı bir şekilde yıkayın, ardından bir külbütör üzerinde 1.5 mililitre DAPI'de 15 dakikalık bir inkübasyon yapın. Daha sonra, embriyoları yıkama başına 15 ila 20 dakika boyunca FBS ve sodyum klorür ile 1.5 mililitre PBDT'de üç kez yıkayın ve embriyoları ortam ışığından korunarak dört santigrat derecede 1.5 mililitre PBDT'de saklayın.

Zebra balığı böbreklerini görüntülemek için, embriyoları yaklaşık 10 mikrolitre PBDT'de cam slaytlar üzerine yanal olarak yerleştirin. Bir çift ince forseps ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, başını ve yumurta sarısı topunun bir kısmını çıkarmak için ilk embriyoyu gözlerin arkasına sıkın. Ardından, kalan yumurta sarısı topunu embriyo gövdesinden nazikçe kazıyın.

Yumurta sarısı topunu çıkarırken, ilgilenilen doku kolayca yırtıldığından ve doğrudan uzantının üzerinde bulunduğundan, yumurta sarısı kesesi uzantısına dokunmamaya dikkat edin. Slayttan ayrışmış yumurta sarısını ve fazla sıvıyı çıkarmak için ince bir doku kullanın. Ardından, kalan kuyruğa bir damla montaj ortamı ekleyin ve kuyruğu yanlamasına konumlandırın.

Kuyruğu bir kapak fişi ile düzleştirin ve slaytı kapalı bir slayt kutusuna yerleştirin. Ardından, böbreğin kirpiklerini uygun floresan kanallarda görüntülemek için konfokal mikroskopta 60X objektifi kullanın. Az önce gösterildiği gibi boyanmış bir zebra balığı embriyosunun aşağıdaki temsili görüntülerinde, ODF3B transkript ekspresyonunu tanımak için kullanılan antisens riboprobun, gamet tübülin etiketli bazal cisimler ve kirpikler etiketli asetillenmiş alfa tübülinin görselleştirilmesine dayalı olarak çok parçalı hücreler tanımlanabilir.

Gerçekten de, embriyonik pronefrosun bu büyütmesinde, ODF3B transkriptleri, çoklu bazal cisimler ve silialara sahip çok parçalı bir hücre gözlenebilir. Bitişik monosiliyer hücre, tek bazal gövdesi ve tek siliyum fenotipi ile ayırt edilebilir. Bu prosedürü denerken, yeni sabitlenmiş embriyoları kullanmayı unutmamak ve ilk antikor eklendikten sonra örnekleri ortam ışığından korumak önemlidir.