Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokolün genel amacı, zebra balığındaki çok silli hücreleri in situ olarak işaretlemek ve görselleştirmektir. Bu yöntem, embriyonik zebra balığı böbreğinde çok silli sülfatları hangi faktörlerin düzenlediği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem proteinlerin hem de RNA transkriptlerinin eş zamanlı olarak işaretlenebilmesidir; bu durum, zebra balığına özgü antikorların bulunmadığı hallerde oldukça faydalıdır.

Embriyoda değişiklikler yaptıktan sonra siliyumların varlığını analiz ederken, pronefrodaki çok silli hücreleri etiketleme ihtiyacı duyduğumuzda bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz oluştu. İşleme, döllenmeden 24 saat sonraki zebrafish embriyolarını, oda sıcaklığında, çalkalamadan, beş mililitre %4 paraformaldehit içinde iki ila dört saat boyunca tespit ederek başlayın. Ardından, embriyoları iki kez %0,1 Tween 20 içeren PBS veya PBST ile yıkayın ve ardından beş mililitre %100 metanol ile bir kez yıkayın.

Ardından, embriyoları beş mililitre taze %100 etanol içerisinde -20 °C'de en az 20 dakika inkübe edin. Embriyoları hibridizasyona hazırlamak için, neonatları beş mililitre %50 metanol ve PBST içerisinde beş dakika, ardından beş mililitre %30 metanol ve PBST içerisinde beş dakika boyunca rehidre edin. Embriyoları beş mililitre PBST içerisinde iki kez beşer dakika yıkayın ve embriyoları beş mililitre 1:1.000 proteinaz K ve PBST çözeltisi içerisinde iki dakika inkübe edin; bunu hemen ardından beş mililitre PBST ile iki yıkama daha yaparak izleyin.

Embriyoları, oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca beş mililitre %4 paraformaldehit ile fikse edin ve ardından beş mililitre PBST 20 ile iki kez yıkayın. Embriyolar ile hibridizasyon çözeltisi arasındaki etkileşimleri kolaylaştırmak için embriyoları, bir mikro santrifüj rafı içindeki dik konumlandırılmış düz tabanlı mikro santrifüj tüplerinde beş mililitre PBST'ye aktarın ve embriyoları 1,5 mililitre hibridizasyon çözeltisi ile beşer dakikadan iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra embriyoları, bir hibridizasyon fırınında 70 °C'de 1,5 mililitre taze hibridizasyon çözeltisi içinde dört ila altı saat inkübe edin.

Ardından, 70 °C'de gece boyu sürecek prob hibridizasyonu için hibridizasyon çözeltisini 10 µL ilgili RNA probu ve 500 µL hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin. Ertesi sabah, embriyoları 70 °C'de, yıkama başına 20 ila 30 dakika olacak şekilde, 1,5 mL %50 formamid ve 2X salin-sodyum sitrat tamponu veya SSC içerisinde iki kez yıkayın. Daha sonra embriyoları 70 °C'de 15 dakika boyunca 1,5 mL tek başına 2X SSC ile bir kez, ardından 70 °C'de yıkama başına 20 ila 30 dakika olacak şekilde 1,5 mL 0,2X SSC ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, 0.2X SSC'yi 4 °C'de gece boyunca inkübasyon için 1,5 mililitre bloklama reaktifi ile değiştirin. Ertesi sabah, bloklama reaktifini, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak üç saatlik inkübasyon için 1:1.000 oranında hazırlanmış 0,2 mililitre horseradish peroxidase işaretli anti-digoksin ve bloklama reaktifi ile değiştirin. Ardından, embriyoları 1,5 mililitre malik asit tamponunda, her yıkama 10 ila 15 dakika sürecek şekilde iki ila dört kez yıkayın ve ardından 1,5 mililitre taze malik asit tamponunda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, malik asit tamponunu 1,5 mililitre PBS ile değiştirin ve embriyoları 1,5 mililitre PBS içinde, her yıkama için beş dakika olacak şekilde iki kez yıkayın. Embriyoları 0,2 mililitre Si3 floresan bekletme çözeltisinde 60 dakika inkübe edin ve ardından 1,5 mililitrelik artan metanol konsantrasyonlarında, her biri 10 dakika süren dört ardışık yıkama yapın. Son inkübasyondan sonra, embriyoları oda sıcaklığında 1,5 mililitre %1 hidrojen peroksit ve metanol içinde 30 dakika inkübe edin.

Ardından, embriyoları her yıkama için 10 dakika boyunca azalan konsantrasyonlu 1.5 mL metanol çözeltileri ile yıkayın ve ardından 1.5 mL PBS ile iki kez beşer dakika yıkayın. Sonrasında, embriyoları 1.5 mL çift distile su ile beş dakika boyunca yıkayın ve bunu 1.5 mL -20 °C asetonda yedi dakikalık bir yıkama ile takip edin. Embriyoları tekrar 1.5 mL çift distile su ile beş dakika boyunca yıkayın ve ardından %1 DMSO içeren 1.5 mL PBST veya PBDT ile beş dakika yıkayın.

Embriyoları, %10 FBS içeren 1,5 milliliters PBDT içerisinde oda sıcaklığında, bir sarsıntılı platformda iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, PBDT ve FBS'yi, dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübasyon için 1,5 milliliters primer antikorlarla değiştirin. Ertesi sabah embriyoları, 1,5 milliliters PBDT, FBS ve 0,1 molar sodyum klorür içerisinde sarsıntılı platformda bir dakika boyunca yıkayın ve ardından 1,5 milliliters PBDT, FBS ve sodyum klorür içerisinde 30'ar dakikalık beş sarsıntılı yıkama işlemi gerçekleştirin.

Son yıkamadan sonra, embriyoları 1,5 mililitre PBDT ve FBS içinde 30 dakika boyunca sallayarak bir kez yıkayın ve ardından ışıktan korunmuş şekilde dört santigrat derecede, 200 mikrolitre uygun sekonder antikorlar içinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, embriyoları 1,5 mililitre PBDT içinde hızlıca iki kez yıkayın ve ardından bir sallayıcı üzerinde 1,5 mililitre DAPI içinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, embriyoları yıkama başına 15 ila 20 dakika olacak şekilde FBS ve sodyum klorür içeren 1,5 mililitre PBDT ile üç kez yıkayın ve embriyoları ortam ışığından korunmuş şekilde dört santigrat derecede 1,5 mililitre PBDT içinde saklayın.

Zebrafish böbreklerini görüntülemek için embriyoları, yaklaşık 10 µL PBDT içeren lamlar üzerine yan şekilde yerleştirin. İnce uçlu bir pens ve diseksiyon mikroskobu kullanarak, ilk embriyoyu gözlerinin arkasından sıkarak başı ve vitellus kesesinin bir kısmını çıkarın. Ardından, embriyo gövdesinde kalan vitellus kesesini nazikçe kazıyarak temizleyin.

Vitellus küresini çıkarırken, ilgilenilen doku kolayca yırtıldığı ve uzantının hemen üzerinde yer aldığı için vitellus kesesi uzantısına dokunmamaya dikkat edin. Ayrışmış vitellüsü ve fazla sıvıyı lamdan temizlemek için ince bir doku kullanın. Ardından, kalan kuyruk kısmına bir damla bağlama medyumu ekleyin ve kuyruğu yan konumda yerleştirin.

Kuyruğu bir lamelle düzleştirin ve lamı kapalı bir lam kutusuna yerleştirin. Ardından, böbrek sillerini uygun floresan kanallarında görüntülemek için konfokal mikroskopta 60X objektif kullanın. Az önce gösterildiği gibi boyanmış bir zebra balığı embriyosunun aşağıdaki temsili görüntülerinde, çok silli hücreler; ODF3B transkript ekspresyonunu tanımak için kullanılan antisense riboprobun, gamet tübülini ile işaretlenmiş bazal gövdelerin ve asetillenmiş alfa tübülini ile işaretlenmiş sillerin görselleştirilmesine dayanarak tanımlanabilir.

Nitekim, embriyonik pronefrosun bu büyütmesinde, ODF3B transkriptlerine, çok sayıda bazal gövdeye ve siliya sahip çok siliyalı bir hücre gözlemlenebilir. Bitişikteki tek siliyalı hücre, tek bazal gövdesi ve tek siliyum fenotipi ile ayırt edilebilir. Bu prosedür uygulanırken, taze fikse edilmiş embriyoların kullanılması ve ilk antikor eklendikten sonra numunelerin ortam ışığından korunması gerektiği unutulmamalıdır.