Name: Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyolarında çoklu silyumlu hücreleri görüntülemek için bütün dağı Floresan in situ hibridizasyon ve ayırt yöntemini. Bu teknik, protein ve RNA transkriptlerini eşzamanlı olarak etiketleyerek gelişim biyolojisi araştırmalarında ileri düzeyde bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen R.A.W. ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu No R01DK100237 grant tarafından desteklenmiştir DGE-1313583 A.N.M. için Ayrıca üniversite, bilim yaz lisans araştırma bursu programı M.U. destek için teşekkür ederiz Bizim Zebra balığı özel onların bakımı için University of Notre Dame, Zebra balığı Araştırma Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Biyolojik Bilimler Bölümü üyeleri laboratuarımızın tüm destek ve değerli bakış açısı için teşekkür etmek istiyoruz.

Aşağıdaki iletişim kuralı muhafaza ve Merkezi tarafından Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre Dame, bakım Zebra balığı yetişkin kullanır. Zebra balığı yetişkin ve embriyo ile çalışmak için tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. embriyo fiksasyon
<ol><li>Önceden açıklanan yöntemleri39,40kullanarak Zebra balığı embriyo toplamak. 24 hpf, non-spesifik proteaz karışım çözüm (50 mg/mL) bir embriyo E3 500 µL bulaşık Incubate oda sıcaklığında (RT) ekleyin.</li>
	<li>Embriyo koryon patlak başladığınızda, tüm sıvı embriyo çanak kaldırın.</li>
	<li>Embriyo 2 - 3 kez ile taze E3 E3 yaklaşık 20 mL ekleyerek, yavaşça dönen E3 tabakta ve akışkan bir sıvı atık kabın decanting yıkayın.</li>
	<li>Embriyo düzeltmeden önce ötenazi için E3% 0,2 tricaine 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Embriyo bir plastik Pasteur pipet kullanarak 5 mL cam şişe aktarın. Embriyo şişeyi altına yerleşmiş sonra pipet kullanarak tricaine/E3 çözüm çoğunu kaldırın.</li>
	<li>24 hpf embriyo ajitasyon olmadan RT, 2-4 h %4 paraformaldehyde (PFA) ile 5 mL fix. Dikkat: PFA toksik ve araştırmacı göz koruması, eldiven ve önlük giyiyor iken İngiltere'de yılın çözümleri kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır. Olarak toz PFA statik yük dağıtmak eğilimi PFA sabitleştirici toz PFA toz üzerinden hazırlanması olağanüstü dikkatle yapılmalıdır. Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz %4 hazırlamak toz PFA tamamen erimesi için çözüm sürekli karıştırarak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) kaynatın x Isıtma tarafından İngiltere'de yılın. Çözüm geri RT, 4 İngiltere'de yılın 0,45 µm tek kullanımlık sistem vakum filtrasyonu için buradan geçen sterilize filtre % aşağı soğuduktan sonra sonra ve 15 mL veya 50 mL bölümleri için depolama-20 ° C'de içine bölünmemeli</li>
	<li>4 kaldırmak % PFA ve yıkama embriyo ile iki kez 1 X fosfat tamponlu ara-20 (PBST), dik yıkama embriyo 5 mL % 100 metanol (MeOH) de hemen ile RT. eklemek 5 mL taze % 100 % 0,1 ile serum fizyolojik MeOH embriyo için ve en az 20 dakika-20 ° C'de kuluçkaya. Not: Embriyo % 100 saklanabilir-20 ° c kadar embriyo hazırlık için hazır MeOH.</li>
</ol>2. embriyo hazırlık ve hibridizasyon
<ol><li>Embriyo 5 mL % 50 de içinde bir kez yıkama tarafından suyla temasa MeOH 1 x PBST embriyo 5 mL % 30 yıkama tarafından RT. devam rehidratasyon, 5 min için MeOH 1 x PBST dik, 5 min için yıkama embriyo 5 mL 1 x PBST 5 dk her için iki kez RT.</li>
	<li>Embriyo 5 mL lik 1:1,000 İndinavir K (pK) (10 mg/mL) kuluçka tarafından 1'permeabilize x PBST 2 dk RT. az için Not: Yukarıda 5 mg/mL ve kuluçka konsantrasyon zaman ancak az 2 dk pK konsantrasyon 2 dk embriyo 24 genç için önerilen daha uzun büyük embriyo inkübe hpf.</li>
	<li>PK çözüm ve yıkama hemen içinde 5 mL 1 x PBST dik, iki kez 5 mL % 4 embriyo düzeltmek de kaldırmak PFA RT için en az 20 dk at. Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz</li>
	<li>İngiltere'de yılın ve yıkama iki kez içinde 5 mL 1 de kaldırmak x PBST, RT.</li>
	<li>5 mL 1 de embriyo transferi x PBST düz dipli microcentrifuge tüpler içine yerleştirilen dik RT her embriyo ve sonraki hibridizasyon çözüm arasındaki etkileşimler kolaylaştırmak için bir microcentrifuge raf içine.</li>
	<li>İki kez 1.5 mL hibridizasyon çözeltisi (Hyb +) embriyo RT. eklemek 1.5 mL taze Hyb + yıkama ve embriyo 70 ° c 4-6 h hibridizasyon fırında kuluçkaya.</li>
	<li>Hyb + 1,5 mL sonda çözüm hacmi ile değiştirin (10 µL RNA sonda/500 µL Hyb +) embriyo tam olarak karşılamak yeterli. Not: Antisens RNA sonda kullanarak önceden açıklanan yöntemleri39sentez.</li>
	<li>70 ° C'de hibridizasyon fırında gecede sonda ile konumlandırılmış bireysel tüpler dik microcentrifuge rafa sallayarak olmadan melezlemek.</li>
</ol>3. sıcak yıkama ve engelleme
Not: Uygun bir çözüm üzerinde embriyo koyarak ve 70 ° C'de hibridizasyon fırında kuluçka sıcak yıkama yapılmaktadır 70 ° C'de yıkama çözümler tutmak için hibridizasyon fırında 50 mL tüpler her çözümün koyun zaman sonda / Hyb + karışımı eklenir.
<ol><li>Sonda kaldırın. İki kez 70 ° C'de % 50 formamide/2 20-30 dk için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek x 1,5 ml embriyo yıkayın. Not: Sonda Hyb +-20 ° C'de depolanan ve daha sonraki bir tarihte yeniden kullanılır.</li>
	<li>Embriyo bir kez 70 ° C 2 1.5 ml yıkayın. x SSC 15 dakika süreyle iki kez 70 ° C'de 0.2 X SSC için 20-30 dk her 1,5 ml embriyo yıkayın. Değiştir 0,2 x SSC ile 1,5 mL engelleme reaktif ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: RT, engelleme reaktif bir gecede yerine 4 h için kuluçkaya mümkündür.</li>
</ol>4. antikor kuluçka ve Maleik asit arabellek yıkar
Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.
<ol><li>Anti-DIG-HAZNESİNDEKİ engelleme reaktif 1:1,000 oranında, 0.2 mL engelleme reaktif yerine ve folyo veya başka bir ışık engelleme kapak RT. adlı altında 3 h için kuluçkaya Not: Alternatif olarak, antikor gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>3 saat sonra embriyo Maleik asit tampon 2 - 4 kez için 10-15 dk her RT. 1,5 ml taze Maleik asit arabellek 4 ° C'de embriyo gecede Incubate az 1,5 mL yıkayın. Not: Bu gecede Maleik asit arabellekte kuluçkaya gerekli değildir, ancak yapıyor çok soruşturma arka plan azaltır.</li>
</ol>5. sonda algılama ve kaldırma-in peroksidaz
Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.
<ol><li>Maleik asit arabellek kaldırın ve 1,5 mL 1 x PBS ile değiştirin. Embriyo iki kez 1.5 mL 1 x PBS 5 min için her dik Incubate embriyo 0.2 ml, Cy3, Floresan, RT. 60 dk için çözüm boyama yıkayın Not: Farklı probları için kuluçka süresi değişebilir.</li>
	<li>Embriyo bir kez ile aşağıdaki yüzde MeOH 1,5 mL 1 X PBS RT, 10 min için yıkayın: % 30 MeOH, %50 MeOH %75 MeOH ve % 100 MeOH.</li>
	<li>Dik Yıkama 30 dk için % 1 H2O2 MeOH 1,5 mL ile embriyo embriyo 1,5 mL 1 x PBS RT, 10 min için aşağıdaki MeOH çözümleri ile bir kez kuluçkaya: %75 MeOH, %50 MeOH ve % 30 MeOH. İki kez 5 min için embriyo RT 1,5 mL 1 x PBS yıkayın. Not: Embriyo PBS içinde gecede 4 ° C'de saklanabilir</li>
</ol>6. ayirt
Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.
<ol><li>RT. yıkamada embriyo 1.5'bir kez embriyoların bir kez GKD2O 5 min için 1,5 mL 7 dk RT. az yıkamak için embriyo GKD2O 5 min için 1,5 ml önceden soğutulmuş aseton (-20 ° C'de muhafaza) 1,5 ml embriyo RT. yıkamada yıkama 1 mL x PBST RT, 5 min için % 1 DMSO (PBDT) ile</li>
	<li>Embriyo PBDT + % 10 fetal sığır serum (FBS) 1,5 ml 2 h için RT, bir rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Kaldır PBDT + FBS ve birincil antikorlar, anti acetylated tübülin (fare üretilen) ve anti-γ-(tavşan üretilen), birlikte 1: 400 PBDT + % 1, seyreltilmiş tübülin 1,5 mL yerine FBS. Gecede 4 ° C'de embriyo kuluçkaya Not: Kuluçka kez birincil antikor bağlı olarak değişebilir. Farklı zaman aralıkları ile test etiketleme en iyi duruma getirmek için gerekli olabilir.</li>
</ol>7. ikincil antikor
Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.
<ol><li>PBDT + %1 1,5 mL fazla ilişkisiz antikor embriyo kaldırmak için FBS + 0.1 M NaCl bir rocker üzerinde RT, 1 dk. için yıkayın.</li>
	<li>Embriyo yıkama PBDT + %1 1,5 mL 5 kere FBS + 0.1 M NaCl RT. adlı bir rocker üzerinde her 30 dk için embriyo 1.5 mL PBDT + %1 yıkama FBS RT, bir rock'çı üzerinde 30 dk için.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de ikincil antikorların 200 µL içinde embriyo kuluçkaya birlikte 1:500 PBDT içinde seyreltilmiş Alexa 488 keçi Anti-fare IgG ve Alexa 647 keçi Anti-tavşan IgG,.</li>
</ol>8. DAPI boyama
Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.
<ol><li>Embriyo hızlı bir şekilde iki kez 1.5 mL PBDT RT yıkayın. PBDT DAPI 1,5 mL ile değiştirin, seyreltilmiş 1 X PBST 1:15000 ve RT, 15 dk bir rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Embriyo 1.5 mL PDBT + %1 yıkama FBS + 0,1 M NaCl üç kez RT 15-20 dk her. Mount ve görüntü için hazır kadar embriyo PBDT 1,5 mL 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>9. montaj ve Zebra balığı Pronephros için görüntüleme
<ol><li>Küçük hacimli, PBDT, yaklaşık 10 µL cam slayt üzerinde yatıyordu embriyo lateral.</li>
	<li>Embriyo gözlerinin arkasında iyi forseps baş kaldırmak için bir çift ve bazı sarısı topu ile sıkmak.</li>
	<li>İyi forseps yavaşça uzakta kalan sarısı topu embriyo vücuttan kazımak için kullanın. Disosiye sarısı ve sıvı ilave ince bir doku ile slayt kaldırın.</li>
	<li>Embriyo kalan kuyruğunun medyaya montaj bir damla ekleyin ve kuyruk yanal koydu şekilde yerleştirin. Bir coverslip kuyruk örnek Düzleştir'i, sonra kapalı slayt kutusunda yer için üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü aşağıdaki kanallar kullanarak confocal mikroskop üzerinde 60 X büyütme, böbrek kirpikler: DAPI mavi (lazer 408.0 set nm), yeşil FITC (lazer 488.0 set nm), Cy3 boya kırmızı etiketli (lazer 561.0 set nm) ve Alexa 680 beyaz (lazer 637.0 set nm).</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+Int%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study segmentation.</a> Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+from+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Chambers, B. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+progenitors%3A+roles+in+kidney+disease+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration.</a> World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).</li>
<li>Drummond, B. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+kidney+stem+cell+development+and+regeneration+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish.</a> World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).</li>
<li>Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+catch%3A+zebrafish+as+a+model+for+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease.</a> Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132, 1907-1921 (2005).</li>
<li>Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithlelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134, 1111-1122 (2007).</li>
<li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged2a-Notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genetics. 3, e18(2007).</li>
<li>Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+is+regulated+by+interactions+between+retinoic+acid%2C+mecom%2C+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling.</a> Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b+regulates+multiciliogenesis+during+organ+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish.</a> Development. 140, 2755-2764 (2013).</li>
<li>Marra, A. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+fate+in+the+nephron+tubule+is+mediated+by+the+ETS+transcription+factors+etv5a+and+etv4+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development.</a> Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).</li>
<li>Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennas+of+organ+morphogenesis%3A+the+roles+of+cilia+in+vertebrate+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development.</a> Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).</li>
<li>Duffy, J. L., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+human+renal+proximal+tubular+cells.+Observations+in+three+cases+of+hypercalcemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia.</a> Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).</li>
<li>Katz, S. M., Morgan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+the+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cilia in the human kidney.</a> Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).</li>
<li>Hassan, M. O., Subramanyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+renal+tubular+cells+in+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis.</a> Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).</li>
<li>Ong, A. C., Wagner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proximal+tubular+motile+cilia+in+a+patient+with+renal+sarcoidosis+associated+with+hypercalcemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia.</a> Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).</li>
<li>Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ependymal+cilia%3A+distribution+and+activity+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain.</a> Science. 139, 221-222 (1963).</li>
<li>Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+ciliary+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Disorders of ciliary motility.</a> Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).</li>
<li>Jain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationship+between+primary+and+motile+ciliogenesis+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).</li>
<li>Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicilin+promotes+centriole+assembly+and+ciliogenesis+during+multiciliate+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).</li>
<li>Tan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myb+promotes+centriole+amplification+and+later+steps+of+the+multiciliogenesis+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program.</a> Development. 140, 4277-4286 (2013).</li>
<li>Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gmnc+is+a+master+regulator+of+the+multiciliated+cell+differentiation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program.</a> Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X0861821X">Analysis of Protein and gene expression.</a> Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).</li>
<li>Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=zS-5CKOjCIgC&pg=PA39&lpg=PA39&dq=Looking+at+Embryos+Schulte&source=bl&ots=mqm0o5OPaM&sig=usQ4HF0pGM7oova5E5Vwx0RBACw&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwji3oiZ7LjUAhXk8YMKHXJYDVkQ6AEIJjAA#v=onepage&q=Looking%20at%20Embryos%20Schulte&f=false">Chapter 2: Looking at Embryos.</a> Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, (2011).</li>
<li>Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tbx2a%2Fb+transcription+factors+direct+pronephros+segmentation+and+corpuscle+of+Stannius+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish.</a> Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).</li>
<li>Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cilia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li>
<li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060(2013).</li>
<li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li>
<li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li>
<li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604(2014).</li>
<li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralı pronephros odf3b transkriptler ve α-tübülin içinde 24 hpf Zebra balığı embriyo ile MCCs etiketleme için optimize edilmiştir. En iyi sonuçlar için bu taze sabit ve hazırlanmış embriyo kullanmak için tavsiye edilir. Ama istenmeyen arka plan boyama ile embriyo depolama biriminde tutulur zaman artar olasılığı sabit ve ya MeOH veya Hyb + bir haftadan uzun-20 ° C'de saklanan embriyolar kullanılabilir.
Değişiklikler ve bu tekniğin sorun giderme bu yöntem diğer suites özel işaretleri, örneğin diğer antianlamlı riboprobes ve diğer antikorları için terzi gereklidir. Bütün Dağı in situ hibridizasyon sürecinde adımları parametrelerini ayarlamak için pek çok yöntem olmuştur daha önce31,34,36,38, bizim grup ve diğerleri tarafından belgelenen 39. Aynı şekilde, her protein antikoru bazı kere boyama açısından sorun giderme gerektirecektir ve dilutions ve kuluçka süreleri her birincil antikor için yaklaşık aralıkları en iyi belgelenmiş sonuçları28, değerlendirilmesi tarafından tahmin edilir 35. embriyo 24 genç için hpf, pK tedavi 2 dk kısa olmalıdır nerede embriyo 24 büyük hpf pK 2 dk daha uzun süre ile tedavi. Ayrıca, embriyo 24 büyük hpf pigment pK tedavi öncesi ağartılmış.
Floresan boyama çözüm ile boyama sonra kalan leke, antikor ve peroxidases metanol ve hidrojen peroksit yıkar dizi gerçekleştirerek kaldırmak için önemlidir. Hemen ardından PBS yıkar aşırı metanol embriyo kaldırmak için hayati önem taşımaktadır. Önemlisi, eğer antikorlar ile devam etmeden önce biz daha az bir başka ve/veya santrifüj tüpleri için uygun olasılığı embriyoların yapmak aseton ve deiyonize suyla yıkama bulduk. Bizim deneyim, antikorlar belirli transkripsiyon faktörleri ve diğer genler için onlar verimli çalışabilir olsa Western engelliyor, Zebra balığı Eğer için iyi çalışmıyor. Ancak, α-tübülin ve β-catenin, gibi son derece korunmuş ve bol protein de Zebra balığı Eğer16,37için çalışır.
Balık ile henüz belirli antikor içinde Zebra balığı var mı genler RNA Tutanaklar görselleştirmek mümkündür. Balık Eğer ile birleştirerek, bu iletişim kuralı tarafından gösterildiği gibi protein ve RNA transkript co yerelleştirme görülen vivo içinde (Şekil 2) olabilir. Esnek doğası çeşitli RNA transkriptler ve proteinler arasında çok sayıda doku ve zaman Puan görselleştirme için hızlı sorun giderme sağlar. Zebra balığı embriyo zaten saygın özellikleri ile birleştirildiğinde, bu iletişim kuralı balık + Eğer genler ve proteinler önemli ifade gelişimsel yolu düzenleme için keşfetmek için başka bir araç sağlar.

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) gelişim biyolojisi çalışmak için ana model organizma ortaya çıkmıştır. Embriyoların anne dışında geliştirmek ve optik saydamdır. Ayrıca, göz, böbrek ve ön gibi hayati organların oluşumunu hızla, sadece 24 saat sonrası döllenme tarafından (hpf) oluşan yapılar ile oluşur. Önemlisi, Zebra balığı genom son derece memeliler1,2,3ile korunmuş. Ayrıca, Zebra balığı ve memeli organları benzer anatomisi ve fizyolojisi olması. Zebra balığı embriyonik böbrek veya pronephros, erken nephrogenesis ve korunmuş epitel hücre popülasyonlarının omurgalı nefron4, kader tayini sırasında gen fonksiyon incelenmesi için modeli sistem değerini gösterir 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. benzer şekilde, Zebra balığı embriyo MCCs11,12,13,14,15, ontogeny incelerken giderek daha önemli hale gelmiştir 16 , 17.
Onların adından da anlaşılacağı gibi MCCs epitel hücrelerinin apikal yüzey17tarihinde yer alan hareketli kirpikler bir bohça ile karakterize vardır. Zebra balığı, MCCs sıvı akışı çalışması ve 24 hpf11,12,13,14tarafından, pronephros her nefron yarısı boyunca moda gibi bir "salt-and-pepper" içinde dağınık 15 , 16 , 17. her ne kadar onlar sadece bir avuç dikkat edilmiştir insan böbrek hastalığı18,19,20,21durumlarda, MCCs yaygın beyin gibi memeli diğer dokularda ve deneysel tasarım zorluklar bir dizi pozlar Trakea22,23,24. Zarif Zebra balığı da dahil olmak üzere çeşitli omurgalı modelleri çalışmalarda mm kaderin korunmuş bir patika yol mm geliştirme12,17,25 bir inhibitörü olarak sinyal çentik ile göstermiştir ,26,27. Bu nedenle, Zebra balığı pronephros mm geliştirme vivo içinde11,12,13,14, genetik mekanizmaları incelemek için kolayca erişilebilir modeli sağlar 15 , 16 , 17.
Şeffaflık ve genetik manipülasyon kolay: Zebra balığı embriyoların hücre kaderi, doku büyüme ve gelişme erken embriyo1,2 düzenleyen genetik ve moleküler yolları okurken çok değerli özellikleri olduğu kanıtlanmıştır ,3. Situ hibridizasyon ve bütün Dağı Eğer gibi protein ve gen transkript görselleştirmek, edilmiş uygulanan ve Zebra balığı16,28,29içinen iyi duruma getirilmiş için böyle, geleneksel teknikleri, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Balık ve eğer için popüler iletişim kuralları birleştirerek, etiket ve MM'ler vivo16,28,37,38analiz etmek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>spesifik olmayan proteaz karışım çözeltisi</td><td>Roche</td><td>11459643001, Streptomyces griseus'tan pronaz</td><td>50mg / mL stok çözeltisi yapmak için E3 <güçlü>olmadan< / güçlü> metilen mavisi ile seyreltin; -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>E3 çözeltisi</td><td></td><td></td><td>50X E3'ü (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, damıtılmış suda 16.5 mM MgSO4) damıtılmış suda seyreltin; kontaminasyonu önlemek için 1 x 10-5 M metilen mavisi (sigma M9140) ekleyin</td></tr><tr><td>tricaine (etil 3-aminobenzoat metansülfonat)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>% 0.2'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 g trikin tozunu 10 mL Tris içinde çözün, pH 9.5 ve 500 mL'ye kadar damıtılmış su</td></tr><tr><td>embriyo tabakları</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL cam şişeler</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>tek kullanımlık plastik Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>19210</td><td>%4 PFA'yı 1X PBS'de çözün ve çeker ocak altında kaynatın. Soğutun ve alın, ardından -20 ° C'de saklayın. Kullanım için çözüldükten sonra tekrar dondurmayın.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB11072</td><td>1X stok yapmak için damıtılmış suda seyreltin</td></tr><tr><td>Tween-20 stoğu</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB02038</td><td>Damıtılmış suda seyrelterek %0,1 Tween-20 stoğu yapın.</td></tr><tr><td>% 0.1 Tween 20 (PBST)</td> <td>Sigma</td><td>P9416</td> 1X PBS metanol (MeOH) <td>içinde% 0.1 Tween-20 ile</td>1X fosfat tamponlu salin</tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinaz K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>10 mg / mL'lik bir stok yapmak için damıtılmış suda çözün; alikot ve -20&°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>düz tabanlı mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00600</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>hibridizasyon çözeltisi (HYB+)</td><td></td><td></td><td>%50 formamid, 5X SSC, %0.1 Tween-20, 5 mg/mL maya torula RNA, 50 & mu; g/&mu; L heparin; -20&�C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>hibridizasyon fırını</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X tuzlu su-sodyum sitrat (SSC) tampon çözeltisi</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB13156</td><td>2X ve 0.2X stok bloke edici reaktif çözeltisi yapmak için damıtılmış suda seyreltin</td></tr><tr><td></td><td>Ro</td><td>11096176001</td> che% <td>10'luk bir stok çözeltisi yapmak için maleik asit tamponunda seyreltin; 4 & deg'de saklayın; C</td></tr><tr><td>maleik asit tampon çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>M0375 ve S7653</td><td>150mM maleik asit, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr> <tr><td>anti-Digoksigenin-POD, Fab parçaları</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Cy3 floresan boyama çözeltisi</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 sistem</td><td>mağazası 4 & derece; C; kit tamponunda 1:50 seyreltme TSA reaktifi (60 uL DMSO içinde çözülmüş) yaparak boyama solüsyonunu taze hazırlayın</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit (H2O2)</td> <td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>moleküler dereceli damıtılmış su (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>aseton</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00636-01000</td><td>, -20 ° C'de bir alikot saklar; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>alikot ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>monoklonal anti-asetillenmiş tübülin klonu 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>alikot ve -20&�C'de saklayın; Tavşan</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>alikotunda üretilen C anti-&gama;-tubulin anitbody</td><td>ve -20&°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA klonu MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>bakteri gliserol stoğunu -80 ° C'de depolar; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa unu 647 keçi anti-tavşan IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21245</td><td>4 & deg'de saklayın; C; ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 keçi anti-fare IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>4 & deg'de saklayın; C; DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>alikotunu ışıktan koruyun ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>cam kaydırak</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>cam lamel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>ince forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Cımbız Desen #55</td></tr><tr><td>montaj ortamı</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly / Mount</td><td>mağazası 4 derece; C</td></tr><tr><td>konfokal mikroskop ve ilgili yazılım</td><td></td><td></td> NIS elemanları AR yazılımı rocker Bio-Rad 1660710EDU <td>ile bir Nikon C2plus Konfokal Mikroskop kullanıyoruz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı bütün dağı floresan situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Son yıllarda, Zebra balığı embriyo rahim embriyo gelişimi ve optik şeffaflık gibi özellikleri nedeniyle gelişim biyolojisi eğitim için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Zebra balığı embriyo omurgalı böbrek organogenesis yanı sıra multiciliated hücre (mm) gelişimini incelemek için önemli bir organizma haline gelmiştir. Embriyonik Zebra balığı böbrek MCCs görselleştirmek için bütün Dağı Floresan situ hibridizasyon (balık) kombine bir protokol geliştirdik ve tüm yüksek kararlılık düşsel sağlayan ayirt (Eğer) mount. Bu el yazması RNA transkript ve protein birlikte gelişim programları aracılığıyla çeşitli soy faktörleri ifade Yönetmeliği daha iyi anlamak için bir araç olarak yerelleştirme için bizim teknik anlatılmaktadır.

Vahşi-türü Zebra balığı embriyo 24, sabit hpf ve hemen yukarıda açıklandığı gibi hazır. Şekil 1 seçili resimli aşamaları birlikte deneysel bir iş akışı gösterilmektedir. 1-8 adımda belirtilen iş akışı örnek ihale, fiksasyon ve antianlamlı riboprobes ayirt tarafından takip için etiket protein(s) ilgi ile endojen transkript etiketlemek için sabit doku manipülasyonu süreçleri kapsar. Adım 9 iş akışında montaj ve görselleştirme Zebra balığı embriyonik gövde en iyi duruma getirmek için özel olarak tasarlanmış teknikleri görüntüleme anlamına gelir. Adım 9 eşlik çizimlerde doku bir cam slayt üzerinde konumlandırma için düzenleme yöntemi göstermektedir. Bu adımda, embriyo baş ve sarısı top kaldırıldı, yanal bir cam slayt ve coverslip arasında konumlandırılmış olması için kuyruk bırakarak. Sarısı topu otomatik fluoresces ve montaj işlemi engelleyen kaldırma sarısı topu ve kafa pronephros ikamet mm nüfusun en iyi görüntüleme için önerilmektedir.
Confocal mikroskop kullanılarak elde temsili resimleri 60 X büyütme, aynı vahşi tipi embriyo ve dijital zoom aynı büyütmede gösteren Şekil 2, sağlanır. Alt iki panel kompozit kaplama bu görüntüleme veri iken üst paneller, tek tek her kanal görüntüleri sağlar. Beyaz kutu (sol sütun görüntüde) dijital zoom (sağ sütun görüntü) odak alan özetliyor. Dijital zoom final Masası'nda vurgulanan, çekirdeği içinde DAPI etiketli ve MM'ler burada γ-tübülin antikorlar Bazal organları göstermek ve α-tübülin kirpikler gösterir odf3b, tanımak için tasarlanmış bir antianlamlı riboprobe üzerinde dayalı tespit edildi. Kompozit kaplama dijital yakınlaştırma sarı çizgili daire odf3b Tutanaklar, birden fazla Bazal organları ve kirpikler sahibi nedeniyle tespit edildi bir mm tarafını gösterir. Sarı noktalı daireyle etiketli bitişik mono siliyer hücreyi tek bir Bazal vücut ve tek bir cilium sahip fenotip üzerinde dayalı tespit edilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel akış çizelgesinin şematik. Bu deneysel bir iş akışı akış gösterir eşlik tarafından kritik etap kar tanesi soğuk kuluçka gösterir çizimler, üç eğik çizgiler ısı temsil ve uzun bir kuluçka kez saat temsil eder. Bazı adımlar iletişim kuralında belirtildiği gibi daha uzun süreler içinde gerçekleştirilebilir olsa iş akışını en az (sağ üst köşesinde gün sayısını işleminin her aşamasında görmek) 6 gün içinde gerçekleştirilebilir. Montaj işlemi ayrıntılı bir tasviri, cam slayt ve coverslip arasındaki son takılı embriyo kuyruk gösteren çizilir. Siyah bir Kesikli kutu 60 X büyütme oranında görüntüsü alan özetliyor. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Şekil 2: temsilcisi sonuçları Zebra balığı pronephros MCCs görüntülenmesi için. Maksimum görüntü projeksiyonları 24 hpf vahşi tipi Zebra balığı embriyo 60 X büyütme yanı sıra confocal, 60 X büyütme aynı embriyo üzerinde dijital zoom. Beyaz kutuları için yakınlaştırma odaklı alanını gösterir. Bireysel lekeleri DAPI (çekirdek), odf3b (MCCs), γ-tübülin (Bazal organları) ve α-tübülin (kirpikler) etiketli ve alttaki iki panellerinde birlikte birleştirilmiş. Dijital zoom, biz aşağıdaki gibi yaklaşımları, hücre konumları sağlar: bir mm Kesikli sarı daire tarafından özetlenen ve noktalı sarı daire mono siliyer bir hücre özetler. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Bu protokolün genel amacı, zebra balığındaki çok silli hücreleri in situ olarak işaretlemek ve görselleştirmektir. Bu yöntem, embriyonik zebra balığı böbreğinde çok silli sülfatları hangi faktörlerin düzenlediği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem proteinlerin hem de RNA transkriptlerinin eş zamanlı olarak işaretlenebilmesidir; bu durum, zebra balığına özgü antikorların bulunmadığı hallerde oldukça faydalıdır.Embriyoda değişiklikler yaptıktan sonra siliyumların varlığını analiz ederken, pronefrodaki çok silli hücreleri etiketleme ihtiyacı duyduğumuzda bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz oluştu. İşleme, döllenmeden 24 saat sonraki zebrafish embriyolarını, oda sıcaklığında, çalkalamadan, beş mililitre %4 paraformaldehit içinde iki ila dört saat boyunca tespit ederek başlayın. Ardından, embriyoları iki kez %0,1 Tween 20 içeren PBS veya PBST ile yıkayın ve ardından beş mililitre %100 metanol ile bir kez yıkayın.Ardından, embriyoları beş mililitre taze %100 etanol içerisinde -20 °C'de en az 20 dakika inkübe edin. Embriyoları hibridizasyona hazırlamak için, neonatları beş mililitre %50 metanol ve PBST içerisinde beş dakika, ardından beş mililitre %30 metanol ve PBST içerisinde beş dakika boyunca rehidre edin. Embriyoları beş mililitre PBST içerisinde iki kez beşer dakika yıkayın ve embriyoları beş mililitre 1:1.000 proteinaz K ve PBST çözeltisi içerisinde iki dakika inkübe edin; bunu hemen ardından beş mililitre PBST ile iki yıkama daha yaparak izleyin.Embriyoları, oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca beş mililitre %4 paraformaldehit ile fikse edin ve ardından beş mililitre PBST 20 ile iki kez yıkayın. Embriyolar ile hibridizasyon çözeltisi arasındaki etkileşimleri kolaylaştırmak için embriyoları, bir mikro santrifüj rafı içindeki dik konumlandırılmış düz tabanlı mikro santrifüj tüplerinde beş mililitre PBST'ye aktarın ve embriyoları 1,5 mililitre hibridizasyon çözeltisi ile beşer dakikadan iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra embriyoları, bir hibridizasyon fırınında 70 °C'de 1,5 mililitre taze hibridizasyon çözeltisi içinde dört ila altı saat inkübe edin.Ardından, 70 °C'de gece boyu sürecek prob hibridizasyonu için hibridizasyon çözeltisini 10 µL ilgili RNA probu ve 500 µL hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin. Ertesi sabah, embriyoları 70 °C'de, yıkama başına 20 ila 30 dakika olacak şekilde, 1,5 mL %50 formamid ve 2X salin-sodyum sitrat tamponu veya SSC içerisinde iki kez yıkayın. Daha sonra embriyoları 70 °C'de 15 dakika boyunca 1,5 mL tek başına 2X SSC ile bir kez, ardından 70 °C'de yıkama başına 20 ila 30 dakika olacak şekilde 1,5 mL 0,2X SSC ile iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, 0.2X SSC'yi 4 °C'de gece boyunca inkübasyon için 1,5 mililitre bloklama reaktifi ile değiştirin. Ertesi sabah, bloklama reaktifini, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak üç saatlik inkübasyon için 1:1.000 oranında hazırlanmış 0,2 mililitre horseradish peroxidase işaretli anti-digoksin ve bloklama reaktifi ile değiştirin. Ardından, embriyoları 1,5 mililitre malik asit tamponunda, her yıkama 10 ila 15 dakika sürecek şekilde iki ila dört kez yıkayın ve ardından 1,5 mililitre taze malik asit tamponunda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, malik asit tamponunu 1,5 mililitre PBS ile değiştirin ve embriyoları 1,5 mililitre PBS içinde, her yıkama için beş dakika olacak şekilde iki kez yıkayın. Embriyoları 0,2 mililitre Si3 floresan bekletme çözeltisinde 60 dakika inkübe edin ve ardından 1,5 mililitrelik artan metanol konsantrasyonlarında, her biri 10 dakika süren dört ardışık yıkama yapın. Son inkübasyondan sonra, embriyoları oda sıcaklığında 1,5 mililitre %1 hidrojen peroksit ve metanol içinde 30 dakika inkübe edin.Ardından, embriyoları her yıkama için 10 dakika boyunca azalan konsantrasyonlu 1.5 mL metanol çözeltileri ile yıkayın ve ardından 1.5 mL PBS ile iki kez beşer dakika yıkayın. Sonrasında, embriyoları 1.5 mL çift distile su ile beş dakika boyunca yıkayın ve bunu 1.5 mL -20 °C asetonda yedi dakikalık bir yıkama ile takip edin. Embriyoları tekrar 1.5 mL çift distile su ile beş dakika boyunca yıkayın ve ardından %1 DMSO içeren 1.5 mL PBST veya PBDT ile beş dakika yıkayın.Embriyoları, %10 FBS içeren 1,5 milliliters PBDT içerisinde oda sıcaklığında, bir sarsıntılı platformda iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, PBDT ve FBS'yi, dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübasyon için 1,5 milliliters primer antikorlarla değiştirin. Ertesi sabah embriyoları, 1,5 milliliters PBDT, FBS ve 0,1 molar sodyum klorür içerisinde sarsıntılı platformda bir dakika boyunca yıkayın ve ardından 1,5 milliliters PBDT, FBS ve sodyum klorür içerisinde 30'ar dakikalık beş sarsıntılı yıkama işlemi gerçekleştirin.Son yıkamadan sonra, embriyoları 1,5 mililitre PBDT ve FBS içinde 30 dakika boyunca sallayarak bir kez yıkayın ve ardından ışıktan korunmuş şekilde dört santigrat derecede, 200 mikrolitre uygun sekonder antikorlar içinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, embriyoları 1,5 mililitre PBDT içinde hızlıca iki kez yıkayın ve ardından bir sallayıcı üzerinde 1,5 mililitre DAPI içinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, embriyoları yıkama başına 15 ila 20 dakika olacak şekilde FBS ve sodyum klorür içeren 1,5 mililitre PBDT ile üç kez yıkayın ve embriyoları ortam ışığından korunmuş şekilde dört santigrat derecede 1,5 mililitre PBDT içinde saklayın.Zebrafish böbreklerini görüntülemek için embriyoları, yaklaşık 10 µL PBDT içeren lamlar üzerine yan şekilde yerleştirin. İnce uçlu bir pens ve diseksiyon mikroskobu kullanarak, ilk embriyoyu gözlerinin arkasından sıkarak başı ve vitellus kesesinin bir kısmını çıkarın. Ardından, embriyo gövdesinde kalan vitellus kesesini nazikçe kazıyarak temizleyin.Vitellus küresini çıkarırken, ilgilenilen doku kolayca yırtıldığı ve uzantının hemen üzerinde yer aldığı için vitellus kesesi uzantısına dokunmamaya dikkat edin. Ayrışmış vitellüsü ve fazla sıvıyı lamdan temizlemek için ince bir doku kullanın. Ardından, kalan kuyruk kısmına bir damla bağlama medyumu ekleyin ve kuyruğu yan konumda yerleştirin.Kuyruğu bir lamelle düzleştirin ve lamı kapalı bir lam kutusuna yerleştirin. Ardından, böbrek sillerini uygun floresan kanallarında görüntülemek için konfokal mikroskopta 60X objektif kullanın. Az önce gösterildiği gibi boyanmış bir zebra balığı embriyosunun aşağıdaki temsili görüntülerinde, çok silli hücreler; ODF3B transkript ekspresyonunu tanımak için kullanılan antisense riboprobun, gamet tübülini ile işaretlenmiş bazal gövdelerin ve asetillenmiş alfa tübülini ile işaretlenmiş sillerin görselleştirilmesine dayanarak tanımlanabilir.Nitekim, embriyonik pronefrosun bu büyütmesinde, ODF3B transkriptlerine, çok sayıda bazal gövdeye ve siliya sahip çok siliyalı bir hücre gözlemlenebilir. Bitişikteki tek siliyalı hücre, tek bazal gövdesi ve tek siliyum fenotipi ile ayırt edilebilir. Bu prosedür uygulanırken, taze fikse edilmiş embriyoların kullanılması ve ilk antikor eklendikten sonra numunelerin ortam ışığından korunması gerektiği unutulmamalıdır.

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Öğrenin, Danio rerio embriyolarında çoklu silyumlu hücreleri görüntülemek için bütün dağı Floresan in situ hibridizasyon ve ayırt yöntemini. Bu teknik, protein ve RNA transkriptlerini eşzamanlı olarak etiketleyerek gelişim biyolojisi araştırmalarında ileri düzeyde bilgi sağlar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet