Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Bu yöntem, immünoloji alanındaki T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu ve Th1 farklılaşmasının yanı sıra adaptif bağışıklığın hücre stimülasyonunu sunan antijen ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo bir ortamın incelenmesine izin verirken aynı zamanda in vitro hücre manipülasyonuna izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü organ ve kemik izolasyonu ve evlat edinen transfer adımlarının yalnızca metin talimatlarıyla ustalaşması zordur.

Kemik iliği hücresi izolasyonu için, yetişkin bir farenin arka bacaklarını %70 etanol ile dezenfekte edin ve arka bacaklar boyunca yanal bir cilt kesisi yapmak için makas kullanın. Bacakların medial yönüne makas yerleştirin ve cildi arka bacakların başlangıcına kadar makasla kesin. Sonra cildi bacaklardan ayırmak için forseps kullanın.

Makas kullanarak kası femur ve tibiadan ayırın ve kalça eklemini parçalamak için makas kullanarak femur başını kırın. Daha sonra kemik uçlarını kırmadan femureyi tibiadan ayırın ve kemikleri buz üzerinde tam orta dereceli bir petri kabına yerleştirin. Tüm kemikler hasat edildiğinde, her kemiğin proksimal ve distal uçlarını bir neşter ile dikkatlice kesin ve kemikleri toplam 10 milileter ılık tam RPMI ortamı hacmiyle tekrar tekrar yıkamak için 25 guage iğne ile donatılmış 1 milileter şırınga kullanın.

Tüm kemikler yıkandıktan sonra, tabağın tüm içeriğini 70 mikrometre gözenekli naylon ağ filtreli 50 milileter konik bir tüpe aktarın ve hafif karıştırma ve pipetleme ile kalıntıları ve hücre kümelerini dikkatlice çıkarın. Santrifüj ile kemik iliği hücrelerini toplayın. Pelet, pipetleme ile dört santigrat derece kırmızı kan hücresi lizis tamponunun bir milileter içinde yeniden süspanse edin ve karışımı buz üzerinde beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, 10 milileter PVS ile lizizi durdurun ve peleti ikinci bir santrifüjleme için 25 milileter tam ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri saymak için 5 milileter taze tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. İkincil lenfoid doku hücre izolasyonu için, OT-II transgenik farelerden aksuinal, aksiller, brakiyal, servikal ve mezentaryal lenf düğümlerini ve dalağı toplayın ve ikincil lenfoid dokuları 10 milileter tam RPMI ortamı içeren plastik bir petri kabına aktarın.

Tüm dokular toplandığında, lenf düğümlerini ve dalağı 50 milileter konik bir tüpte 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın ve dokuları homojenize etmek için bir şırınga pistonu kullanın. Süzgeci 15 mililete kadar ortamla yıkayın ve hücreleri santrifüjleme ile döndürün. Daha sonra CD4 pozitif T hücrelerini standart protokollere göre manyetik boncuk sıralama ile izole edin.

Naif OT-II CD4 pozitif T hücrelerinin in vivo aktivasyonu için, manyetik boncuk izole edilmiş T hücrelerini standart protokollere göre hayati hücre izleyici boya ile etiketleyin ve etiketli hücreleri 100 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra hayvan başına 100 mikrolitre hücreyi kuyruk damarı yoluyla evlat edinerek aktarın. Kuyruk damarlarının tüm hücre hacminin verilmesine izin verecek kadar genişlemiş olduğundan emin olmak için enjeksiyondan önce fareleri önceden ısıtın.

24 saat sonra, her bir T hücresi enjekte edilen hayvanın ayak pedine deri altı enjeksiyonu ile beşinci LPS ile olgunlaşmış OVA peptit yüklü dendritik hücrelere 10 verin. Evlat edinme mücadelesinden iki ve beş gün sonra, gösterildiği gibi doku işleme ve T hücresi izolasyonu için alıcı hayvanlardan poplitial lenf düğümlerini toplayın. T hücresi aktivasyonunu analiz etmek için, akış sitometrisi ile alıcı CD4 pozitif popülasyondaki CD64 pozitif, CD25 pozitif T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için CD4, CD69 ve CD25'e karşı floresan antikorlarla ikinci gün izole edilmiş hücreleri boyayın.

T hücresi proliferasyonunu değerlendirmek için, beşinci gün izole edilmiş hücreleri CD4'e karşı uygun floresan antikorlarla boyayın ve donör CD4 pozitif T hücresi popülasyonundaki hayati hücre izleyici boya sinyalinin bozunmasını akış sitometrisi ile analiz edin. Th1 farklılaşmasını değerlendirmek için, 96 oyuklu bir plakada, oyuk başına iyonomisin ve PMA ile desteklenmiş, 200 mikrolitre tam ortamda oyuk başına dört kez 10 ila beşinci gün beş izole T hücresi plakalayın. Daha sonra plakayı altı saat boyunca 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve stimülasyonun son dört saatinde sitokin sekresyonunu bloke etmek için her bir oyuğa Brefeldin A ekleyin.

Kuluçka işleminin sonunda, plakayı santrifüjleyin ve süpernatanı hızlı ters çevirerek atın. Hücreleri anti-CD4 antikoru ile boyayın, ardından oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 100 mikrolitre% 2 paraformaldehit ve% 1 sükroz içinde fiksasyon yapın. Hücreleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 50 mikrolitre geçirgenlik tamponu ile geçirgenleştirin, ardından kuyu başına 150 mikrolitre PBS ile santrifüjleme yıkaması yapın.

Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca standart protokollere göre ilgilenilen hücre içi sitokinleri boyayın, ardından oyuk başına% 1 saponin ile takviye edilmiş 150 mikrolitre PBS ile iki santrifüj yıkaması yapın. Ardından, hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. LPS stimülasyonundan sonra GM-CSF kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin akış sitometrik analizi, MHCII, CD80 ve CD86 gibi olgunlaşma belirteçlerinin yukarı regülasyonunu ortaya koymaktadır.

Naif CD4 pozitif OT-II T hücreleri, T hücresi aktivasyon belirteçlerinin, yüzey ekspresyonunun ve çoklu hücre bölünmesi turlarının yukarı regülasyonu ile alıcı hayvanlara evlat edinici transferden sonra aktive olur. Aktivasyon üzerine, çoğalan CD-pozitif OT-II T hücreleri, hücre içi interferon gama ekspresyonu ile gösterildiği gibi bir Th1 fenotipi gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, tüm reaktifleri ve malzemeleri deneyden bir gün önce hazırlamayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, immünoloji araştırmacılarının farelerde dendritik hücreleri ve T hücrelerini incelemesinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farelerin femurlarından ve tibialarından kemik iliğini nasıl izole edeceğinizi ve T hücrelerinin ve dendritik hücrelerin alıcı hayvanlara nasıl aktarılacağını iyi anlamış olmalısınız.

İğne, neşter veya makas gibi keskin aletlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürleri gerçekleştirirken her zaman uygun parmak koruması kullanmak gibi önlemler alınmalıdır.