Name: Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin epitel transport mekanizmalarını ve SERT regülasyonunu 3D Caco-2 hücre kültürleri ile Ussing chamber tekniği kullanarak fare bağırsağında incelemeyi. Bu yöntemler ilaç tarama çalışmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RKG laboratuvarında MD/PhD öğrencisi olan Bay Christopher Manzella'ya makalemizi düzenlemeye ve düzeltmeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

jelatinli protein karışımı ile ilgili artan 3D Caco-2 hücre kültürü: Caco-2 3D kültür sisteminde bağırsak taşıyıcılar 1. Çalışma <ol><li> Çözülme büyüme faktörü 8 saat boyunca buz üzerinde, jelatinimsi bir protein karışımı düşük (ya da O / N), 4 ° C&#39;de ilave edildi. Bir kez 1 mL veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de kullanıma veya deposu için 500 uL alikot yapmak çözülmüş. </li><li> kültür gününde, buz üzerinde kültürü (RNA ve protein ekstraksiyonu için) plakaları ya da (immün) odacıklı slaytlar ön soğutma. Sekiz oyuklu bölmeli-cam slayt (ya da 6-plaka oyuk başına 120 uL) her bir oyuğuna, jelatinimsi protein karışımı 30 ul ekleyin ve yayılır. sürecinde hava kabarcığı oluşturmak için özen gösterin. </li><li> 15, 37 ° C&#39;de bir hücre kültür inkübatörü içinde kayar ve / tabak koyun - 30 dakika ve jelatinli protein karışımı, katılaşmaya sağlar. </li><li> jelatinimsi bir protein karışımı, katılaşan iken, Caco-2 hücrelerinin konfluent balon trypsinize. </li><li> sayısını sayınve hücrelerin 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjde 500 xg&#39;de bunları dönerler. gerektiği gibi 3D Caco-2 Orta hücre pelet yeniden askıya. </li><li> (Plakalar için kuyu başına 20.000) kuyu başına 4,000 hücre cam haznesi slaytlar Tohum. Hücreler 37 ° C&#39;de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde büyümeye olanak sağlar. 4 d - orta her 3 değiştirin. </li></ol> 3D Caco-2 hücrelerinde Epitel Taşıyıcılar 2. İmmünofloresan Boyama: 1. Gün <ol><li> orta aspire ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (NaOH ile 8.5&#39;a ayarlanmıştır pH PBS)% 2 paraformaldehit 400 uL (PFA) ile hücrelerin tespit. Not: PFA Çözelti 4 ° C &#39;de en fazla 1 hafta saklanmamalıdır ve taze çözelti kullanılabilir. DİKKAT: PFA son derece zehirlidir ve potansiyel kanserojendir. Her zaman kimyasal kaput dikkatli ve kişisel koruyucu ekipman kullanarak başa. </li><li> (1 x PBS ile iki kez kuyu durulayın ve PBS içinde 4 ° C&#39;de slaytlar depolamak 400 uL /iyi). Bir kez, sabit bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. </li><li> RT&#39;ye odası slaytlar (bu jelatinimsi protein karışımı yatak sertleşmesine ve yıkama adımları sırasında aspirasyon için kolay hale getirecek) ısıtın. </li><li> Artık daha 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton ile hücrelerin geçirgenliği. </li><li> PBS-glisin tamponu (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin) hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 1 x PBS-glisin ile 3 kez yıkayın. </li><li> Immünofloresan tamponu (IF) hazırlanması: 130 mM NaCI, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin, 7.7 mM NaN3,% 0.1 BSA,% 0.2 Triton X-100 ve% 0.05 Tween-20 . </li><li> IF yıkayın 3x oda sıcaklığında 10 dakika her biri için tampon. % 5 blok IF tamponu Normal Keçi Serum (NGS). IF +% 1 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor, 200 uL inkübe / oyuk, 1 - oda sıcaklığında 2 saat. 10 dakika her biri için IF tampon 3x ile yıkayın. </li><li> İkincil anti-ile inkübegövde (1: 200), oda sıcaklığında 1 saat, eğer +% 1 NGS, 200 uL / ​​oyuk içinde seyreltilmiş. </li><li> 10 dakika her biri için bir IF tamponu ile üç kez yıkanır. Bu aşamada karanlıkta slaytlar tutun. onun kenar temas kuyuların kenarına kadar tutucu sayesinde beyaz bir kaldırıcı bir siyah tutucu bölme slayt yerleştirerek ve sürgülü cam slaytlar plastik odaları kaldırın. Yavaşça odaları (tutucu ve kaldırıcı kültür slaytlar ile gelmelidir) yukarı çekin. </li><li> Yavaş, anti-solma ortamı ile monte ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakılır. </li><li> Tamamen kurumuş sonra, oje ve konfokal mikroskobu ile görüntü onlara olan slaytlar mühür. iki hafta ya da daha fazla ay -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de slaytlar saklayın. </li></ol> 3D Caco-2 hücreleri, 3. RNA ve protein çıkarımı <ol><li> TGF-p ß1 bir test maddesi ile 14 D (10 ng / ml, 1 H), - 12 jelatinimsi protein karışımı ile kültürlenen hücrelerin tedavi edin. </li><li> Tedaviden sonra, 1 hücreleri yıkayınX PBS ile yıkandı. 30 dakika jelatinli protein karışımı sıvılaştırılması için buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> soğutulmuş PBS ile kuyu yıkayın ve bireysel santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. 500 xg ile 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de düşük hızda santrifüjleme kullanılarak hücreler toplanır. Standart prosedürler kullanılarak RNA ekstrakte ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanımı. </li><li> Protein ekstre için, 1 x proteaz kokteyli inhibitörü ile desteklenmiş 1 x hücre parçalama tamponu kullanılarak hücrelerin lize. pelet hücre parçalama tamponu ilave edildikten sonra, sonikasyon ile hücreler lize edildi ve 7,500 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak. </li></ol> Bir Ussing Odası kullanılması Fare ileumda 5-HT Alımına 4. Ölçümü: Bağırsak Hazırlık seromusküler Sıyırma <ol><li> Ötenazi ardından, fareler incelemek ve (mide sonra çekum öncesi) küçük bağırsak kaldırın. üç bölüme ince bağırsak bölün. Orta üçüncü atın proksimal üçte kullanmakjejunum olarak ve ileum olarak uzak üçte kullanın. epiteline zarar görmesini önlemek için kendi mezenterik eki bağırsak çekerek kaçının. buz gibi soğuk Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) tampon ile kaplayıp doku bölümü soğuk tutmak. </li><li> uzunlamasına makas kullanılarak bağırsak açın. KBR seromüsküler sıyırma önce 10 dakika boyunca 1 uM indometasin ihtiva eden gazla, buz gibi soğuk taze kesilmiş bağırsak bölümlerinde inkübe edin. </li><li> % 7 agaroz veya tedavi silikon elastomer (0.5 cm kalınlığında) içeren bir plaka aşağı bağırsak bölümü (uzunluğu ~ 1 cm) mukozal tarafı sabitleyin. </li><li> alt aydınlatma ile bir diseksiyon stereomikroskop altında seromusküler katmanları soyun. Bir tüy neşter bıçak kullanarak seromusküler katman kesti. bağırsak uzunlamasına ekseni boyunca tabakanın kenar elde etmek için ince forseps kullanın. NOT: sıyırma işlemi sırasında, stereomicroscope alt aydınlatma Peyer yama ile alanları belirlemek ve önlemek için yardımcı olures. </li><li> seromüsküler sıyırma tamamlanmasından sonra, Ussing yarı bölmenin pimlerin üzerine dikkatli bir şekilde mukozayı monte edin. Tüm süreç boyunca, yırtılmasını önlemek için kenarlarından elimden mukozal doku tutmaya özen gösterin. </li></ol> 5. Dengeleme ve Doku Tedavisi <ol><li> Krebs çözeltisi hazırlayın: 115 mM NaCI, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, ve% 95 O 2/5 ile% gazlı pH 7.4&#39;te 0.4 mM KH 2 PO 4, 37 ° C&#39;de CO2. ozmotik dengesini korumak için mukozal banyosuna bir enerji substrat ve 10 mM mannitol olarak hizmet serozal banyosuna 10 mM glukoz ekleyin. Not: Krebs solüsyonu, hücre içi, 5-HT bozulmasını önlemek için, L-askorbik asit (100 uM) ve pargilin (100 uM, monoamin oksidaz inhibitörü) ile takviye edilmektedir. </li><li> apikal (lümen) si, hem maruz odasına kaydırıcıyı yerleştirinde ve Krebs solüsyonu doku bazolateral (serozal) yan. </li><li> 10 dakikalık bir dengeleme döneminden sonra, J ms (mukozal-To-serozal akışı) apikal tarafında, 30 dakika için fluoksetin (10 uM) ile ön işleme tabi ileal doku. </li><li> Bazolateral tarafında, 1 saat boyunca, TGF-ß1 (10 ng / ml) ile doku tedavi ve apikal taraftan 30 dakika boyunca 3 [H] -5-HT (20 nM) ile inkübe edin. </li></ol> Serozal Flux (J ms) ve 3 [H] Doku -5-HT Birikim mukozal 6. sayısallaştırılması <ol><li> Bir sıvı sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçmek ve mukozal-to-serozal (J MS) akış oranı hesaplamak için (toplam 5 mL) serozal haznesinden 0.75 mL alikotları toplamak; Fluoksetin duyarlı akı 3 [H] -5-HT alımını SERT aracılı temsil eder. </li><li> serozal tarafında ve yeniden numune almak, bir akı dönemde mukoza boyunca hidrostatik basınç farklılıkları önlemek içinBanyo ortamının eşit hacimleri ile koyun. NOT: akı hesaplama ucu numune (4.25 ml / 5 ml = 0.85) seyreltilmesi için düzeltir. </li><li> 3 [H] doku biriken -5-HT ölçümü için, sürgü mukoza çıkarmak buz soğukluğunda KRB tamponu ile bir kez yıkanır, camdan yapılmış bir kültür tüpleri içine yerleştirin. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de% 10 KOH 0.5 mL mukoza inkübe edin. bir sıvı ışıma sayacı kullanılarak (üçlü olarak) lizatlarının 150 uL alikotları radyoaktivite ölçülür. </li><li> Bradford metodu kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatlarının - (5 uL 3) alikotları kullanın. Not: Radyoaktif serotonin içeren kuluçka ortamı 10 ml, bir standart olarak kullanılır. 5-HT pmol / mg protein / dakika olarak ifade edilir doku içinde muhafaza. </li></ol>

<ol><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).</li>
<li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li>
<li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+%28Caco-2%29+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+%28SERT%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li>
<li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+expression%2C+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li>
<li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li>
<li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5%27-nucleotidase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li>
<li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BDetection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Virusol%22%5BJournal%5D)">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li>
<li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li>
<li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+for+shingles%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J+%28Clin+Res+Ed%22%5BJournal%5D)">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li>
<li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li>
<li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li>
<li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mbo+II+methylase+%28GAAGmA%29+from+Moraxella+bovis%3A+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li>
<li>Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. <a target="_blank" href="http://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(14)62381-7/abstract">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).</li>
<li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+%28type+O%29+during+passage+in+partly+immunized+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li>
<li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion%5D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ter+Arkh%22%5BJournal%5D)">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li>
<li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis%3A+validation+and+reference+data%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bağırsak taşıma 10, 11, 12, 13, 14, 15 okumak için epitel mono tabakaları polarize tam olarak farklılaşmış Caco-2 hücre mono tabakaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bağırsak epitel hücrelerinin fizyolojik organizasyonunu taklit etmek için, 3D bir Caco-2 kültürün gelişmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Bağırsak epite...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

bağırsak epitel lümeninde sıvı salgılanması ve iyonların çeşitli taşıyıcı proteinler (kanalları, ATPazların, ko-nakliyeciler ve değiştiriciler) besin, elektrolit emilimi kadar sayısız fonksiyonları yerine, ve uyuşturucu ile donatılmıştır. Transport proteinleri vektörel bir şekilde iyonlar veya moleküller hareketine olanak elektrokimyasal eğimler oluşturur. Bu polarize epitel hücrelerinin en üst ve taban zarlarında taşıma sistemleri asimetrik dağılımları ile elde edilir. Buna ek olarak, bitişik epitel hücreleri urgan sıkı bağlantıları, en üst ve taban membran alanları arasında bileşenlerin zar içi difüzyon karşı bir engel olarak hizmet eden bu süreçte önemli bir rol oynar. Yerli bağırsak bu karakteristik özelliklerini taklit uygun model sistemler (örneğin polarizasyon, farklılaşma ve sıkı kavşak bütünlüğü) functio çalışma için kritikepitel taşıma sistemlerinin tesi. modelleri ile ilgili olarak, intestinal epitel taşıma araştırmalarında anda kullanılan tipik hücre çizgileri, Caco-2, tam olarak farklılaşmış bir modeli olan küçük bağırsak epitel hücreleri absorbe; ve T84 hücreleri veya HT-29 alt klonlar, kript kaynaklı kalın bağırsak epitel hücreleri 1 modeller. Geleneksel olarak, bu hücre hatları plastik yüzeyler içinde mono-tabaka olarak veya kaplanmış Transwell yetiştirilir. Bir dereceye kadar trans-iyi hücre kültür ekleri polarize hücreleri basolaterally beslemeye izin vererek in vivo ortamda benzer. Bununla birlikte, geleneksel 2B kültür sistemlerinde bir sınırlama hücreleri, suni düz ve katı bir yüzeye uyum sağlamak zorunda olmasıdır. Böylece, yerli epitel fizyolojik karmaşıklığı doğru bir 2D sisteminde yansıtılmaz. Bu sınırlama, bu jelatinimsi proteini MIXTUR&#39;a gibi belirli bir mikro-3D hücrelerin büyümesini yöntemler ile aşılmıştırE, hücre dışı matris bileşenleri, 2, 3, çeşitli ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, in vitro kültürleri birden hücre tiplerini ve bağırsakta bölgeye özgü bir mimariye sahiptir bağırsak epiteli, karmaşıklığı taklit edemez. Bu nedenle, hücre kültürü modelleri kullanılarak çalışmalar, ana bağırsakta daha fazla değeri gerektirir. In vitro 3D hücre kültürü ve fare bağırsak mukozasını kullanarak, bağırsak serotonin transporter (SLC6A4, SERT) düzenlenmesi incelemek için buraya basit yöntemler açıklanmaktadır. Bağımlı işlemi - SERT taşıyıcı hızla Na + / Cl üzerinden taşındığında, önemli bir hormon ve nörotransmitter, 5-hidroksitriptamin (5-HT) hücre dışı durumu düzenler. SERT, anti-depresanlar, bilinen bir hedef ve en son, ishal ve bağırsak iltihabı gibi GI bozukluklarının, yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır.Yöntem bağırsak epitelial hücrelerinde 5-HT alım daha önce tarif edilmiştir araştırmak. Örneğin, plastik destek ya da geçirgen eklerde yetiştirilen Caco-2 hücreleri, üst ve taban üzerindeki etki 4 hem de fluoksetin duyarlı 3H-5-HT geri alımını sergiledikleri gösterilmiştir. Insan organ donörü ince bağırsaklarda hazırlanan izole fırça kenar zar vezikülleri (BBMVs) SERT fonksiyonunun ölçülmesi de bizim 5 tarafından tarif edilmiştir. İnsan BBVMs 3 H-5-HT alım fluoksetin duyarlı Na + / Cl olduğu gösterilmiştir - bağımlı ve 300 K m nM 5 doygunluk kinetiği göstermiştir. Benzer yöntemler kullanarak, aynı zamanda, daha önce, fare bağırsak BBMVs 6, 3H-5-HT alımı, SERT fonksiyonu ölçülen. Bununla birlikte, temiz plazma zar veziküllerinin hazırlanması doku mukozanın gerektirir. Bu radiog gibi diğer yöntemler,3H-5-HT alım siteleri sonuçlarda be- lirgin görselleştirme da gine domuzu ve sıçan ince bağırsak 7 daha önce gösterilmiştir. Ussing odası çeşitli epitel doku iyonların, besin ve ilaç taşıma ölçmek için daha fizyolojik bir sistem sağlar. Ussing odası tekniğin önemli avantajı, sağlam, polarize bağırsak epiteli elektriksel ve nakil parametrelerinin hassas ölçüm mümkün kılmasıdır. Dahası, içsel nöromüsküler sistemin etkisini en aza indirmek için, bağırsak mukozasının seromusküler sıyırma epiteli 8 taşıyıcılar düzenlenmesini araştırmak için yapılabilir. Bu jelatinimsi protein üzerinde 3D yetiştirilen Caco-2 hücreleri, farklı üst ve taban üzerindeki işaretleri ifade eden bir içi boş lümen olduğu belirlenmiştir. Bu hücreler, 2D Caco-2 hücreleri daha SERT yüksek ifadesini gösterir. Yöntemler 3D hücreleri büyümek ve perform immün veya RNA ve protein çıkarma açıklanmıştır. Buna ek olarak, bir Ussing odası tekniği kullanılarak ince bağırsak mukozasında, TGF-ß1 bir pleiotropik sitokin tarafından SERT fonksiyonu ve düzenleme çalışma yöntemleri tarif eder.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC ATCC</td><td>& kayıt; HTB ve utangaç; 37&ticaret;</td><td>Hücre</td></tr><tr><td>Konfokal Görüntüleme için</td> <td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td> Microsope</tr><tr><td>3[H]-5-HT&nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>Mikroskopi için kültür hücreleri</td></tr><tr><td>5-HT&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>Tehlikeli madde değil</td></tr><tr><td>%95 O2-% 5 CO2 silindir</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Agar (Agar plakaları için)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>Akut toksisite, Ora</td></tr><tr><td>Agar (elektrot için)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Yutulduğunda veya solunduğunda zararlı</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Caco-2 Hücreleri</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Hücre lizis Tamponu</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Değil tehlikeli madde</td></tr><tr><td>Chabered slaytlar</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>Tehlikeli bir madde değil</td></tr><tr><td>Kollajen Tip-1 Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotlar</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Corning</td><td>356234</td><td>Hücre dışı matris olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Fluoksetin</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Ortamı Glisin</td><td>Hücre Sinyali, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td>Life Technologies tarafından <td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Gibco</td><td>Life Technologies tarafından 15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>tarafından 15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon sayacı&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta Fizyolojik</td><td>Aletler, San Diego, CA&nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Fizyolojik</td><td>Aletler, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA&nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA&nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kanallı Gerilim / Akım Kelepçesi</td><td>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA ve nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu (NGS, %10)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Kalem-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>MEDOX, Chicago, IL&nbsp;</td><td>stil G-12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA kolay Mini kit</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kanallı Elektrot Giriş Modülü&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Snapwell Odaları için Kaydırıcılar</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat (Na2HPO4)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum-Hidroksit (NaOH)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratuvarları, Herkül, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Odası (yalnızca oda)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Oda Sistemleri</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

yöntem 3d yetiştirilen yerli barsak ve caco-2 hücreler epitel ulaşım protein fonksiyonu ve anlatım eğitim için

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

bağırsak epiteli yabancı parçacıklara bir bariyer sağlarken vücudun normal fizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynayan önemli ulaşım ve bariyer fonksiyonları vardır. Bozulmuş epitel taşımacılığı (iyon, besin veya ilaç) birçok hastalıkla ilişkili bulunmuştur ve epitel bütünlüğünü ve bağırsak mikrobiyomları etkileyerek gibi taşıyıcılar, normal fizyolojik fonksiyonları ötesine sonuçlar doğurabilir. fonksiyonu ve transport proteinleri düzenlenmesini anlamak geliştirilmiş terapötik girişimlerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. epitel taşıma çalışmada büyük zorluk yerli bağırsak epitel hücrelerinin önemli özelliklerini özetlediği uygun bir model sistemi geliştiriyor. Bu Caco-2, T-84 ve HT-29-Cl.19A hücreleri gibi çeşitli in vitro hücre kültürü modelleri, tipik olarak epitel taşıma araştırmalarında kullanılmıştır. Bu hücre hatları e modelleme için bir indirgemeci yaklaşımı temsilpithelium ve epitel-mikrobiyal etkileşimleri bunların incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok mekanik çalışmalar, kullanılmıştır. Ancak, hücre mono tabakaları doğru hücre-hücre etkileşimleri hem de in vivo mikro-yansıtmamaktadır. 3D yetiştirilen hücreler, ilaç geçirgenliği çalışmaları için modeller umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu 3D Caco-2 hücreleri, epitel taşıyıcıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Caco-2 hücrelerinde yapılan çalışmalar, hücre spesifik etkileri ekarte etmek ve dikkate yerli bağırsağın karmaşıklığı almak için diğer modelleri ile tamamlanmaktadır olması da önemlidir. Çeşitli yöntemler, daha önce bu izole epitel hücrelerinde veya izole edilmiş plazma zar veziküllerinde dışa eğik kesesi ve emme olarak taşıyıcılar, işlevselliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. modellerine saygı ve taşıma fonksiyonu ölçümü ile dikkate alan zorlukları alırsak, biz burada 3D Caco-2 hücreleri büyümek ve bir gibi bir Ussing odasının kullanımını tanımlamak için bir protokol göstermektediretkin bir yaklaşım gibi sağlam polarize bağırsak epitel olarak serotonin naklini ölçmek için.

3B, Caco-2 kisti immün, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Phalloidin aktin ile boyandı 3D kist iyi sınırlı lümen gösteren bir XY düzleminde bir temsilcisi görüntü Şekil 1A gösterilmiştir. lümen bakan tarafı apikal tarafı gösterir. Sağlam epitel fenotip bir 3D ortamda sonucunda kültüre epitel hücreleri. Aktin ve SERT eş lekeli gün 12, Farklı Caco-2 kistleri, Şekil 1B&#39;de gösterilmiştir. Bir XY düzlemine (Şekil 1A&#39;da ...

3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.

Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Bu protokolün genel amacı, intestinal Caco-2 hücrelerini üç boyutlu olarak büyütmek ve serotonin taşıyıcı regülasyonu üzerine yapılan çalışmalarda Ussing odasının kullanımını göstermektir. Burada gösterilen yöntemler, intestinal serotonin taşıyıcısı SERT'in nasıl regüle olduğu gibi epitelial taşıma alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. 3D Caco-2 hücrelerinin temel avantajı, hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerini tek tabakalara göre daha doğru yansıtmalarıdır.Ussing kamarası tekniği, bağırsak epitelyumundaki taşıma fonksiyonunun hassas bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. 3B Caco kültürlerinin önemi, bu modellerin değiştirilmiş taşıma fonksiyonu ile ilişkili hastalıklara karşı ajanların taranmasını sağlaması nedeniyle terapötiklerin keşfine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem serotonin taşıyıcı regülasyonuna dair içgörü sağlasa da, sodyum ve klor gibi diğer elektrolit taşıyıcılarının çalışmalarına da uygulanabilir.Seromusküler tabakanın soyulması ve intestinal mukozanın Ussing odacıklarına yerleştirilmesi öğrenilmesi zor işlemler olduğundan, bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. 3D Caco-2 hücre prosedürlerini eğitmen Ishita Chatterjee ve

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Caco-2 hücreleri, lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların/vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak hizmet edebilir. Geçirgen membran sistemi, apikal kısmı bazolateral bölmeden ayırırken, lentivirüs ekspresyon sistemi etkili bir gen aşırı ekspresyon yöntemi sunar. Lipoproteinlerin izolasyonu TEM ile doğrulanır.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Burada ince bağırsak organoidlerinin bariyer bütünlüğünü ölçmek için bir teknik açıklanmıştır. Yöntemin canlı organoidlere dayanması, farklı bariyer bütünlüğünün maddeleri veya bunların kombinasyonlarını zaman içinde çözümlü bir şekilde modüle ederek sıralı olarak araştırılmasını sağlar.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Öğrenin epitel transport mekanizmalarını ve SERT regülasyonunu 3D Caco-2 hücre kültürleri ile Ussing chamber tekniği kullanarak fare bağırsağında incelemeyi. Bu yöntemler ilaç tarama çalışmaları için değerlidir.

Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

Daha fazla video keşfet