Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

Bu protokolün genel amacı, intestinal Caco-2 hücrelerini üç boyutlu olarak büyütmek ve serotonin taşıyıcı regülasyonu üzerine yapılan çalışmalarda Ussing odasının kullanımını göstermektir. Burada gösterilen yöntemler, intestinal serotonin taşıyıcısı SERT'in nasıl regüle olduğu gibi epitelial taşıma alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. 3D Caco-2 hücrelerinin temel avantajı, hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerini tek tabakalara göre daha doğru yansıtmalarıdır.

Ussing kamarası tekniği, bağırsak epitelyumundaki taşıma fonksiyonunun hassas bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. 3B Caco kültürlerinin önemi, bu modellerin değiştirilmiş taşıma fonksiyonu ile ilişkili hastalıklara karşı ajanların taranmasını sağlaması nedeniyle terapötiklerin keşfine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem serotonin taşıyıcı regülasyonuna dair içgörü sağlasa da, sodyum ve klor gibi diğer elektrolit taşıyıcılarının çalışmalarına da uygulanabilir.

Seromusküler tabakanın soyulması ve intestinal mukozanın Ussing odacıklarına yerleştirilmesi öğrenilmesi zor işlemler olduğundan, bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. 3D Caco-2 hücre prosedürlerini eğitmen Ishita Chatterjee ve grubumuzdan doktora sonrası araştırmacı Anoop Kumar gösterecektir. Fare ileumundan seromusküler tabakanın soyulmasını ise laboratuvarımdan kıdemli araştırma uzmanı Sangeeta Tyagi gösterecektir.

Sıyırılmış mukozanın yerleştirilmesini ve Ussing odalarına yerleştirilmesini ayrıca laboratuvarımdan eğitmenler Shubha Priyamvada ve Arivarasu Natarajan gösterecektir. Başlamak için, büyüme faktörü azaltılmış jelatinöz protein solüsyonunu bir dört derece Celsius buzdolabında, buz üzerinde gece boyunca çözdürün. Çözüldükten sonra, bir mililitrelik veya 500 mikrolitrelik alikotlar hazırlayın.

Kültür gününde, odacıklı lamları buz üzerinde ön soğutmaya tabi tutun. Ardından, sekiz odacıklı cam lamın her bir kuyucuğuna 30 µL jelatinöz protein çözeltisi ekleyin ve eşit şekilde yayın. Jelatinöz karışım odacıklı lama veya plakalara yerleştirilirken, hücrelerin ayrılmasına neden olabileceği için kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat edilmelidir.

Çözeltinin katılaşması için kültür kabını 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 15 ila 30 dakika bekletin. Ardından, tripsin kullanarak konfluen Caco-2 hücrelerini kültür balonundan ayırın. Daha sonra, hücreleri bir hemositometre ile sayın ve 4 °C'de, 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

İstenen yoğunlukta bir süspansiyon elde etmek için oluşan hücre peletini 3D Caco-2 ortamında tekrar süspande edin. Hazırlanan hücre süspansiyonunu kullanarak, cam oda lamlarının her kuyucuğuna 4.000 hücre ekleyin ve bunları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 12 ila 14 gün boyunca büyümeye bırakın. Hücreleri boyamak için önce ortamı aspire edin ve hücreleri 400 µL %2 PFA ile fikse edin.

Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sabitlemeye devam edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, PBS içindeki %0.5 Triton çözeltisi ile 15 dakikayı geçmeyecek şekilde permeabilize edin. Hücreleri PBS glisin tamponu ile iki kez durulayın ve ardından permeabilize edilmiş hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca IF tamponu ile yıkayın.

Hücreleri IF tamponu içindeki %5 normal keçi serumu ile bloke edin. Ardından, hücreleri %1 keçi serumu ile desteklenmiş IF tamponunda seyreltilmiş 200 microliters primer antikor ile oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyon sonrası hücreleri IF tamponu ile üç kez yıkayın.

Yıkanmış hücreleri, %1 keçi serumu ile desteklenmiş IF tamponunda seyreltilmiş 200 microliters sekonder antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri IF tamponu ile onar dakika boyunca üç kez yıkayın. Cam lam üzerindeki hazneyi ayırmak için önce lamı lam taban tutucusuna yerleştirin, ardından beyaz kaldırıcıyı kuyucukların kenarına temas edene kadar tutucunun içinden kaydırın.

Hazneyi lamdan çıkarmak için hafifçe çekin. Lamları ışıktan korumak için kapalı siyah bir kutu kullanın. Lamları yavaş kuruyan anti-fade ortamı ile hazırlayın ve üzerlerini lamel ile kapatın.

Lamların oda sıcaklığında on dakika boyunca kurumasına izin verdikten sonra, görüntüleme öncesinde oje ile mühürleyin. Metin protokolünde açıklanan prosedürü izleyerek fare ileumunu izole edin. Ardından, makas kullanarak bağırsağı boylamsal olarak açın.

Elde edilen doku kesitini, bir mikromolar indometasin içeren buz gibi soğuk gazlanmış KBR tamponunda on dakika inkübe edin. Yaklaşık bir santimetre uzunluğundaki bağırsak kesitini, mukozal tarafı aşağı gelecek şekilde, 0,5 santimetre kalınlığında %7 agaroz veya kürlenmiş silikon elastomer içeren bir plakaya iğneleyin. Alttan aydınlatmalı bir diseksiyon stereo mikroskobu kullanarak seromüsküler tabakaları soyun.

Ardından, seromüsküler tabakayı tüy bistüri ucuyla kesin. Bağırsağın uzunlamasına ekseni boyunca tabakanın kenarını kaldırmak için ince pens kullanın. Son olarak, mukozayı dikkatlice sürgünün pinlerine sabitleyin.

Yırtılmayı önlemek için soyulmuş mukoza dokusunu kenarlarından tutun. Soyulmuş ileal mukoza sürgünün pinlerine sabitlenirken, dokunun pin başlarında yırtılmasını önlemek ve doku kenarlarının zarar görmesini en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Doku işleminden önce, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile gazlanmış Krebs solüsyonu hazırlayın.

Ardından, çözeltiyi bir Ussing kamarasına boşaltın. Enerji substratı olarak serozal banyoya 10 µM glukoz ve osmotik dengeyi korumak için mukozal banyoya 10 µM mannitol ekleyin. Sonrasında, dokunun hem apikal hem de bazolateral yüzeylerini Krebs çözeltisine maruz bırakmak için, monte edilmiş mukozayı içeren sürgüyü kamaraya yerleştirin.

İleal dokuyu banyoda on dakika boyunca dengeleyin. Ardından, mukozal-serozal akışın ölçümü için apikal tarafı 10 µM fluoksetin ile 30 dakika boyunca ön işlemden geçirin. Son olarak, dokunun bazolateral tarafını 10 ng/mL TGF beta 1 ile bir saat boyunca muamele edin ve ardından apikal tarafı 20 nM trityumlu 5-HT ile 30 dakika inkübe edin.

Mukozadan serozaya akış hızlarını hesaplamak için, mukoza boyunca hidrostatik basınç farklarını önlemek amacıyla serozal rezervuardan 0,75 milliliter alikotlar toplayın ve bunları aynı hacimde banyo ortamı ile değiştirin. Dokuda biriken tritiyum işaretli 5-HT'yi miktarlandırmak için mukozayı sürgülerden çıkarın. Bir kez buz gibi soğuk KRB tamponu ile yıkayın ve bir cam kültür tüpüne yerleştirin.

Dokuyu liz etmek için mukozayı 0,5 milliliters 10%KOH içerisinde 37 degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ardından, lizatların 150 microliter'lik alikotlarındaki radyoaktiviteyi bir sıvı sintilasyon sayacı kullanarak üç tekrarlı olarak ölçün. Bradford yöntemini kullanarak lizatların üç ila beş microliter'lik alikotlarındaki protein konsantrasyonunu ölçün.

Burada, aktin için boyanmış 3D kültürde büyütülen Caco-2 kistleri ve aktin, çekirdekler ve SERT proteini için eş zamanlı olarak boyanmış Caco-2 3D kistleri gösterilmektedir. SERT, lüminal membran ve subapikal kompartmanlarda görülmektedir. Caco-2 3D kürelerin 2D Caco-2 monotabakalara göre avantajını daha fazla doğrulamak için SERT protein ekspresyonunun western blot analizi gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar, Caco-2 3D kürelerinde SERT protein ekspresyonunun 2D Caco-2 hücrelerine kıyasla arttığını göstermiştir. Son olarak, TGF beta'nın mukozadan serozaya olan akışı artırdığını göstermek için bir Ussing odası sistemi kullanılmıştır; bu durum, luminal membrandan artan 5-HT alımını ve ileal mukozada gözlenen artmış 5-HT akümülasyonunu yansıtmaktadır. Bu bulgular, luminal membrandaki SERT ekspresyonuna karşılık gelen, 5-HT alımının fluoksetin tedavisine karşı gözlenen duyarlılığı ile desteklenmektedir.

Bu ileal mukoza soyma ve yerleştirme tekniği, uzmanlaşıldığında 15 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hayvan vücudundan çıkarılan ekstratintestinal preparasyonun sınırlı bir canlılığa sahip olduğu ve bu sürenin üç saate kadar çıkabileceği unutulmamalıdır. 3D Caco-2 kistleri; membran trafiği olayları, gen ekspresyonu veya epitelyal taşıyıcıların protein-protein etkileşimi gibi çeşitli çalışmalarda kullanılabilir.

Geliştirilmesinin ardından 3D Caco-2 tekniği, bağırsak transportu alanındaki araştırmacıların sıvı hareketlerini keşfetmelerinin ve bağırsak hastalıklarının patofizyolojisini incelemelerinin önünü açmaktadır. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve KKD kullanımı ile uygun dekontaminasyon prosedürleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, Caco-2 hücrelerini 3D kültürlerde yetiştirebilecek ve bu kültürleri epitelyal taşıyıcı ekspresyonunu araştırmak için kullanabileceksiniz.

Ayrıca, yerli fare bağırsağındaki serotonin taşıma fonksiyonunu incelemek için Ussing odasını kullanabileceksiniz.