Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

Bu protokolün genel amacı, bağırsak Caco-2 hücrelerini üç boyutta büyütmek ve serotonin taşıyıcı regülasyonu ile ilgili çalışmalarda Ussing odasının kullanımını göstermektir. Burada gösterilen yöntemler, bağırsak serotonin taşıyıcısı SERT'in nasıl düzenlendiği gibi epitel taşıma alanındaki temel sorulara cevap verebilir. 3D Caco-2'nin ana avantajı, hücreden hücreye ve hücreden hücre dışı matris etkileşimlerini tek katmanlardan daha doğru bir şekilde yansıtmalarıdır.

Ve Ussing odası tekniği, bağırsak epitelinde taşıma fonksiyonunun hassas ölçümlerini sağlar. 3D'nin anlamı, Caco kültürleri, terapötiklerin keşfine kadar uzanır, çünkü bu modeller, değişmiş taşıma fonksiyonu ile ilişkili hastalıklara karşı ajanların taranmasını sağlar. Bu yöntem serotonin taşıyıcı regülasyonu hakkında bilgi sağlasa da, sodyum ve klorür gibi diğer elektrolit taşıyıcılarının çalışmalarına da uygulanabilir.

Bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü seromüsküler tabakanın sıyrılması ve bağırsak mukozasının Ussing odalarına monte edilmesinin öğrenilmesi zordur. 3D Caco-2 hücre prosedürlerini göstermek, eğitmen Ishita Chatterjee ve grubumuzdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Anoop Kumar olacak. Seromüsküler tabakanın fare ileumundan sıyrılmasını göstermek, laboratuvarımdan kıdemli bir araştırma uzmanı olan Sangeeta Tyagi olacak.

Ayrıca, soyulmuş mukozanın montajını ve bunları Ussing odalarına yerleştirmeyi gösterenler, laboratuvarımdan eğitmenler olan Shubha Priyamvada ve Arivarasu Natarajan olacak. Başlamak için, büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi protein çözeltisini gece boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabında buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra bir mililitre veya 500 mikrolitre alikot hazırlayın.

Kültür gününde, odacıklı slaytları buz üzerinde önceden soğutun. Daha sonra, sekiz kuyucuklu cam sürgünün her bir oyuğuna 30 mikrolitre jelatinimsi protein çözeltisi ekleyin ve eşit şekilde yayın. Jelatinli karışımı hazne sürgüsü veya plakalar içinde kaplarken, hücreler ayrılabileceğinden kabarcık oluşumunu önlemek için özen gösterilmelidir.

Çözeltinin katılaşmasını sağlamak için kültürlenmiş kabı 37 derece Santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne 15 ila 30 dakika yerleştirin. Daha sonra, tripsin kullanarak, birleşen Caco-2 hücrelerini bir kültür şişesinden ayırın. Daha sonra, hücreleri bir hemositometrede sayın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 500 kez g'de santrifüjleyin.

İstenilen yoğunluğun süspansiyonunu elde etmek için elde edilen hücre peletini 3D Caco-2 ortamında yeniden süspanse edin. Hazırlanan hücre süspansiyonunu kullanarak, cam hazne kayar. Hücreleri boyamak için önce ortamı aspire edin ve hücreleri 400 mikrolitre% 2 PFA ile sabitleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitlemeye devam edin. Hücreleri PBS'de iki kez yıkadıktan sonra, PBS'de% 0.5 Triton çözeltisi ile 15 dakikadan fazla olmamak üzere geçirgen hale getirin. Hücreleri PBS glisin tamponunda iki kez durulayın ve ardından geçirgen hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca IF tamponunda yıkayın.

IF tamponunda% 5 normal keçi serumu kullanarak hücreleri bloke edin. Daha sonra, hücreleri% 1 keçi serumu ile desteklenmiş IF tamponunda seyreltilmiş 200 mikrolitre birincil antikor ile oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri IF tamponu ile üç kez yıkayın.

Yıkanmış hücreleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca% 1 keçi serumu ile desteklenmiş IF tamponunda seyreltilmiş 200 mikrolitre ikincil antikor ile inkübe edin. Hücreleri IF tamponu ile on dakika boyunca üç kez yıkayın. Cam sürgü haznesini çıkarmak için, önce sürgüyü sürgü tabanı tutucusuna yerleştirin, ardından beyaz kaldırıcıyı kuyuların kenarına temas edene kadar tutucunun içinden kaydırın.

Kaydıraktan çıkarmak için hazneyi yavaşça çekin. Slaytları ışıktan korumak için kapalı bir kara kutu kullanın. Slaytları yavaş solma önleyici ortam ile monte edin ve üzerlerini kapak fişleri ile örtün.

Slaytların oda sıcaklığında on dakika kurumasına izin verdikten sonra, görüntülemeden önce oje ile kapatın. Metin protokolünde açıklanan prosedürü izleyerek fare ileumunu izole edin. Daha sonra makas kullanarak bağırsağı uzunlamasına açın.

Elde edilen doku bölümünü, bir mikromolar indometazin içeren buz gibi soğuk gaz KBR tamponunda on dakika inkübe edin. Yaklaşık bir santimetre uzunluğundaki bağırsak bölümünü, mukozal tarafı aşağı bakacak şekilde, 0,5 santimetre kalınlığında% 7 agaroz veya kürlenmiş silikon elastomer içeren bir plakaya sabitleyin. Alttan aydınlatmalı bir diseksiyon stereo mikroskobu kullanarak seromüsküler tabakaları soyun.

Ardından, serokas tabakasını tüylü bir neşter bıçağıyla kesin. Katmanın kenarını bağırsağın uzunlamasına ekseni boyunca kaldırmak için ince forseps kullanın. Son olarak, mukozayı kaydırıcının pimlerine dikkatlice monte edin.

Yırtılmayı önlemek için soyulmuş mukozal dokuyu kenarlarından tutun. Soyulmuş ilial mukoza sürgü pimlerine monte edilirken, toplu iğne başlarındaki dokunun yırtılmasını önlemek ve doku kenarlarının zarar görmesini en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Doku tedavisinden önce,% 95 oksijen,% 5 karbondioksit ile gazlanmış Krebs çözeltisini hazırlayın.

Ardından, çözeltiyi bir Ussing odasına dökün. Serozal banyoya enerji substratı olarak 10 mikromolar glikoz ve mukozal banyoya ozmotik dengeyi korumak için 10 mikromolar mannitol ekleyin. Daha sonra, dokunun hem apikal hem de bazolateral taraflarını Krebs çözeltisine maruz bırakmak için kaydırıcıyı monte edilmiş mukoza ile hazneye yerleştirin.

Banyodaki ileal dokuyu on dakika boyunca dengeleyin. Daha sonra, mukozal-serozal akının ölçümü için apikal tarafı 30 dakika boyunca 10 mikromolar fluoksetin ile ön işlemden geçirin. Sonuç olarak, dokunun bazolateral tarafını bir saat boyunca mililitre TGF beta 1 başına 10 nanogram ile tedavi edin ve daha sonra apikal tarafı 30 dakika boyunca 20 nanomolar tritiye 5-HT ile inkübe edin.

Mukozal-serozal akı oranlarını hesaplamak için, serozal rezervuardan 0.75 mililitre alikot toplayın ve mukoza boyunca hidrostatik basınç farklılıklarını önlemek için bunları aynı hacimlerde banyo ortamıyla değiştirin. Dokuda biriken tritiye 5-HT'yi ölçmek için, mukozayı kaydırıcıdan çıkarın. Buz gibi soğuk KRB tamponu ile bir kez yıkayın ve bir cam kültür tüpüne yerleştirin.

Dokuyu parçalamak için mukozayı gece boyunca 37 santigrat derecede 0.5 mililitre% 10 KOH içinde inkübe edin. Daha sonra, bir sıvı sintilasyon sayacı kullanarak lizatların 150 mikrolitrelik alikotlarındaki radyoaktiviteyi üç kopya halinde ölçün. Bradford yöntemini kullanarak, lizatların üç ila beş mikrolitrelik alikotlarındaki protein konsantrasyonunu ölçün.

Burada aktin için boyanmış 3 boyutlu kültürde büyütülmüş Caco-2 kistleri ve aktin, çekirdek ve SERT proteini için aynı anda boyanmış Caco-2 3 boyutlu kistler gösterilmiştir. SERT, luminal membranda ve subapikal bölmelerde görülebilir. Caco-2 3D kürelerin 2D Caco-2 tek katmanlarına göre avantajını daha da doğrulamak için, SERT protein ekspresyonunun western blot analizi yapıldı.

Sonuçlar, 2D Caco-2 hücrelerine kıyasla Caco-2 3D kürelerde SERT proteininin gelişmiş ekspresyonunu gösterdi. Son olarak, TGF beta'nın mukozalden serozal akıya yükseldiğini göstermek için bir Ussing odası sistemi kullanıldı, bu da luminal membrandan artan 5-HT alımını ve ileal mukozada gözlenen artmış 5-HT birikimini yansıtıyor. Bu tür bulgular, luminal membran üzerindeki SERT ekspresyonuna karşılık gelen fluoksetin tedavisine 5-HT alımının gözlenen duyarlılığı ile desteklenmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, ileal mukozanın sıyrılması ve monte edilmesi tekniği 15 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü benimserken, hayvandan çıkarıldıktan sonra, ekstravio bağırsak hazırlığının sınırlı canlılığa sahip olduğunu ve üç saate kadar sürebileceğini hatırlamak önemlidir. 3D Caco-2 kistleri, membran kaçakçılığı olayları, gen ekspresyonu veya epitel taşıyıcılarının protein-protein etkileşimi gibi çeşitli çalışmalar için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, 3D Caco-2 tekniği, bağırsak taşımacılığı alanındaki araştırmacıların sıvı hareketini keşfetmeleri ve darial hastalıkların patofizyolojisini incelemeleri için yol açmaktadır. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve KKD kullanımı ve uygun dekontaminasyon prosedürleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, Caco-2 hücrelerini 3D kültürlerde büyütebilecek ve bu kültürleri epitelyal taşıyıcı ekspresyonunu araştırmak için kullanabileceksiniz.

Ayrıca, doğal fare bağırsağındaki serotonin taşıma işlevini incelemek için Ussing odasını da kullanabileceksiniz.