IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, 3D in vitro bazal matris gömülü bağırsak organoidlerini izole etmek ve daha sonra mikrotübülleri ve sentro organoidleri sabitlemek ve immüno-etiketlemektir proteins. 3D in vitro organoidler, hücre ve gelişim biyolojisindeki temel biyolojik soruları incelemek için ideal modellerdir. Ancak endojen proteinleri ve yapıları 3D modellerde lokalize etmek, 2D kültürlerden daha karmaşıktır.

Daha da önemlisi, fiksatifin hassas 3D mimariyi koruması ve aynı zamanda antikor antijenisitesini koruması gerekir. Sunulan yöntemler arasında 3 boyutlu bir in vitro bağırsak organoidlerinin izolasyonu, fiksasyonu ve immünoblokingi yer alır. Ancak fiksasyon ve immünoetiketleme protokolleri ex vivo izole edilmiş dokularda da kullanılabilir.

Sunulan formaldehit metanol fiksasyon protokolünün temel avantajı, 3D yapıları korurken aynı zamanda antijenikliği de korumasıdır. Mikrotübüllerin, aktin filamentlerinin ve bağlayıcı proteinlerin ve dokuz dahil olmak üzere birkaç sentrosomal proteinin etkili bir şekilde etiketlenmesi için sabit tetral antikorların iyi bir şekilde penetrasyonunu ve temizlenmesini sağlar. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda resmi bir doktora sonrası araştırmacı olan doktor Deborah Goldspink ve ortak yazar olan doktor Zoe Matthews olacak.

Bağırsak kriptleri ve villusların izolasyonunu takiben, izole epitel yapıları immün boyama için sabitlenebilir. İzole edilmiş kriptler dönüşümlü olarak matris kubbelerine oturtulabilir ve bu da daha sonra organoidler oluşturacaktır. Yaklaşık beş ila yedi günlük inkübasyondan sonra organoidler oluşmuş olacaktır.

Bodrum matris kubbelerini içeren kuyuları organoidlerle yıkamak için 500 mikrolitre RT-PBS kullanın. Ardından, her kuyucuğa 250 mikrolitre soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Ardından, bir P1000 mikropipet kullanarak, bodrum matris kubbelerini kazıyın ve bodrum matrisini plastikten ayırmak ve çıkarmak için kuyu boyunca dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.

Matrisi parçalamaya yardımcı olmak için geri kazanım solüsyonunun soğuk olduğundan emin olun. Kazıma yaparken, organoidleri parçalamamak ve bozulmadan kalmalarını sağlamak için yalnızca bir P1000 mikropipet kullanın. Süpernatanı 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.

Daha sonra, tüpü birkaç kez ters çevirin ve organoidlerin izole edildiğini, serbest hareket ettiğini ve kümeler halinde olmadığını 50 kat büyütme ile mikroskop altında kontrol edin. Organoidleri 1.000 g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, geri kazanım reaktifini çıkarın ve hemen fiksasyona devam edin.

Önceden izole edilmiş organoidleri formaldehit ve metanol ile sabitlemek için, organoidleri negatif 20 santigrat derece formaldehit metanol fiksatif çözeltisinde yeniden süspanse edin. Organoidleri eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda 15 dakika inkübe edin ve tüpü her beş dakikada bir ters çevirin. Daha sonra, organoidleri beş dakika boyunca 1.000 g'da santrifüjleme ile peletleyin.

Fiksatifi çıkarın ve ardından% 1 ikincil antikor türleri serumu içeren PBS veya% 0.1 deterjan ve% 1 serum içeren PBS'den oluşan yıkama solüsyonunu ekleyin. Numuneyi daha önce olduğu gibi peletledikten sonra, yıkama solüsyonunu çıkarın ve numuneyi taze yıkama solüsyonunda tekrar süspanse edin. Hücreleri toplam bir saat boyunca yıkamak için bir tüp döndürücü kullanın, organoidleri her 15 dakikada bir santrifüjleme ile peletleyin ve yıkama solüsyonunu değiştirin.

Bağırsak organoid örneklerini bloke etmek için, PBS'ye% 10 ikincil antikor türleri serumu ekleyin. Organoidleri beş dakika boyunca 1.000 g'da pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın. Farklı antikorlarda inkübe edilecek her numuneye bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin.

Daha sonra, numuneleri ve bloke edici çözeltiyi oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde bir saat inkübe edin. Daha sonra,% 10 serum ve% 0.1 deterjan içeren PBS'deki birincil antikorları seyreltin. Daha sonra, numuneleri döndürdükten ve bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, organoid peletini yeniden süspanse etmek için birincil antikor çözeltisini kullanın.

Organoidleri süspansiyonda tutmak için tüpleri gece boyunca 20 RPM ve dört santigrat derecede döndürün. Ertesi gün, numuneleri bir saat boyunca tüp döndürücüde oda sıcaklığına geri getirin. Numuneyi döndürdükten sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın, her tüpe bir mililitre yıkama çözeltisi ekleyin ve organoid peletleri yeniden süspanse edin.

Ardından, çözeltiyi hemen santrifüjleme ile çıkarın. Bir mililitre taze yıkama solüsyonu ekleyin ve hücreleri iki saat boyunca 20 RPM'de bir tüp döndürücüde karıştırın. Daha sonra, PBS'deki ikincil antikorları% 1 serum ve% 0.1 deterjanla seyreltin.

Daha sonra, dokuyu peletledikten sonra, peletleri 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Tüpleri bir tüp döndürücü üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Süpernatanı döndürdükten ve çıkardıktan sonra, peleti yıkama solüsyonunda yeniden süspanse edin ve organoidleri peletlemek için numuneleri hemen santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre taze yıkama solüsyonunda yeniden süspanse edin. Numuneleri oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde 1,5 ila iki saat karıştırın ve yıkama solüsyonunu daha önce açıklandığı gibi her 20 ila 30 dakikada bir değiştirin. Organoidleri monte etmek için, tüm yıkama solüsyonunu döndürdükten ve çıkardıktan sonra, pelete antifade reaktifi ile iki damla sert sertleşen montaj ortamı ekleyin.

Bir P200 mikropipetinin ucunu kesin ve peleti montaj ortamında dikkatlice yeniden süspanse edin. Sabit ve lekeli organoidleri montaj ortamında yeniden süspanse ederken, herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin. Kabarcıklar varsa, yüzeye çıkmalarına izin verin ve ardından bunları slayta aktarmaktan kaçının.

Organoidleri montaj ortamıyla birlikte bir mikroskop lamının merkezi boyunca bir çizgi halinde dağıtmak için mikropipeti kullanın. Ardından, üstüne dikkatlice bir kapak camı yerleştirin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Cam slaytı bir slayt kitabına yerleştirin ve konfokal bir mikroskopta analiz etmeden önce montaj ortamının sertleşmesi için bir gece buzdolabında saklayın.

Burada, hem villus hem de kriptleri içeren izole edilmiş ince bağırsak dokusunun ikinci fraksiyonundan görüntüler ve esas olarak kriptleri içeren üçüncü fraksiyondan bir örnek gösterilmektedir. Bu görüntülerde görüldüğü gibi, bu videoda açıklanan formaldehit metanol fiksasyonu ve immünokinoklama protokolü ile hem villuslarda hem de kriptlerde mikrotübüllerin ve aktinin iyi bir şekilde korunması ve etiketlenmesi sağlanmıştır. İnce bağırsak organoidleri, üç hafta veya daha uzun süre bodrum matrisinde üretildi ve büyütüldü, daha sonra bu videoda gösterildiği gibi izole edildi.

Organoid villus alanları içindeki farklılaşmış hücreler, çoğu durumda iyi etiketlenmiş stabil apikobazal mikrotübüller içerir. EB1 ayrıca mikrotübül kafesi boyunca da görülebilir. Burada gösterilen, kist aşamasında ve kript gelişiminin erken bir aşamasında olan bir organoiddir.

Her iki numune de formaldehit metanol içine sabitlendi ve mikrotübüller ve dokuzlar için immüno-etiketli hale getirildi, bu da apikal sentrosomal olmayan mikrotübül düzenleme merkezlerinde iyi mikrotübül koruması ve etiketlemesi gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birden fazla örnekle ve iki gün boyunca gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, 3D yapılarını bozmamak için organoidleri toplarken kuyuları dikkatlice kazımak önemlidir.

Ayrıca, boyama prosedürü boyunca organoid kaybını önlemek için solüsyon eklerken veya çıkarırken dikkatli olun. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş organoidleri ve bağırsak kriptleri gibi diğer epitel yapılarını nasıl düzelteceğinizi, immüno-etiketleyeceğinizi ve monte edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürde çalışan fiksatif reaktiflerin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedürün risk değerlendirmeleri yapılmalı ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman uygun muhafaza önlemleri ve KKD alınmalıdır.