Name: IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin bağırsak organoidlerinde mikrotübül ve sentrozomal proteinleri immünoetiketleme yöntemlerini. Formaldehit metanol fiksasyonu ile 3D yapıları koruyarak hücre ve gelişim biyolojisi araştırmaları için etkili protokoller sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Paul Thomas mikroskop tavsiye ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser burada yer BBSRC tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. M.M.M. ve tw bb/J009040/1).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Yalıtım bağırsak dokusu Yalıtım küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon kriptalarının Mukozal yüzeyin hücre kişiler, (sallama) ayırma ve Santrifüjü gevşetmek için EDTA çözüm ile tedavi maruz içerir. Sunulan bağırsak villus/crypt yalıtım Protokolü Belshaw vd ve Whitehead ve ark. değiştirildi. 17 , 18
Mukozal yüzey açığa Bu yordamı gelişiminde bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için yaklaşımlar bir dizi ile tecrübe var. (Ters dönüş) çıkar için klasik bir yaklaşımdır tüpte kesimleri 100 mm uzunluğunda, genelde doku katlayin bir ucunu ve sonra kalan tüp yakalanmış bir metal çubuk kullanarak üzerinde tüp19kaydırdı. Yuvarlatılmış uçları ile metal bir çubuk (2.4 mm çap) fare doku için idealdir. Bu yaklaşım PBS ve EDTA daha iyi erişim sağlayan Mukozal yüzeyin genişleyen yararı vardır. Başlangıçta bu yaklaşım kullanılan ama tüp kesme kısa uzunlukta parçalara (yaklaşık 5 cm) ve bu daha kolay ispat olarak makas diseksiyon ile her bölümünde açmak için taşındı. Eğer sadece birkaç bağırsak gereklidir bu uygun bir yaklaşımdır; Ama eğer daha fazla hayvan were to be bir denemede sonra amaca uygun yapılmış bir aygıt kesme için tüp boyuna, Yoneda ve ark. tarafından açıklandığı gibi kullanılan aç 14 daha verimli olacaktır.
Dekolmanı villus ve kas katmanından kriptalarının Başlangıçta 3 mM EDTA PBS ve nispeten uzun bir kuluçka zamanlarında 60 dakikaya kadar temel doku17,18Mukozal yüzeyden gevşetmek için kullanılır. Bu konsantrasyon EDTA bir kuluçka süresi 30 dk kriptalarının fare iki nokta üstüste gelen gevşetmek yeterli buldum. Ancak, ince bağırsak crypt/villus yalıtım için verimli bir yaklaşım olduğunu kanıtladı daha kısa bir süre daha yoğun EDTA kullanarak çalıştı. Tüm sonraki çalışma ile ilgili bölümler için villus veya kriptalarının üreten 30 mM EDTA tekniği kullanarak çıkarılan doku yapılmıştır. Kriptalarının, biz normalde havuza alınmış kesirler 3-5 düzeltmeden önce ama zamanlamaları bağlı olacaktır gibi bir dizi faktöre bağırsak boyunca konum gibi fare, iltihap, önceki diyet yaş üzerinde bu uygun kesirler vardır olup olmadığını kontrol etmek önemlidir , vb benzer şekilde, farklı koşullar altında doku etkili olabilmesi için EDTA tedavi sarsılmış gereken süreyi değişebilir. İzole doku kesirler villus kriptalarının veya özellikle de villus veya kriptalarının (Şekil 2) bir karışımı içeren sonucudur. 30 için tüp doku sallayarak, üst üste hiçbir villus olarak crypt ayıklama tek adımda ulaşılabilir olabilir s. Bu kesirler sabit ve immün etiketleme için işlenir.
Bağırsak organoids Bodrum matris işlemleri olan Organoids Bodrum matris kubbeler üzerinden işlemleri olan hücre kurtarma çözümü kullanarak elde edilebilir. Genellikle bodrum matris ama sıcaklık 2-8 ° c olması gereken depolymerizing tarafından çözüm çalışır Dikkatli bir not dinamik mikrotübüller korunmuş olduğunu. Böylece, dinamik mikrotübüller, immün etiketleme için ve + EBs hücre gibi ipuçları, Bodrum matris fiksasyon önce kurtarma önerilmez. Ancak, mikrotübüller ayırt organoid hücrelerdeki çoğu nispeten istikrarlı ve bunlar (şekil 6) korunduğu görülmüştür. Aynı zamanda iyi IMMUNO-etiketleme için centrosomal ve bileske proteinler hem de hücre işaretleri çalıştı.
Fiksasyon protokolleri Formaldehit (PFA taze yapılmış) tersinir oluşturur bir nispeten hızlı etkili sabitleştirici çapraz bağlantılar ve % 4 İngiltere'de yılın örnekte mikrotübüller IMMUNO-etiketleme ve gama-tübülin ve Phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Daha İngiltere'de yılın çözümleri gibi İngiltere'de yılın daha yüksek konsantrasyonlarda işe yaramadı iken IMMUNO-Örneğin, etiketleme için iyi ile crypt kök hücre niş içinde kök hücre işaretçileri Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici CD24 çalıştı % 1 oranında seyreltin.
Oxazolidin ilavesi mikrotübüller ve %3.7 PFA, %0.05 oxazolidin ve % 0,5 deterjan PHEMO arabellek (68 mM borular, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA ve 3 mM MgCl2)2 karışımından oluşan sözde PHEMO fiksasyon daha iyi korunması verir mükemmel mikrotübüller korunması antigenicity ödün verir. Bu da IMMUNO-etiketleme gama-tübülin, β-catenin ve E-cadherin ve phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Ancak, 3D doku ve organoid kültürleri, PHEMO fiksasyon tutarsız sonuçlar üretti ve bu nedenle kullanılmamıştır.
Metanol nispeten iyi penetrasyon verir ve antigenicity korumak eğilimi bir koagulant sabitleştirici var. Fiksasyon % 100 metanol (-20 ° C) ile bazı büzülme tanıtır, ılımlı Morfoloji koruma sağlayan ve mikrotübüller, + ipuçları ve ninein 2D hücre kültürlerinde dahil olmak üzere birçok centrosomal antikorlar için çalışır. Ancak, bazı organoids bu fiksasyon yöntemi kullanarak zaman çöktü. Buna ek olarak, tüm kriptalarının, villus veya organoids antikorların penetrasyon başlangıçta bir sorun olduğunu biliyorum ama % 0,1 deterjan yıkama çözüm ve uzun süreli çamaşır ilavesi daha iyi sonuçlar elde.
Formaldehit ve metanol bir kombinasyonu daha önce Rogers ve ark. tarafından kullanılmaya başlanmış 20 IMMUNO-etiket EB1 için Drosophila. Formaldehit bir karışımı bir fiksasyon protokolüne dayalı ve metanol bu nedenle bağırsak dokusu-20 ° C soğuk ama 5 mM Sodyum karbonat Rogers tarafından kullanılan karışım üzerinden atlama % 3 formaldehit ve % 97'si metanol dayalı organoids için geliştirilmiş ve ark. 20 -20 ° C'de dondurucuda Ayrıca, örnekleri düzeltildi Bu amele özellikle immün etiketleme için iyi + ipuçları, küçük-170 ve EBs gibi ama aynı zamanda sabitleme ve immün etiketleme mikrotübüller ve aktin içinde doku ve 3D organoids için mükemmel oldu. Çok iyi Yapısal koruma belirgin ve ninein için etiketleme daha tutarlı bir şekilde metanol ile çalışabiliyordu antigenicity gama-tübülin ve ninein, gibi centrosomal proteinler yanı sıra birkaç hücre iskeleti ve ilişkili proteinler için korundu fiksasyon.

Epiteli ile apico Bazal polarite oluşumu geliştirmede temel bir süreçtir ve mikrotübüller ve centrosomal proteinlerinin dramatik bir yeniden yapılanma içerir. Merkezi bir konumda bulunan bir centrosomal Mikrotubul Merkezi düzenleme yayılan (MTOC) birçok hayvan hücrelerinde belirgin ve bu nispeten düz hücreler için de uygun bir Radyal Mikrotubul dizi. Buna ek olarak, bu bağırsak gibi yassı epitel hücreleri daha iyi şekil ve bu hücrelerin özel işlevlerini destek olmayan Radyal transcellular Mikrotubul diziler topla. Bu dramatik yeniden düzenleme-in mikrotübüller transcellular mikrotübüller1,2 anchorage için sorumlu olur centrosome tepe ve şekillendirme, apikal centrosomal MTOCs (n-MTOCs) hareket elde edilir , 3 , 4 , 5.
Epitel farklılaşma ve ilişkili Mikrotubul yeniden yapılanma ile ilgili bilgilerimizi çoğunu yapmak değil göstermek içinde vivo doku mimari 2D vitro hücre katmanları araştırmalar geldi. Taklit ediyorlar vivo içinde mimari ve geliştirme gibi geliştirme Clevers ve iş arkadaşları6tarafından öncülük 3D vitro organoid kültürlerin büyük bir teknolojik ilerleme temsil eder. Epitel farklılaşma hiyerarşisini bağırsaklarda belirgindir; kök hücre alt kriptalarının olgunlaşmamış transit çoğalırlar ve nereye onlar tamamen önce ayrıştırılan haline crypt küçük bağırsak villus veya kolon yüzey üzerine kadar göç gibi yavaş yavaş ayırt hücreleri yükseltecek ortaya çıkmasına Lümen7dökmek. Önemlisi, bu bağırsak organoids nerede kök hücre niş hücrelerden daha sonra alt ve kist bölge doğru yavaş yavaş ilerliyor farklılaşma kök hücreleriyle crypt benzeri tomurcukları oluşturmak şekillendirme kistler prolifere olarak çoğaltılır, hangi villus benzeri8olur. Bağırsak organoid, bu nedenle sadece Mikrotubul ve epitel farklılaşma ama çok sayıda diğer proteinler yanı sıra ilaç ve gıda ile taranması için ideal bir platform sağlayan sırasında centrosomal yeniden yapılanma çalışması için güçlü bir modelini temsil bileşikler potansiyel terapötik yararları9,10.
Organoids canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur ve her ikisi de Tak- ve knock-out organoids CRISPR/Cas9 gen11,12düzenleme kullanarak oluşturulabilir. Ancak, ifade ve yerelleştirme belirlenmesi için endojen proteinlerin kurulması özellikle tagged proteinler davranışını doğrulamak önemlidir. 3D organoids IMMUNO-etiketleme Bodrum matris veya izole ex vivo yetiştirilen kültür yemekleri 2D yetiştirilen hücrelerin daha karmaşık dokudur. Fiksasyon iletişim kuralı hala antikor antigenicity (Yani, antikorlar bağlama epitopları) koruyarak organoids hassas 3D mimari korumak gerekiyor. Örneğin, % 4 paraformaldehyde (PFA) genellikle bir sabitleştirici kullanılır ama nispeten hızlı oyunculuk sabitleştirici ve iyi morfolojik koruma verir iken, bizim deneyim sık antigenicity kaybolmasına ve çoğu için uygun değildir centrosomal antikor. 3D yapılar ve doku nüfuz yeteneği sabitleştirici ve antikorlar da düşünülmelidir. Bu amaçla, biz değiştirdiniz ve doku yalıtım ve dolaylı IMMUNO-3D vitro organoids ve ex vivo etiketleme için gelişmiş protokoller bağırsak dokusu izole. Biz küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon doku izole etmek ve 3D organoids yalıtım sabitleme ve IMMUNO-etiketleme Bodrum matris içinde alternatif olarak için bir iletişim kuralı eklemek nasıl açıklar. Biz üç alternatif fiksasyon Protokolü IMMUNO mikrotübüller ve centrosomal proteinler, ninein gibi ve Mikrotubul artı uç izleme proteinler (+ ipuçları), (Ayrıca başvurular8, bkz: EB proteinler ve CLIP-170 gibi etiketleme için mevcut 13). Biz de artılarını ve eksilerini her iletişim kuralıyla ilişkili tartışıyorlar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>yıkama ve PFA</td></tr><tr><td>Hücre Geri Kazanım Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>organoidleri izole</td></tr> etmek <tr><td>lobind mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>hücrelerin yapışmasını önler</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA çözeltisi, pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Kript izolasyonu</td></tr><tr><td>70 &mu; m hücreli süzgeç</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Villuslardan kriptleri izole</td></tr> edin <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>deterjan</td></tr><tr><td>keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>bloke edici ajan</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yapışmaz ajan olarak kullanılan</td> <td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fiksatifinde</td></tr> <tr><td>%4Formaldehit çözeltisi (36.5&ndash; Fiksatif Metanol olarak kullanılan H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775'te</td><td></td></tr><tr><td>%38 Fiksatif olarak kullanılan %99,9 Analitik sınıf</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td>, Fare İmmünofloresan Tespit Kiti üzerinde <td>fiksatif</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse olarak</td> kullanılır <td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>ticari immünofloresan kiti; spesifik olmayan etiketlemeyi azaltmak için</td></tr><tr><td>Rotator SB2 veya SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>mikrosantrifüj tüp döndürücü</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td></td><td></td><td>antijen alımı</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>HS-106</td><td>mountant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>solma önleyici ajan</td></tr><tr><td>Kalıcı pozitif şarjlı, önceden yıkanmış, 90 derece zemin kenarları</td><td>netlik</td><td>N / C366</td><td>slaytlar</td></tr><tr><td>Cam lamel - Kalınlık No. 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>lameller</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>3D organoid kültür için temel matris</td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Doku/organoidleri işlemek için</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Doku/organoidleri işlemek için</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td></tr><tr><td>1.5 mL LoBind tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>İzole organoidler için</td> <td>30108051</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-E-kaderin antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>birincil antikoru 1:500</td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti-tubulin YL1/2 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>birincil antikor 1:100</td></tr><tr><td>Tavşan alfa-tubulin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>birincil antikoru 1:100</td></tr><tr><td>Tavşan anti-beta-aktin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>primer antikoru 1:100</td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti-p150Yapıştırılmış antikor</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>primer antikoru 1:100</td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal EB3KT36 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>primer antikoru 1:200</td></tr><tr><td>Fare monoklonal EB1 antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>primer antikoru 1:200</td></tr><tr><td>Tavşan anti-Lgr5 antikoru</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>birincil antikor 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-sıçan 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>ikincil antikoru 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-fare 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>ikincil antikoru 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-tavşan 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>ikincil antikoru 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno florasan mikrotübüller ve ex vivo bağırsak dokusu ve 3d vitro bağırsak organoids centrosomal proteinler etiketleme

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Vivo doku mimarisi ve morfogenetik taklit 3D vitro organoids gelişiyle hücre ve gelişim biyolojisi anahtar biyolojik sorular çalışma yeteneği büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, organoids ile birlikte son teknik gelişmeler gen düzenleme ve viral gen teslim tıbbi araştırma ve geliştirme hastalıklarının tedavisi için yeni ilaçların ilerlemek vaat ediyor. Vitro Bodrum matris yetiştirilen Organoids çeşitli proteinlerin işlevini ve davranış eğitimi için güçlü model sistemleri sağlar ve canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur. Ancak, ifade ve yerelleştirme endojen proteinlerin kurulması ex vivo doku ve vitro organoids tagged proteinlerin davranışını doğrulamanız önemlidir. Bu amaçla biz geliştirdik ve doku yalıtım, fiksasyon ve immün etiketleme iletişim kurallarını mikrotübüller, centrosomal ve ilişkili proteinler ex vivo bağırsak dokusu ve vitro bağırsak organoids lokalizasyonu için değiştirildi. Ayrıca antikor antigenicity koruyarak ve iyi penetrasyon ve izni sabitleştirici ve antikorlar etkinleştirme sırasında organoids/doku 3D mimari korumak sabitleştirici amaç içindi. Tüm istikrarlı mikrotübüller soğuk maruz depolymerizes ve bu çeşitli protokoller değiştirirken önemli bir faktör oldu. Biz 3 mM EDTA kolon kriptalarının için yeterli iken ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) konsantrasyonu 3 mm 30 mM için artan villus ve ince bağırsak kriptalarının verimli dekolmanı verdi bulundu. Gelişmiş formaldehit/metanol fiksasyon protokolü de antigenicity etkili etiketleme mikrotübüller, aktin ve bitiş (EB) proteinler için koruma sırasında çok iyi Yapısal koruma verdi. Metanol Protokolü daha tutarlı bir şekilde çalıştı, ancak aynı zamanda centrosomal protein ninein için çalıştı. Daha fazla gelen izole veya Bodrum matris içinde kalan organoids ile fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme mikrotübüller ve ilişkili proteinler elde edilebilir kurduk.

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Bu prosedürün genel amacı, 3D in vitro bazal matris gömülü bağırsak organoidlerini izole etmek ve daha sonra mikrotübülleri ve sentro organoidleri sabitlemek ve immüno-etiketlemektir proteins. 3D in vitro organoidler, hücre ve gelişim biyolojisindeki temel biyolojik soruları incelemek için ideal modellerdir. Ancak endojen proteinleri ve yapıları 3D modellerde lokalize etmek, 2D kültürlerden daha karmaşıktır.Daha da önemlisi, fiksatifin hassas 3D mimariyi koruması ve aynı zamanda antikor antijenisitesini koruması gerekir. Sunulan yöntemler arasında 3 boyutlu bir in vitro bağırsak organoidlerinin izolasyonu, fiksasyonu ve immünoblokingi yer alır. Ancak fiksasyon ve immünoetiketleme protokolleri ex vivo izole edilmiş dokularda da kullanılabilir.Sunulan formaldehit metanol fiksasyon protokolünün temel avantajı, 3D yapıları korurken aynı zamanda antijenikliği de korumasıdır. Mikrotübüllerin, aktin filamentlerinin ve bağlayıcı proteinlerin ve dokuz dahil olmak üzere birkaç sentrosomal proteinin etkili bir şekilde etiketlenmesi için sabit tetral antikorların iyi bir şekilde penetrasyonunu ve temizlenmesini sağlar. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda resmi bir doktora sonrası araştırmacı olan doktor Deborah Goldspink ve ortak yazar olan doktor Zoe Matthews olacak.Bağırsak kriptleri ve villusların izolasyonunu takiben, izole epitel yapıları immün boyama için sabitlenebilir. İzole edilmiş kriptler dönüşümlü olarak matris kubbelerine oturtulabilir ve bu da daha sonra organoidler oluşturacaktır. Yaklaşık beş ila yedi günlük inkübasyondan sonra organoidler oluşmuş olacaktır.Bodrum matris kubbelerini içeren kuyuları organoidlerle yıkamak için 500 mikrolitre RT-PBS kullanın. Ardından, her kuyucuğa 250 mikrolitre soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Ardından, bir P1000 mikropipet kullanarak, bodrum matris kubbelerini kazıyın ve bodrum matrisini plastikten ayırmak ve çıkarmak için kuyu boyunca dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.Matrisi parçalamaya yardımcı olmak için geri kazanım solüsyonunun soğuk olduğundan emin olun. Kazıma yaparken, organoidleri parçalamamak ve bozulmadan kalmalarını sağlamak için yalnızca bir P1000 mikropipet kullanın. Süpernatanı 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.Daha sonra, tüpü birkaç kez ters çevirin ve organoidlerin izole edildiğini, serbest hareket ettiğini ve kümeler halinde olmadığını 50 kat büyütme ile mikroskop altında kontrol edin. Organoidleri 1.000 g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, geri kazanım reaktifini çıkarın ve hemen fiksasyona devam edin.Önceden izole edilmiş organoidleri formaldehit ve metanol ile sabitlemek için, organoidleri negatif 20 santigrat derece formaldehit metanol fiksatif çözeltisinde yeniden süspanse edin. Organoidleri eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda 15 dakika inkübe edin ve tüpü her beş dakikada bir ters çevirin. Daha sonra, organoidleri beş dakika boyunca 1.000 g'da santrifüjleme ile peletleyin.Fiksatifi çıkarın ve ardından% 1 ikincil antikor türleri serumu içeren PBS veya% 0.1 deterjan ve% 1 serum içeren PBS'den oluşan yıkama solüsyonunu ekleyin. Numuneyi daha önce olduğu gibi peletledikten sonra, yıkama solüsyonunu çıkarın ve numuneyi taze yıkama solüsyonunda tekrar süspanse edin. Hücreleri toplam bir saat boyunca yıkamak için bir tüp döndürücü kullanın, organoidleri her 15 dakikada bir santrifüjleme ile peletleyin ve yıkama solüsyonunu değiştirin.Bağırsak organoid örneklerini bloke etmek için, PBS'ye% 10 ikincil antikor türleri serumu ekleyin. Organoidleri beş dakika boyunca 1.000 g'da pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın. Farklı antikorlarda inkübe edilecek her numuneye bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin.Daha sonra, numuneleri ve bloke edici çözeltiyi oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde bir saat inkübe edin. Daha sonra,% 10 serum ve% 0.1 deterjan içeren PBS'deki birincil antikorları seyreltin. Daha sonra, numuneleri döndürdükten ve bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, organoid peletini yeniden süspanse etmek için birincil antikor çözeltisini kullanın.Organoidleri süspansiyonda tutmak için tüpleri gece boyunca 20 RPM ve dört santigrat derecede döndürün. Ertesi gün, numuneleri bir saat boyunca tüp döndürücüde oda sıcaklığına geri getirin. Numuneyi döndürdükten sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın, her tüpe bir mililitre yıkama çözeltisi ekleyin ve organoid peletleri yeniden süspanse edin.Ardından, çözeltiyi hemen santrifüjleme ile çıkarın. Bir mililitre taze yıkama solüsyonu ekleyin ve hücreleri iki saat boyunca 20 RPM'de bir tüp döndürücüde karıştırın. Daha sonra, PBS'deki ikincil antikorları% 1 serum ve% 0.1 deterjanla seyreltin.Daha sonra, dokuyu peletledikten sonra, peletleri 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Tüpleri bir tüp döndürücü üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Süpernatanı döndürdükten ve çıkardıktan sonra, peleti yıkama solüsyonunda yeniden süspanse edin ve organoidleri peletlemek için numuneleri hemen santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre taze yıkama solüsyonunda yeniden süspanse edin. Numuneleri oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde 1,5 ila iki saat karıştırın ve yıkama solüsyonunu daha önce açıklandığı gibi her 20 ila 30 dakikada bir değiştirin. Organoidleri monte etmek için, tüm yıkama solüsyonunu döndürdükten ve çıkardıktan sonra, pelete antifade reaktifi ile iki damla sert sertleşen montaj ortamı ekleyin.Bir P200 mikropipetinin ucunu kesin ve peleti montaj ortamında dikkatlice yeniden süspanse edin. Sabit ve lekeli organoidleri montaj ortamında yeniden süspanse ederken, herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin. Kabarcıklar varsa, yüzeye çıkmalarına izin verin ve ardından bunları slayta aktarmaktan kaçının.Organoidleri montaj ortamıyla birlikte bir mikroskop lamının merkezi boyunca bir çizgi halinde dağıtmak için mikropipeti kullanın. Ardından, üstüne dikkatlice bir kapak camı yerleştirin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Cam slaytı bir slayt kitabına yerleştirin ve konfokal bir mikroskopta analiz etmeden önce montaj ortamının sertleşmesi için bir gece buzdolabında saklayın.Burada, hem villus hem de kriptleri içeren izole edilmiş ince bağırsak dokusunun ikinci fraksiyonundan görüntüler ve esas olarak kriptleri içeren üçüncü fraksiyondan bir örnek gösterilmektedir. Bu görüntülerde görüldüğü gibi, bu videoda açıklanan formaldehit metanol fiksasyonu ve immünokinoklama protokolü ile hem villuslarda hem de kriptlerde mikrotübüllerin ve aktinin iyi bir şekilde korunması ve etiketlenmesi sağlanmıştır. İnce bağırsak organoidleri, üç hafta veya daha uzun süre bodrum matrisinde üretildi ve büyütüldü, daha sonra bu videoda gösterildiği gibi izole edildi.Organoid villus alanları içindeki farklılaşmış hücreler, çoğu durumda iyi etiketlenmiş stabil apikobazal mikrotübüller içerir. EB1 ayrıca mikrotübül kafesi boyunca da görülebilir. Burada gösterilen, kist aşamasında ve kript gelişiminin erken bir aşamasında olan bir organoiddir.Her iki numune de formaldehit metanol içine sabitlendi ve mikrotübüller ve dokuzlar için immüno-etiketli hale getirildi, bu da apikal sentrosomal olmayan mikrotübül düzenleme merkezlerinde iyi mikrotübül koruması ve etiketlemesi gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birden fazla örnekle ve iki gün boyunca gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, 3D yapılarını bozmamak için organoidleri toplarken kuyuları dikkatlice kazımak önemlidir.Ayrıca, boyama prosedürü boyunca organoid kaybını önlemek için solüsyon eklerken veya çıkarırken dikkatli olun. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş organoidleri ve bağırsak kriptleri gibi diğer epitel yapılarını nasıl düzelteceğinizi, immüno-etiketleyeceğinizi ve monte edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürde çalışan fiksatif reaktiflerin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu prosedürün risk değerlendirmeleri yapılmalı ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman uygun muhafaza önlemleri ve KKD alınmalıdır.

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, sağlam prostat kanseri organoidlerinin immünofloresan boyama tekniği ve bunların tam montajlı konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, bazal ve luminal prostat epitel hücrelerinin ex vivo farklılaşma kapasitesini değerlendirmeyi amaçlar.

Tam Montajlı İmmünofloresan Görüntüleme: Sağlam Organoidleri Değerlendirmek İçin Bir Sabitleme ve Boyama Tekniği

Bu video, serbest yüzen fare jejunum kriyokesitlerinde bağırsak tutam hücrelerini görselleştirmek için immünofloresan tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bağırsak villusları içinde, luminal uçta yeşil floresansın genişletilmiş bir kırmızı kökçük kütlesi ile birlikte lokalizasyonu, tutam hücrelerinin varlığını gösterir.

Jejunum Kriyoseksiyonlarında Tutam Hücrelerini Görselleştirmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Öğrenin bağırsak organoidlerinde mikrotübül ve sentrozomal proteinleri immünoetiketleme yöntemlerini. Formaldehit metanol fiksasyonu ile 3D yapıları koruyarak hücre ve gelişim biyolojisi araştırmaları için etkili protokoller sunar.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Daha fazla video keşfet