Name: İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Öğrenin, uçtan büyüyen bitki hücrelerinin dar boşluklardaki uzama yeteneğini mikrosıvısal cihazlarla nasıl incelendiğini. Bu yöntem, polen tüpleri ve yosun protonemaları üzerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz H. Tsutsui ve ö. Kurihara T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato hattı ve A. thaliana UBQ10pro::H2B-kes hattı, sırasıyla gibi transgenik bitkiler ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Enstitüsü, dönüştürücü biyo-moleküller tarafından Nagoya Üniversitesi ve Japonya gelişmiş bitki bilim ağ destek verdi. Bu eser için mali destek sağlanan hibe tarafından Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (ERATO proje vermek yok. T.H. için JPMJER1004), yenilikçi alanlar ('ları üzerinde bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid JP16H06465 ve JP16H06464 T.H. için) ve Japonya toplum için zorlu araştırmacı araştırma (hibe No 26600061 için N.Y. ve grant NOS 25650075 ve 15 K 14542 YS için) promosyon bilim (JSP'ler) Grants-in-Aid.

1. polen tüpler büyüyen incelemek için PDMS Microdevice imalatı ve yosun Protonemata
Not: Silikon gofret üzerinde PDMS kalıpları hazırlamak için bir maskless fotolitografi aleti kullanılmış. Sistemin çalışması ile ilgili detayları bu el yazması göz ardı edilir. Bir photomask kullanarak bir standart fotolitografi teknik9 bu el yazması açıklanan PDMS kalıpları oluşturmak için de kullanılabilir.
<ol><li>11 g ön polimer PDMS karışımı dökün (elastomer temel: Ajan 10:1 oranında kür) her 4 inçlik kalıp içine.</li>
	<li>Adım 1.1 vakum odasında 20 dakika için hazırlanan kalıp degas.</li>
	<li>Bir sigara konveksiyon fırın içinde 90 dk 65 ° C'de kür sonra PDMS katman kalıp kapalı soyma ve biyopsi yumruklar kullanarak sıvı kanallarına erişim delikler. Not: polen tüpü aygıt için deliğin boyutunu pistil çapını yansıtacak şekilde ayarlanması gerekir. Bu değer bu nedenle türler tarafından değişir. Bu deneyde, pistil alıcılar için 1 mm delik ve sıvı orta rezervuarlar için 1.5 mm delik yumruk attı. Yosun protonemata aygıt için 4 mm delik örnek rezervuar için kullanıldı.</li>
	<li>Plazma 50 için hava için PDMS katmanı ve bir cam alt çanak (3.5-5 cm çapında) maruz s.</li>
	<li>PDMS katman cam alt çanak ve 65 ° C ısıda 30 dk içinde tamamen mikrosıvısal ağ oturumunu kapatma imzalamaya bir sigara konveksiyon fırın için basın.</li>
</ol>2. kök tüyleri için PDMS Microdevice imalatı
<ol><li>1.1-1.3 kök ve kök saç microdevices için iki PDMS katman hazırlamak için kalıpları kullanarak adımları yineleyin. Not: Biz kök microdevice sıvı orta rezervuar 2 mm delik kullandık.</li>
	<li>Plazma 50 için hava ile her iki PDMS katmanı açığa s.</li>
	<li>Özel yapım bir masaüstü aligner kullanarak bir stereomicroscope altında iki PDMS katmanları birleştirin. Not: Bu PDMS katmanlardaki mikro birbirine yüz gerekir. Montaj önce her iki katmanı hizalama izleri aynı olmasına dikkat edin.</li>
	<li>30 dk içinde tamamen mikrosıvısal ağ oturumunu kapatma imzalamaya bir sigara konveksiyon fırın için 65 ° C'de ısı.</li>
	<li>Kapak notu inşa microdevice çıkarın ve cihazın 5 cm çapında bir cam alt yemek üzerine yerleştirin.</li>
</ol>3. Hazırlık In Vitro hücre kültür orta polen tüpler (Torenia fournieri)
<ol><li>15 ve basınçlı kap daha önce açıklandığı gibi değiştirilmiş Nitsch'ın orta orta 121 ° C'de 20 min için hazır olun. Not: NH4modifed Nitsch'ın orta bileşimi olduğunu KNO3 (125 mg/L)3 (80 mg/L), Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L) Na2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L) sukroz (50.000 mg/L) ve kazein (500 mg/L). Hazır orta 4 ° C'de en az 4 ay depolanabilir.</li>
	<li>% 26 (w/v) Polietilen glikol autoclaved deiyonize su kullanarak hazırlamak ve çözüm 0.3 µm gözenek filtre ile filtre. Not: Hazırlanan orta 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.</li>
	<li>Adım 3.1 ve 3.2 1:1 (v/v) oranında hazırlanan reaktifler karıştırın. Not: Bu orta her kullanım için taze hazırlanmalıdır.</li>
</ol>4. kök tüyleri (Arabidopsis thaliana) için hazırlık In Vitro hücre kültür orta
<ol><li>%0.215 (w/v) Murashige & Skoog orta, % 0.05 (w/v) MES, %1 (w/v) sükroz ve %1 (w/v) agar deiyonize su çözeltisi hazırlamak. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de çözüm.</li>
</ol>5. Hazırlık In Vitro hücre kültür orta olarak Moss Protonemata (Physcomitrella patens)
<ol><li>Yosun protonemata BCDAT orta16 bir petri içinde önceden kuluçkaya. Not: BCDAT orta kompozisyon ise 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1.8 mM KH2PO4 (pH) 6.5 KOH ile düzeltilmiş, trace öğe çözüm (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0,1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2ve 0.17 µM KI), 1 mM CaCl2ve 5 mM diammonium (+)-tartarat.</li>
	<li>Kültür microdevice BCDATG orta olarak moss. Not: %0,5 (w/v) glikoz ile BCDAT orta BCDATG ortamdır. Hazır orta 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.</li>
</ol>6. T. fournieri polen tüplerinin Microdevice in Vitro Culturing
<ol><li>20 dakikadır degas ve polen tüpü microdevice bir vakum odasında yerleştirin.</li>
	<li>Microdevice vakum odasından kaldırın ve bir micropipette ile çok iyi bir ipucu kullanarak pistil giriş büyüme orta tanıtmak. Üst kısımları için kalan wells ile aynı orta doldurun. Tüm mikro mikro içinde oluşturulan vakum tarafından orta ile doldurulur kadar birkaç dakika bekleyin.</li>
	<li>Bazı ıslak kağıt havlu çanak nem korumak için cam alt çanak yerleştirin.</li>
	<li>Polen taneleri vahşi türünden aktarım T. fournieri 'mavi ve beyaz' çiçek diseksiyon iğne kullanarak onun stigma için. Not: Biz de bu transgenik T. fournieri ile deney ( RPS5Ap::H2B-tdTomato hattı17) 'mor taç' çiçek, polen fluorescently etiketli sperm hücresi ve bitkisel çekirdek içeren tüpler.</li>
	<li>Kesim tozlanan stil (1 cm uzunluğunda) bir bıçak kullanarak.</li>
	<li>Kesim tarzı cihazın giriş Şekil 2' de gösterildiği gibi yerleştirin.</li>
	<li>Çanak üzerinde bir kapak koyun ve bant ile kapatın.</li>
	<li>Aygıt için 5-6 h 28 ° C'de bir kuluçka karanlıkta yerleştirin.</li>
</ol>7. A. thaliana kök kıllar Microdevice in Vitro Culturing
Not: Adımları 7.1-7,9 (7,3 ve 7,5 dışında) bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>A. thaliana Columbia (Col-0) tohumlarından sterilize ve transgenik (floresan nükleer işaretçiyi içeren) UBQ10pro::H2B-kes satır 5 min için steril sıvı (%5 (v/v) ev çamaşır suyu ve %0.02 (v/v) Triton X-100) içinde ıslatarak.</li>
	<li>İyice sterilize tohum autoclaved su ile durulayın.</li>
	<li>Durulanır tohumları suda 4 ° C'de 2 gün boyunca karanlıkta saklayın.</li>
	<li>UV ışığı altında microdevice gecede sterilize.</li>
	<li>20 dakikadır degas ve microdevice bir vakum odasında yerleştirin.</li>
	<li>Büyüme orta wells için yapılan bir micropipette kullanarak aygıtı tanıtmak. Orta ile tüm mikro vakum doldurur kadar birkaç dakika bekleyin.</li>
	<li>Autoclaved ıslak kağıt havlu çanak nem korumak için cam alt çanak yerleştirin.</li>
	<li>Steril bir tohum cihazın giriş aktarın.</li>
	<li>Çanak üzerinde bir kapak koyun ve bant ile kapatın.</li>
	<li>Cihazın bir kuluçka 22 ° c sürekli beyaz ışık altında dikey olarak yerleştirin.</li>
	<li>Kök saç büyüme kuluçka 4-10 gün sonra kontrol edin. Parlak alan ve floresan görüntüleri ters bir mikroskop kullanarak elde edilir.</li>
</ol>8. P. patens (moss) mikrosıvısal cihazın Protonemata in Vitro Culturing
Not: Adımları 8.2-8,6 (8.3 dışında) bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>P. patens gerilme Gransden 200418 25 ° C'de sürekli beyaz ışık altında bir hafta bir petri selofan kaplı BCDAT orta preculture</li>
	<li>Microdevice gecede bir laminar akış başlıklı UV ışık altında sterilize.</li>
	<li>20 dakikadır degas ve microdevice bir vakum odasında yerleştirin.</li>
	<li>Büyüme orta bir micropipette kullanarak wells tanıtmak. Orta ile tüm mikro vakum doldurur kadar birkaç dakika bekleyin.</li>
	<li>Autoclaved su çanak nem korumak için microdevice çevreleyen çanak içine ekleyin.</li>
	<li>Yosun protonemata doku küçük bir parça microdevice koya aktarmak ve sürekli beyaz ışık altında 25 ° C'de bir kuluçka doku kültür.</li>
	<li>Yosun protonemata büyüme kuluçka 2-3 hafta sonra kontrol edin. Parlak alan görüntü bir mikroskop kullanarak elde.</li>
</ol>9. T. fournieri polen tüpü büyüme hızlandırılmış görüntüleme
<ol><li>Microdevice görüntü edinme donanım ile donatılmış bir ters floresans mikroskobu yerleştirin (Örn., CCD kamera) ve yazılım. Microgap yerleri bulabilirsiniz. Not: görüntü alma yazılımı, biz ticari bir ürün (Tablo reçetesi) kullanılır. Açık kaynak mikroskopi µManager gibi aynı zamanda kullanılabilir çevrimiçi (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) yazılımdır. Bunun bir mikroskop kondansatör yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskobunun yüklemeniz önerilir.</li>
	<li>Parlak alan her 10 çekim s mikroskop görüntü alma yazılımı kullanarak.</li>
	<li>Fluorescently etiketli sperm hücresi ve polen tüpü RPS5Ap::H2B-tdTomato satırının bitkisel çekirdeğinde gözlemlemek için numune 561 nm lazer ile ışınlatayım ve bant optik filtre kullanın (578/105 nm). Not: her ne kadar polen tüpü büyüme hızlandırılmış görüntülerini sık sık ele geçirildi, görüntüleme büyüme etkilemeye görünmedi. Ancak, her zaman lazer yoğunluğu, çekim hızı ve hızlandırılmış aralığı fototoksisite ve fluorophore photobleaching en aza indirmek için en aza indirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Parlaklık ve kontrast görüntülerin ve ImageJ yazılımı (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak bir video dosyasını hazırlamak.</li>
</ol>

<ol><li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li>
<li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogler%2C+H+%22Pollen+Tip+Growth%22">Pollen Tip Growth</a>. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).</li>
<li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/50/334/565/525736">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li>
<li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01282125">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li>
<li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube%3A+a+soft+shell+with+a+hard+core%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li>
<li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138(2016).</li>
<li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703(2011).</li>
<li>Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27406170">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li>
<li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li>
<li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss%2C+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li>
<li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li>
<li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li>
<li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403(2017).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/120/9/2465">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li>
<li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Protokol birkaç kritik adımda tam olarak yukarıda sunulan sonuçlar elde etmek için takip edilmesi gerekiyor. İlk olarak, katman ve cam alt çanak PDMS yüzeyler her ikisi de plazma ile yapıştırma önce yeterli süreyi için tedavi edilmelidir. Aksi takdirde, ipucu büyüyen hücreler microgaps geçiş yaparken PDMS katman yerel olarak cam yüzeyinden ayırmak. Başka bir önemli kök saç ve yosun protonemata protokol microdevice sterilizasyon adımdır. Normalde, kök tüyleri ve yosun protonemata hücreleri birkaç hafta içinde microdevice ...

Polen taneleri üzerinde bir leke çimlenme sonra her tahıl sperm hücresi yumurta ve çift döllenme için ovule merkezi hücreye taşır tek bir polen tüp üretir. Polen tüpler tarzı uzamış ve sonunda birden çok kılavuz ipuçları onların yolu1boyunca algılama tarafından ovule ulaşmak. Uzama sırasında polen tüpler fiziksel engeller bir dizi karşılaşırsanız; verici parça hücreleri ile doldurulur ve polen tüpler onların hedef (Şekil 1A)2ulaşmak için ovule dakika micropylar açılışı girmeniz gerekir. Bu nedenle, polen tüpler çevreleri basınç stresten tolere ederken fiziksel engeller, nüfuz yeteneği olması gerekir. Kök tüyleri ortamında paketlenmiş toprak parçacıklar (Şekil 1B) şeklinde fiziksel engelleri dayanmak zorundadır ipucu büyüyen bitki hücre başka bir türüdür.
Turgor basıncı ve yeni başlayan plasmolysis Yöntem3,4 ve hücresel kuvvet mikroskobu kullanılarak ölçülebilir hücre apikal bölgede sertliği de dahil olmak üzere çeşitli mekanik özelliklerini polen tüpü incelenmiştir (CFM) 5 , 6, anılan sıraya göre. Ancak, bu yöntemlerin yalnız polen tüpler aracılığıyla onların büyüme yol üzerindeki fiziksel engeller elongating yeteneğine sahip olup olmadığını ortaya çıkarmak değil. İzlenen vivo içinde olmak polen tüpü uzaması sağlayan bir alternatif iki foton mikroskobu7tekniğidir. Ancak, bu yöntemle, bireysel polen tüpler morfolojik değişimler gözlemlemek zor öyle içten içe ovule doku. Ayrıca, toprakta kök saç büyüme x-ışını bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)8, kullanarak düşük çözünürlüklü de olsa görüntülenmeyecektir. Burada, bir hücrenin deformasyon işlemi geleneksel mikroskop yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için kullanılan bir yöntem mevcut.
Burada açıklanan yöntemi genel amacı ipucu büyüyen bitki hücreleri polen tüpler, kök tüyleri, dahil olmak üzere, uzama kapasitesini görselleştirmek ve protonemata, son derece küçük alanlarda moss etmektir. Bu el yazması sunulan poli-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices optik şeffaf ve hava geçirgen, biz canlı hücreler cihazın içinde kültür ve büyüme davranışları bir mikroskop altında gözlemlemek. Ayrıca mikro oluşturmak mümkündür ~ nanometre ölçek alanlarda kalıpları kullanımı ile yumuşak litografi tekniği9 . Bu özellikler bize ipucu büyüyen bitki hücreleri fiziksel olarak kapalı bir ortamda uzama yeteneğini çalışmaya olanak sağlar.
Bu çalışmada, 1 µm geniş boşluklar (yüksekliği 4 µm) mikrosıvısal cihazlarda inşa ve silindirik polen tüpü (yaklaşık 8 µm) çapından küçüktür bu yapay engelleri nüfuz yeteneği polen tüplerinin muayene etti. Bu deneysel platform polen tüpü yanıt-e doğru microgaps görselleştirmek ve hücrenin deformasyon işlemi izlemek belgili tanımlık yanıt, hızlandırılmış görüntülerini yakalamak bize sağlar. Ayrıca cihazın penetrasyon özelliği kök tüyleri ve yosun protonemata araştırmak için kullanılan microdevices geliştirdi. Birkaç microdevices bitki kök10,11,12,13 ve yosun protonemata14 büyüme yüksek çözünürlükte görselleştirme etkinleştirme tarihi bildirilmiştir. Bizim cihaz kök saç büyüme kanalları bir dizi dik bir kök büyüme odasına bağlı ve bireysel kök tüyleri (çapı yaklaşık 7 µm) geniş bir boşluk 1 µm ile sıvı kanallara yönlendirilir. Biz de yosun kültürlü protonemata (çapı yaklaşık 20 µm) Bu fiziksel engellerin yanıtlarını incelemek için microgaps içeren bir microdevice içinde. Önerilen mikrosıvısal dayalı yaklaşım çeşitli ipucu büyüyen bitki hücreleri aracılığıyla herhangi bir mevcut diğer yöntemle incelendiğinde çok küçük alanlarda uzamış yeteneği keşfetmek için bize izin verir.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning A.Ş.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Wako Saf Kimyasal</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Wako Saf Kimyasal</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>50 mm cam tabanlı çanak</td><td>Matsunami Cam</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı çanak</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bıçak</td><td>Tüy</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>biyopsi yumrukları</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>Jel yükleme ipuçları</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Bu özelleştirilmiş mikroskop</td></tr> <tr><td>için katalog numarası mevcut değildirMetaMorph görüntüleme yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

Vivo, ipucu büyüyen bitki hücreleri fiziksel engeller bir dizi aşmak gerekir; Ancak, araştırmacılar bu kısıtlayıcı koşullarda hücresel davranış görselleştirmek için metodoloji eksikliği. Bu sorunu gidermek için biz bir poli-dimethylsiloxane (PDMS) substrat büyüme salonları dar, mikro fabrikasyon boşluklar (~ 1 µm) bir dizi içeren ipucu büyüyen bitki hücreleri için geliştirdik. Bu şeffaf malzeme ipucu uzama işlemlerde tek tek hücreler tarafından hızlandırılmış görüntüleme microgap penetrasyon sırasında izlemek için kullanıcı sağlar. Onlar microgap nüfuz olarak deneysel bu platformu kullanarak, biz polen tüpler morfolojik değişimler görülmektedir. Bu işlem sırasında fluorescently etiketli bir bitkisel çekirdek şeklinde dinamik değişiklikler ve sperm hücresi bir polen tüp ele geçirdi. Ayrıca, kök tüyleri ve yosun protonemata 1 µm Aralık nüfuz yeteneğini gösterdi. Bu vitro platform nasıl tek tek hücreleri yanıt fiziksel olarak kısıtlı alanlarda çalışmak için kullanılan ve anlayışlar ipucu-büyüme mekanizmaları içerebilir.

Şekil 1' de gösterildiği gibi onların büyüme yolları içinde vivoboyunca fiziksel engeller bir dizi ipucu büyüyen bitki hücreleri karşılaşma. Bu çalışmada sunulan mikrosıvısal vitro hücre kültür platformlar muayene etkin ipucu büyüyen bitki hücreleri (polen tüpler, kök tüyleri ve yosun protonemata) arasındaki 1 µm yapay geçitlerden (Şekil 3, üç tür süreç Şekil 4, <strong class="xfig"...

İpucu büyüyen bitki hücreleri polen tüpler, kök tüyleri, dahil olmak üzere, kapasitesini araştırmak ve protonemata son derece dar geçitlerden (~ 1 µm) uzamış, bir mikrosıvısal cihazda moss bir yöntem açıklanmaktadır.

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Bu yöntem, uç büyüyen bitki hücrelerinin hücre fiziksel engellerine nasıl nüfuz ettiği gibi bitki hücresi biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel bir mikroskop altında mikrometre ölçeğindeki boşlukta bir hücrenin deformasyon sürecini yeniden inşa eden yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etme yeteneğidir. Büyüyen polen tüplerinin ve yosun protonematalarının incelenmesi için bir cihaz yapmak için, önce yaklaşık 11 gram PDMS yapın ve dört inçlik bir kalıba yükleyin.Ardından, kalıbı bir vakum odasında 20 dakika boyunca gazdan arındırın. Daha sonra, kalıbı 90 dakika boyunca 65 santigrat derecede sertleştirin. Sertleştikten sonra, PDMS tabakasını kalıptan soyun ve bir biyopsi delme aleti kullanarak PDMS içindeki kanala erişim deliklerini açın.Ardından, PDMS'yi ve beş santimetrelik cam çanağı 50 saniye boyunca hava plazmasına maruz bırakın. Mikroakışkan ağı kapatmak için, PDMS katmanını cam tabağın üzerine bastırın ve 65 santigrat derecede 30 dakika sertleştirin. Kök kıl muayenesi için tasarlanmış bir mikro cihaz yapmak için iki kalıp yüklenir ve sertleştirilir.Kanal deliklerini delerken, iki milimetrelik bir zımba kullanın. Her iki katmanı da 50 saniye boyunca hava plazmasına maruz bıraktıktan sonra, bir stereomikroskop altında bir lamel de dahil olmak üzere bunları birleştirin. Bunu gerçekleştirmek için özel yapım hizalama aracını kullanın.Mikroakışkan ağını kapatmak için düzeneği fırında 30 dakika kürleyin. Sertleştikten sonra, lamel cihazdan çıkarın ve beş santimetrelik bir cam tabağa aktarın. Polen tüpü mikro cihazını kullanmadan önce, 20 dakika boyunca bir vakum odasında gazını alın.İnce uçlu bir mikropipet kullanarak pistil girişine büyüme ortamı ekleyin. Diğer kuyuları aynı ortamla yükleyin. Kanalların dolması için birkaç dakika bekleyin.Bu arada, yerel nemin korunmasına yardımcı olmak için tabağa nemli bir kağıt havlu koyun. Şimdi, bir T.fournieri mavi ve beyaz çiçeğinden polen taneleri toplayın. Taneleri bir diseksiyon iğnesi kullanarak stigma üzerine aktarın.Daha sonra, bir santimetre uzunluğunda tozlaşan bir stili uzunlamasına kesin ve ardından kesilen stili mikroakışkan cihazın girişine yerleştirin. Kesim stili cımbızla mikroakışkan cihazın girişine yerleştirildiğinde, stile zarar verebileceği için stili çok sıkı tutmamak önemlidir. Ardından, bant kullanarak tabağın üzerine bir kapak sabitleyin ve tabağı 28 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın ve burada beş ila altı saat karanlıkta kalması gerekir.Laminer akış başlığı altında çalışarak, transgenik A.thaliana Columbia tohumlarını sterilize ederek başlayın. Onları beş dakika boyunca temizleme solüsyonunda bekletin. Daha sonra tohumları otoklavlanmış suda iyice durulayın.Sterilize edildikten sonra, tohumları 48 saat karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Birkaç gün sonra, kullanmadan önce mikro cihazın gazını 20 dakika boyunca boşaltın. Daha sonra, uygun büyüme ortamını ince uçlu bir pipet kullanarak cihazın kuyucuklarına yükleyin ve çözeltinin tüm kanallardan çekilmesi için birkaç dakika bekleyin.Ayrıca, nemi korumak için tabağın üzerine biraz nemli kağıt havlu yükleyin. Şimdi, hazırlanmış bir tohumu cihazın girişine aktarın. Ardından, kapağı bant kullanarak sabitleyin ve çanağı sürekli ışıklı 22 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın.Kullanmadan önce, mikro cihazı gece boyunca UV altında sterilize edin. Ertesi gün, mikro cihazın gazını 20 dakika boyunca alın. Gazdan arındırıldıktan sonra, mikro kuyuları uygun büyüme ortamı ile yükleyin.Kanallar yavaş yavaş dolarken, nemi korumak için mikro cihazı bir miktar otoklavlanmış su ile çevreleyin. Küçük bir parça yosun protonemata dokusunu mikro cihazın girişine aktarın. Şimdi, cihazı sürekli ışık altında 25 santigrat derecede kültürleyin.İki ila üç haftalık büyümeden sonra, mikroskop altında sonuçların parlak alan görüntülerini alın. Uç büyüyen bitki hücreleri, büyüme yolları boyunca in vivo olarak, iletim yolunda ve mikropilde olduğu gibi, topraktaki kök kıllarının yolundan bahsetmiyorum bile, bir dizi fiziksel engelle karşılaşır. Sunulan mikroakışkan in vitro hücre kültürü platformları, üç tip bitki hücresinde, polen tüplerinde, kök kıllarında ve yosun protonematasında uç büyütme sürecinin incelenmesini sağlar.Görüntüleme, cihazlardaki bir mikronluk boşluklar aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu boyuttaki mikro boşluklar kırılgan olduğundan, bazen özellikle tekrarlanan kullanımdan sonra kapanırlar. Bu nedenle, deneyleri gerçekleştirmeden önce boşlukların sağlam olduğunu doğrulamak önemlidir.Polen tüpü çalışması için, polen tüplerinin apikal bölgesindeki morfolojik değişikliklerin yanı sıra son derece küçük bir alanla karşılaşmaya yanıt olarak vejetatif çekirdek ve sperm hücrelerini izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanıldı. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki hücresi biyolojisi alanındaki araştırmacıların, polen tüpleri, kök kılları ve yosun protonemataları gibi uç büyüyen bitki hücrelerinin son derece küçük bir alanda uzama kabiliyetini keşfetmelerinin yolunu açtı.

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz hücre yakalama ve kültür etkinleştirebilirsiniz mikroakışkan cihazların imalatı için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, mikroakışkan kanallar içinde oluk gibi desenli mikro, içinde hücre sabitleyebilirsiniz Shear stresin düşük olduğu bölgelerde oluşturmak için kullanılır.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Kaynak: Cabeen, M. T. ve diğerleri. Bacillus subtilis'in Tek Hücreli Mikrofluidik Analizi. J. Vis. Exp. (2018)Video, tek hücre düzeyinde bakteri büyümesini gözlemlemek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikro ölçekli hendeklerde hapsedilmiş hareketsiz bakteriyel hücrelerin sürekli olarak floresan mikroskobu altında nasıl görüntülendiğini ve beslendiğini gösteriyor. Bu kurulum, hücre bölünmesi ve soy takibinin birden fazla nesil boyunca gerçek zamanlı görselleştirilmesini...

Mikrofluidik bir sistemde tek hücre çözünürlüğünde bakteri büyümesini takip etmek

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Bu protokol, mikrotübül polimer mekaniğini araştırmak için uygun bir mikroakışkan cihazın tasarımını ve üretimini detaylandırır. Mikrofabrikasyon, otomatik akış kontrolü ve hesaplamalı modelleme tekniklerinin sentezi, hücresel hücre iskeletini in vitro olarak araştırmak için ideal olan esnek bir sistem sağlar.

Mikrotübül Polimer Mekaniğinin İncelenmesi için Mikroakışkan Tabanlı Bir Yaklaşımın Geliştirilmesi

Öğrenin, uçtan büyüyen bitki hücrelerinin dar boşluklardaki uzama yeteneğini mikrosıvısal cihazlarla nasıl incelendiğini. Bu yöntem, polen tüpleri ve yosun protonemaları üzerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

Daha fazla video keşfet