İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

Bu yöntem, uç büyüyen bitki hücrelerinin hücre fiziksel engellerine nasıl nüfuz ettiği gibi bitki hücresi biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel bir mikroskop altında mikrometre ölçeğindeki boşlukta bir hücrenin deformasyon sürecini yeniden inşa eden yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etme yeteneğidir. Büyüyen polen tüplerinin ve yosun protonematalarının incelenmesi için bir cihaz yapmak için, önce yaklaşık 11 gram PDMS yapın ve dört inçlik bir kalıba yükleyin.

Ardından, kalıbı bir vakum odasında 20 dakika boyunca gazdan arındırın. Daha sonra, kalıbı 90 dakika boyunca 65 santigrat derecede sertleştirin. Sertleştikten sonra, PDMS tabakasını kalıptan soyun ve bir biyopsi delme aleti kullanarak PDMS içindeki kanala erişim deliklerini açın.

Ardından, PDMS'yi ve beş santimetrelik cam çanağı 50 saniye boyunca hava plazmasına maruz bırakın. Mikroakışkan ağı kapatmak için, PDMS katmanını cam tabağın üzerine bastırın ve 65 santigrat derecede 30 dakika sertleştirin. Kök kıl muayenesi için tasarlanmış bir mikro cihaz yapmak için iki kalıp yüklenir ve sertleştirilir.

Kanal deliklerini delerken, iki milimetrelik bir zımba kullanın. Her iki katmanı da 50 saniye boyunca hava plazmasına maruz bıraktıktan sonra, bir stereomikroskop altında bir lamel de dahil olmak üzere bunları birleştirin. Bunu gerçekleştirmek için özel yapım hizalama aracını kullanın.

Mikroakışkan ağını kapatmak için düzeneği fırında 30 dakika kürleyin. Sertleştikten sonra, lamel cihazdan çıkarın ve beş santimetrelik bir cam tabağa aktarın. Polen tüpü mikro cihazını kullanmadan önce, 20 dakika boyunca bir vakum odasında gazını alın.

İnce uçlu bir mikropipet kullanarak pistil girişine büyüme ortamı ekleyin. Diğer kuyuları aynı ortamla yükleyin. Kanalların dolması için birkaç dakika bekleyin.

Bu arada, yerel nemin korunmasına yardımcı olmak için tabağa nemli bir kağıt havlu koyun. Şimdi, bir T.fournieri mavi ve beyaz çiçeğinden polen taneleri toplayın. Taneleri bir diseksiyon iğnesi kullanarak stigma üzerine aktarın.

Daha sonra, bir santimetre uzunluğunda tozlaşan bir stili uzunlamasına kesin ve ardından kesilen stili mikroakışkan cihazın girişine yerleştirin. Kesim stili cımbızla mikroakışkan cihazın girişine yerleştirildiğinde, stile zarar verebileceği için stili çok sıkı tutmamak önemlidir. Ardından, bant kullanarak tabağın üzerine bir kapak sabitleyin ve tabağı 28 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın ve burada beş ila altı saat karanlıkta kalması gerekir.

Laminer akış başlığı altında çalışarak, transgenik A.thaliana Columbia tohumlarını sterilize ederek başlayın. Onları beş dakika boyunca temizleme solüsyonunda bekletin. Daha sonra tohumları otoklavlanmış suda iyice durulayın.

Sterilize edildikten sonra, tohumları 48 saat karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Birkaç gün sonra, kullanmadan önce mikro cihazın gazını 20 dakika boyunca boşaltın. Daha sonra, uygun büyüme ortamını ince uçlu bir pipet kullanarak cihazın kuyucuklarına yükleyin ve çözeltinin tüm kanallardan çekilmesi için birkaç dakika bekleyin.

Ayrıca, nemi korumak için tabağın üzerine biraz nemli kağıt havlu yükleyin. Şimdi, hazırlanmış bir tohumu cihazın girişine aktarın. Ardından, kapağı bant kullanarak sabitleyin ve çanağı sürekli ışıklı 22 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın.

Kullanmadan önce, mikro cihazı gece boyunca UV altında sterilize edin. Ertesi gün, mikro cihazın gazını 20 dakika boyunca alın. Gazdan arındırıldıktan sonra, mikro kuyuları uygun büyüme ortamı ile yükleyin.

Kanallar yavaş yavaş dolarken, nemi korumak için mikro cihazı bir miktar otoklavlanmış su ile çevreleyin. Küçük bir parça yosun protonemata dokusunu mikro cihazın girişine aktarın. Şimdi, cihazı sürekli ışık altında 25 santigrat derecede kültürleyin.

İki ila üç haftalık büyümeden sonra, mikroskop altında sonuçların parlak alan görüntülerini alın. Uç büyüyen bitki hücreleri, büyüme yolları boyunca in vivo olarak, iletim yolunda ve mikropilde olduğu gibi, topraktaki kök kıllarının yolundan bahsetmiyorum bile, bir dizi fiziksel engelle karşılaşır. Sunulan mikroakışkan in vitro hücre kültürü platformları, üç tip bitki hücresinde, polen tüplerinde, kök kıllarında ve yosun protonematasında uç büyütme sürecinin incelenmesini sağlar.

Görüntüleme, cihazlardaki bir mikronluk boşluklar aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu boyuttaki mikro boşluklar kırılgan olduğundan, bazen özellikle tekrarlanan kullanımdan sonra kapanırlar. Bu nedenle, deneyleri gerçekleştirmeden önce boşlukların sağlam olduğunu doğrulamak önemlidir.

Polen tüpü çalışması için, polen tüplerinin apikal bölgesindeki morfolojik değişikliklerin yanı sıra son derece küçük bir alanla karşılaşmaya yanıt olarak vejetatif çekirdek ve sperm hücrelerini izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanıldı. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki hücresi biyolojisi alanındaki araştırmacıların, polen tüpleri, kök kılları ve yosun protonemataları gibi uç büyüyen bitki hücrelerinin son derece küçük bir alanda uzama kabiliyetini keşfetmelerinin yolunu açtı.