Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol

Bu mikrobiyolojik görüntüleme yönteminin genel amacı, farmakolojik tedavinin fenotipik etkilerini ayırt etmek için daha tanımlayıcı bir araç sağlamaktır. Bu nedenle, bu yöntem enfeksiyon hastalıkları alanında gerçekten yardımcı olabilir. Özellikle belirli antibiyotiklerin morfolojik etkileri ve C.Difficile'ı nasıl öldürdüğü incelenmektedir.

Bu tekniğin temel avantajı, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi in vitro hücre kültürü teknikleriyle birleştirerek farmasötik öldürme etkisine dair ayrıntılı bir bakış sunmasıdır. Bu tekniğin kullanımı, Clostridium difficile enfeksiyonu veya kısaca CDI tedavisine kadar uzanabilir. Bunun nedeni, bu tekniğin bir antibiyotiğin CDI tedavisinde nasıl faydalı olabileceğini belirlemek için bir araç sağlayabilmesidir.

Bu yöntem farmakolojik etki hakkında bilgi sağlayabilse de, karma kültür modeli veya in vivo hayvan çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, C.difficile kültürü oluşturmak ve bir taramalı elektron mikroskobu çalıştırmak zor olduğu için kişiler bu yeni yöntemde zorluk yaşamaktadır. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, farklı antibiyotiklerin etki mekanizmalarını ayırt etmeye çalışırken edindik.

Sizi bugün tanışacağınız araştırma ekibiyle tanıştırmak isterim. Jahangir Alam bir profesör ve mikrobiyologdur. Bugün göreceğiniz tüm laboratuvar faaliyetlerini o koordine etmektedir.

Tasnuva Rashid laboratuvarda lisansüstü öğrencisidir. Günlük mikrobiyoloji çalışmalarının çoğunu o yürütmektedir. Eugenie Bassere ise doktora sonrası araştırmacıdır.

Tasnuva'ya birçok beceriyi gerçekten öğretti ve ayrıca laboratuvarda yardımcı oluyor. Brad Endres laboratuvardaki bir diğer doktora sonrası araştırmacıdır. Long Chang'ın yardımıyla birçok mikroskopi çalışması gerçekleştirecek.

Steril eldivenler giyili durumdayken çevresel izolatlar hazırlamak için, yer, kapı, kol veya raf gibi ilgilenilen herhangi bir alanın yüzeyini önceden sterilize edilmiş pamuklu bir gazlı bezle silin. Ardından sürüntü çubuğunu sterilize edilmiş bir tüpe yerleştirin. Numuneler arasında eldivenleri değiştirin.

Klinik izolatları hazırlamak için, bir ekim özesi kullanarak 10 ila 100 miligram klinik dışkı örneğini cefoxitin cycloserine fructose agar (veya CCFA) üzerine ekim yapın ve örnekleri sıkı anaerobik koşullar altında 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. C.Difficile stokunun izole edilen kolonilerini, daha sonraki analizler için -80 °C'deki kriyoviyallerde saklayın. Çevresel sürüntü örneklerini, %0,5 sodyum taurokolat içeren beyin kalp infüzyonu (veya BHI) besiyerinde zenginleştirin ve örnekleri beş gün boyunca 37 °C'deki bir anaerobik kamaraya yerleştirin.

Kültürün bir mililitresini 10,000 ×g'de santrifüjleyin ve pelletin yeniden süspansiyonu için 100 µL etanol kullanın. Yeniden süspanse edilen hücrelerin 50 µL'sini CCFA plaklarına ekin ve kültürleri bir anaerobik kamarada 37 °C'de 40 ila 48 saat inkübe edin. İzole edilen C.difficile stok kolonilerini, ileri analizler için -80 °C'de kriyoviyallerde saklayın.

Şüpheli C.difficile kolonilerini test etmek için lateks aglütinasyon reaktifi veya PCR kullanın. Saflaştırılmış çevresel veya klinik C.difficile suşlarını, anaerobik bir kamarada, 37 degrees Celsius sıcaklıkta 48 saat boyunca kanlı agar plaklarında büyütün. Tek bir izole koloniyi almak için bir ekim özesi kullanın ve koloniyi 15 milliliter'lik bir tüpteki beş milliliters BHI besiyerine aktarın.

Ardından, kültürü anaerobik bir bölmede 37 °C'de 24 saat boyunca büyütün. Ön kültürleri, yaklaşık 10⁶ CFU/mL olacak şekilde 1:100 oranında seyreltmek için sodyum taurokolat ve uygun konsantrasyonda antibiyotik eklenmiş taze, önceden indirgenmiş BHIS kullanın. Bir pipet yardımıyla her zaman noktasında bir mililitrelik örnek toplayın ve küçük bir alikotu kanlı agar plakasına ekin veya yayın.

Plakayı 37 °C'de, anaerobik bir oda içerisinde 48 saat boyunca inkübe edin ve CFU'ları belirlemek için oluşan koloni sayısını sayın. Her zaman noktasından bir mililitre hücreyi mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 10.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkamak için PBS kullanın.

Numuneleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, hücreleri yeniden seyreltmek için 1 mL %4 paraformaldehit kullanın ve tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Numuneleri tekrar santrifüjleyip süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 100 µL distile su ile yeniden seyreltmeden önce distile su kullanarak iki kez yıkayın.

Hacmi çözeltinin bulanıklığına göre ayarlayın. Lamel üzerine etiketleme yaptıktan sonra, üzerlerine 40 µL örnek ekleyin. Sıvının buharlaşması ve hücrelerin cama yapışması için lamelleri bir steril kabin içinde 15 dakika boyunca inkübe edin.

Hala sıvı mevcutsa, bunu uzaklaştırmak için bir hava üfleyici kullanın. Lamel yükselticileri bir masaüstü püskürtme cihazına yerleştirin ve bantla sabitleyin. Püskürtme cihazına saf altın yerleştirin.

Ardından cihazı açın ve düşük basınçta sıçratma (sputtering) işlemine başlayın. Hücreleri 80 microamperes akımda 30 saniye boyunca kaplayın; bu, 20 nanometers altın kaplamaya karşılık gelir. Görüntüleme işlemine başlamak için, önce bilgisayar yazılımındaki Vent düğmesine basarak SEM'in havasını uygun şekilde boşaltın.

Hücreleri kapladıktan sonra, onları taramalı elektron mikroskobuna (SEM) aktarın. Karbon bant kullanarak, kaplanmış lamel camları metal tablaya sabitleyin. SEM vakumu boşaltıldığında, kapak kolayca açılacaktır.

Metal sahneyi vidalayarak SEM haznesine sabitleyin. Ardından, yazılımdaki Pump düğmesine tıklayın. Sistem onay verdiğinde, SEM kullanıma hazır olacaktır.

Detector sekmesi altında, SE dedektörüne tıklayın. Voltaj değerini gösteren düğmeye tıklayarak demeti açın. Voltajı artırmadan önce düşük bir voltajda görüntüleme yapmaya başlayın.

Işın açıldıktan sonra bir görüntü belirecektir. İzleme fonksiyonunu kullanarak, kaplamalı lameller üzerinde görüntüleme yapılacak bir alan bulun. Bölgeye yakınlaşın ve Clostridium difficile'yi temsil eden çubuk şekilli yapıları bulun.

Sistemi kalibre etmek için yakınlaştırma yapın, görüntüyü kaba odakla ayarlayın ve Z eksenini serbest çalışma mesafesine bağlayın. Bu işlem, 15, 9 ve 5 milimetre gibi birden fazla çalışma mesafesinde gerçekleştirilmelidir. Ardından ultra yüksek çözünürlüklü görüntüleme moduna geçin.

Yüksek büyütmede odaklama yapmaya başlamak için kaba ve ince odak ayar düğmelerini kullanın. Daha net bir görüntü için astigmatizma düğmelerini ayarlayın ve bilgisayar yazılımını kullanarak görüntüye dijital olarak yakınlaştırıp netliği kontrol edin. Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için yavaş tarama modunu kullanın.

Toplanan görüntüyü, analiz sırasında ölçümler yapılacaksa veri çubuğunun seçili olduğundan emin olarak, daha sonraki analizler için bir tiff dosyası olarak kaydedin. SEM'de tablasını eğerek daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak için farklı açılardan görüntüler toplayın. Yavaş tarama görüntüsü toplamadan önce odaklama ve astigmatizmayı optimize edin.

Görüntüleme tamamlandıktan sonra ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 milimetreye yükseltin. Ardından hazneyi havalandırın ve numune tablasını çıkarın. Görüntüleri işleyin, görüntü dosyalarını Fiji'de açın.

Çizgi işlevini kullanarak ölçek çubuğunu hassas bir şekilde çizin. Analyze sekmesine tıklayın; ardından Select Scale işlevini seçin. Ölçek çubuğuna göre bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere açılacaktır.

Uzunluk birimini de değiştirin ve Tamam'a tıklayın. Son olarak, hücre uzunluğunu ölçmek için hücrenin tamamını izlemek üzere çizgi işlevini kullanın. Tekrar Analiz sekmesini seçin ve ardından ölç düğmesine tıklayın.

Uzunluk, daha önce belirtilen birimlerle görünmelidir. Bu görüntüler, büyüme eğrisinin eksponansiyel fazı sırasında yakalanan C.difficile vejetatif hücrelerini ve ayrıca spor hücrelerini göstermektedir. Vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılardır; sporlar ise pürüzlü bir dış yüzeye sahip küçük oval yapılardır.

Bu şekilde gösterildiği üzere, kontrol hücreleri büyümekte ve bir platoya ulaşmaktadır; buna karşın, vankomisin ve metronidazol antibiyotikleri ile tedavi edilen hücrelerin toplam CFU değerleri saptama sınırına kadar düşerek bakterisidal bir etki olduğunu göstermektedir. Kanıtlandığı üzere, vankomisin ve metronidazol, süper MIC konsantrasyonlarında C.difficile'i öldürmede etkilidir. C.difficile görüntülemede SEM kullanımının faydasını göstermek için, morfolojinin nasıl değiştiğini belirlemek amacıyla hücreler ilaç tedavisinden önce ve sonra görüntülenmiştir.

Vankomisin durumunda, hücre duvarlarının bir kısmı etkilenmiş ve metronidazol ile işlem görmüş bazı hücrelerin boyutları daha küçük kalmıştır. Hücre boyutunun etkilenip etkilenmediğini test etmek için, hücre uzunluğu Fiji programı kullanılarak analiz edilmiştir. Bu görüntüde gösterildiği üzere, kontrol grubunda vejetatif hücre boyutu bir miktar değişkenlik gösterebilir; ancak çoğunluğu yaklaşık 6 µm uzunluğundadır.

Bununla birlikte, bu grafikte gösterildiği üzere, hücre uzunluğu metronidazol ile işlem görmüş hücrelerde etkilenmiş, ancak vankomisin ile işlem görmüş hücrelerde etkilenmemiştir. Bu teknik bir kez kavrandığında, iki günden kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, kaplama ve görüntüleme işlemlerinden önce örneğinizin fikse edildiğinden ve tamamen kuru olduğundan emin olmanız önemlidir.

Bu prosedürü takiben, bakterilerin antibiyotik tedavilerine nasıl tepki vereceği gibi ek soruları yanıtlamak için ek yöntemler uygulayabiliriz; bu durum, örneğin, antibiyotiklerin etki mekanizmalarının anlaşılmasına dair daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu tekniğin muazzam bir potansiyeli vardır ve mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların Clostridium difficile fizyolojisini ve farmakolojisini daha derinlemesine keşfetmelerine yol açabilir. Umarım bugün bu videoyu izlemekten keyif almışsınızdır.

Umarım buradan kazandıklarınız; C.difficile hücrelerinin nasıl büyütülüp karakterize edileceği, antibiyotiklerin C.Difficile üzerindeki öldürme kinetiğinin nasıl inceleneceği ve ardından yüksek seviyeli mikroskopi kullanarak bu öldürme modelleriyle ilişkili morfolojik değişikliklerin nasıl değerlendirileceği olmuştur. Clostridium difficile ile çalışırken, ekstra önlemler almalı ve tüm koruyucu