Name: Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol Clostridium difficile Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Keşfedin, taramalı elektron mikroskobu ve in vitro hücre kültürü teknikleriyle Clostridium difficile üzerinde antibiyotiklerin morfolojik etkilerini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, enfeksiyon hastalıklarında tedavi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu deneyler Merck and Co. ve Summit, PLC'den araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

1. Farklı çevre veya klinik kaynaklardan C. difficile&#39;nin izolasyonu <ol><li> Çevresel izolatlar: Önceden sterilize edilmiş bir pamuk göstergesi (hafifçe 0,85% NaCl ile ıslatılmış) kullanarak herhangi bir alanın yüzeyini (zemin, kapı, kol, raf vb. ) Sürünüz. 8 Steril eldiven giydiğinizden ve svabın tamamlandıktan sonra sterilize edilmiş bir tüpe konulduğundan emin olun. </li><li> Klinik izolatlar (dışkı): Bir aşılama döngüsünü kullanarak 10 ila 100 mg klinik dışkı örnekleri plakositit sikloserin-fruktoz agar (CCFA) üzerine plakaya alın ve 48 - 72 saat katı anaerobik koşullar altında inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C&#39;de cryovials&#39;de saklayın. 7 , 9 , 10 </li><li> Beyinde kalp infüzyonu (BHI) sosundaki çevresel swab örneklerini% 0.05 sodyum taurokolat ile zenginleştirin ve 37 ° C&#39;de anaerobik bir bölmeye yerleştirin5 gün boyunca. 10,000 xg&#39;de kültürün 1 mL&#39;sini santrifüjleyin ve pelleti 100 uL etanol içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yeniden süspanse hücreleri (50 mcL) sikloserinecefoxitin fruktoz agar (CCFA) plakaları üzerine plak ve 40 - 48 saat boyunca 37 ° C bir anaerobik odada inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C&#39;de cryovials&#39;de saklayın. </li><li> Şüpheli C. difficile kolonilerini lateks aglutinasyon reaktifi veya PCR kullanarak test edin. </li></ol> 2. C. difficile Kültürü ve Kinetik Prosedürleri Öldürme <ol><li> Saflaştırılmış çevresel veya klinik C. difficile suşlarını kan agar plakalarında, anaerobik bölmede 37 ° C&#39;de 48 saat büyütün. </li><li> Bir izole edilmiş koloni bir inokülasyon döngüsü ile alın, 15 mL&#39;lik bir tüp içinde 5 mL BHI ortamına aktarın ve 37 ° C&#39;de anaerobik bölmede 24 saat büyür. </li><li> Kültür öncesi 1: 100&#39;ü yaklaşık 10 6 koloni oluşturan birime inceltin% 0.1 sodyum taurokolat ve uygun antibiyotik konsantrasyonu (T0) ile takviye edilmiş taze ön indirgenmiş BHIS (BHI artı 5 g / L maya ekstraktı ve% 1 L-sistein) içinde s (CFU) / mL. </li><li> Her zaman noktasında (T0, T6, T24, T48) bir pipetle 1 mL numune toplayın ve bir kan agar plakasına küçük bir alikuot (seri seyreltmelerde 100 uL) yayın. Hücreler, 37 ° C&#39;de anaerobik bir odada 48 saat süreyle kan agar plakasında büyümelerine ve sonuç olarak CFU&#39;yu belirlemek için kolonilerin sayısının saymasına izin verin. </li></ol> 3. Taramalı Elektron Mikroskopisi için Numunelerin Hazırlanması <ol><li> Mikrosantrifüj tüpleri her zaman noktasından 1 ml hücre toplayın ve 10 dakika için 10,000 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri PBS&#39;de yıkayın. </li><li> Örnekleri 10.000 xg&#39;de tekrar 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 1 mL% 4 paraformaldehid içinde hücreleri tekrar seyreltin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Numuneleri 1&#39;de 10 dakika santrifüjleyin0,000 xg ve süpernatantı atın. Hücreleri damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve 100 uL damıtılmış su içinde yeniden doyurun. Solüsyonun bulanıklığına bağlı olarak hacmi ayarlayın. NOT: Birden fazla seri seyreltme yapmak iyi bir fikirdir. </li><li> Lamelleri etiketleyin ve üzerinde 40 μL örnek ekleyin. Sıvı buharlaştırmak ve hücrelerin lamel bağlı kalmasına izin vermek için bir akış davlumbaz 15 dakika inkübe edin. Sıvı hala mevcutsa, sıvıyı çıkarmak için bir üfleyici kullanın. </li><li> Etiketli lamelleri hücrelerle birlikte masa üstü püskürtme makinesine yerleştirin ve bandı bantlayın. Püskürtme makinesinde saf altını koruyun. Makineyi açın ve düşük basınçta (50 mTorr) püskürtme işlemine başlayın. 80 mA&#39;de 30 saniye boyunca kaplayın, bu da 20 nm altın kaplamaya dönüşür. </li><li> Kaplanmış hücreleri taramalı elektron mikroskopuna aktarın. </li></ol> 4. Taramalı Elektron Mikroskopta C. difficile Hücrelerini Görüntüleme <ol><li> Tarama elektron mikroskobunu (SEM) pr tarafından uygun şekilde havalandırınBilgisayar yazılımındaki havalandırma düğmesine basarak. </li><li> Karbon bant kullanarak, kaplı lamelleri metal sahne üzerine sabitleyin. SEM havalandıktan sonra, kapı kolayca açılmalıdır. Metal etabı SEM odasına vidalayarak kilitleyin. </li><li> Bilgisayar yazılımındaki PUMP düğmesini tıklayın. Sistem &quot;Vac OK&quot; yazısını okuduğunda SEM kullanılabilir. </li><li> Dedektörler sekmesinin altındaki SE dedektörünü tıklayın. Voltajı gösteren düğmeyi tıklayarak kirişi açın. Gerilimi arttırmadan önce görüntülemeyi daha düşük bir voltajda (5 kV) başlatın (15 kV&#39;a kadar). Işın açıldıktan sonra bir görüntü belirir. </li><li> İzleme işlevini kullanarak, görüntü için kaplamalı lamelleri üzerinde bir alan bulun. Bölgeyi büyütüp çubuk şeklinde yapılar bulmak; Bunlar clostridium difficile . </li><li> Sistemi kalibre etmek için görüntüyü yakınlaştırın ve odaklanın. Bu, çoklu çalışma mesafelerinde yapılmalıdır: 15, 9 ve 5 mm. Çalışma mesafesi 5 mm olan görüntü. </li><li> Seni açLtra yüksek çözünürlüklü görüntüleme modu ile odaklanır ve astigmatizmayı yoğunlaştırmaya ve optimize etmeye başlar. </li><li> Yüksek büyütme noktasına odaklanmaya başlayın. Bunun için kaba ve ince odak geçişlerini kullanın. Astigmatizmayı daha net bir görüntü elde etmek için de ayarlayın. <ol><li> Astigmatizmayı yüksek büyütmede ayarlayın. Bunu yapmak için, astigmatizm geçişlerini ayarlayın (ince / kaba odak geçişlerine benzer) ve bilgisayar yazılımını dijital olarak yakınlaştırarak netlik için görüntüyü kontrol edin. </li></ol></li><li> Yüksek kaliteli bir görüntü toplamak için yavaş tarama işlevini seçin. Toplanan görüntüyü, analiz için kullanılacak .TIFF dosyası olarak kaydedin. Analizler sırasında ölçümler yapılacaksa, veri çubuğunun seçili olduğundan emin olun. </li><li> Farklı açılardaki (52 ° &#39;ye kadar) görüntüleri direkt olarak SEM üzerinde döndürerek elde edin Açılı görüntüler daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak eğilimindedir. </li><li> Görüntüleme yapılan hücrelere bağlı olarak ışın voltajını değiştirin. Bunu tüm deneyler için çoğunlukla 5 - 15 kV arasında tutun. </li&gt; <li> Görüntüleme tamamlandıktan sonra ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 mm&#39;ye yükseltin. Daha sonra hazne havalandırılabilir ve sahne çıkarılabilir. Daha fazla analiz için tüm görüntüleri bir sürücüye kopyalayın. </li></ol> 5. Görüntü İşleme ve Analiz <ol><li> Ücretsiz olarak bulunan FIJI (http://fiji.sc) yazılımını bilgisayara indirin ve yükleyin. </li><li> Resim dosyasını FIJI&#39;da açın. </li><li> Çizgi işlevini kullanarak, ölçek çubuğunu tam olarak izleyebilirsiniz. </li><li> FIJI programındaki Analiz sekmesini tıklayın ve nihayet Ölçeği Seç işlevini seçin. Ölçek çubuğuna dayalı bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere belirecektir. Uzunluğu birimi de değiştirin ve Tamam&#39;ı tıklayın. </li><li> Artık program mesafe için kalibre edildi, hücre uzunluğunu ölçmek için hat fonksiyonunu kullanın. Uzunluğu elde etmek için hücrenin tamamını izlemek için line fonksiyonunu kullanın. Çözümle sekmesini tekrar seçin ve ardından Ölçüm&#39;e tıklayın. Uzunluk uygulaması olmalıdırDaha önce belirtilen birimlerdeki kulak. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG, Merck & Co. ve Summit, PLC'den geçmiş ve mevcut araştırma desteği almıştır.

Bu çalışmanın amacı, C. difficile&#39;yi izole etmek için yüksek verimli bir yöntem oluşturmak ve antibiyotik farmakolojik etkisinin daha kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi için bir araç olarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak antibiyotik duyarlılığını test etmektir. Burada özetlenen protokolleri kullanarak, hücrenin antibiyotik tedavisine fenotipik tepki görüntülemenin ilacın farmakolojik etkisine dair bilgiler sağlayabileceğini gösterdik. Toplamda, bu protokolün görüntüleme kısmı,...

Clostridium difficile , gram pozitif, spor oluşturan bir bakteridir ve ABD&#39;de yılda yaklaşık 500.000 enfeksiyona neden olur ve en yüksek risk seviyesi olan Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından bir tehdit seviyesi acil patojen olarak değerlendirilir. Son on yılda, C. difficile&#39;ye karşı aktivite gösteren antimikrobiyallerde önemli ilaç geliştirme görüldü . 2 , 3 İn vitro çalışmalar ilaç geliştirme sürecinin gerekli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, in vitro duyarlılık ve zaman öldürme çalışmaları gelecek hayvan ve diğer in vivo çalışmaların geçerliliğini doğrulamak için kullanılır. Bu yöntemler öldürme eylemini değerlendirmek için önemli bir rol oynamakla birlikte, hücrelerin farmakolojik tedaviye fenotipik tepki vermezler. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) standart ile birleştirilerekKinetik çalışmaları öldürdüğünde, antibiyotik direkt etkilerinin daha ayrıntılı bir şekilde tanımlanması mümkündür. 5 , 6 , 7 Burada, SEM&#39;in antibiyotik tedavisinin etkililiğini gösteren bir araç olarak kullanıldığı bir yöntem sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>pamuklu gazlı bez ve nbsp;</td><td>PRM21408C</td><td></td> <td>NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI)&nbsp;</td><td>Kriter</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>maya özü</td><td>Kriter</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>sodyum taurokolat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>anaerobik oda</td><td>Coy</td><td></td><td>vinil anaerobik oda</td></tr><tr><td>sicloserinecfoxitin fruktoz agar (CCFA) plakaları</td><td>Anaerob sistemleri</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>kan agar plakaları</td><td>Hardy teşhis</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>lateks aglütinasyon reaktifi</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diferansiyel test kiti</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop slaytları</td><td>J. Melvin freed marka</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>akış davlumbaz</td><td>Labconco</td><td>Sınıf II tip A2&nbsp;</td><td>Biyogüvenlik Kabini</td></tr><tr><td>masa püskürtme makinesi</td><td>Denton Vakum Masası</td><td>II</td><td></td></tr><tr><td>bant</td><td>Plastik Çekirdek</td><td>05072-AB</td><td>SPI Çift Taraflı Yapışkanlı Karbon Bant</td></tr><tr><td>altın</td><td>Denton Vakum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375 " Çap x .002 " Kalın Altın folyo</td></tr><tr><td>taramalı elektron mikroskobu</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

morfolojik değişiklikleri karakterize eden bir protokol<em&gt; clostridium difficile</em&gt; antibiyotik tedavisine yanıt vermek

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Anaerobik bakterilere yönelik yeni ilaç geliştirme ile antibiyotik eyleminin değerlendirilmesi zor ve teknik olarak zorunludur. Olası MOA&#39;yı anlamak için antibiyotik maruziyeti ile ilişkili morfolojik değişiklikler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak görüntülenebilir. SEM görüntülemeyi geleneksel öldürme eğrileri ile bütünleştirmek ilaç eylemi konusundaki görüşümüzü geliştirebilir ve ilaç geliştirme sürecini ilerletebilir. Bu önceliği test etmek için, eğrileri öldürün ve SEM çalışmaları, bilinen fakat farklı MOA&#39;lı (vankomisin ve metronidazol) ilaçlarla gerçekleştirildi. C. difficile hücreleri (R20291) 48 saate kadar antibiyotik varlığında veya yokluğunda yetiştirildi. 48 saatlik aralık boyunca, antibiyotik etkinliğini belirlemek ve SEM&#39;de görüntüleme yapmak için hücreler çoklu zaman noktalarında toplandı. Önceki raporlarla uyumlu olarak, vankomisin ve metronidazolün, koloni oluşturan birim (CFU) konseyleri ile ölçülen 24 saatlik tedaviyi takiben önemli miktarda bakterisid aktivitesi vardıting. SEM görüntüleme yöntemini kullanarak, metronidazolün, kontroller ve vankomisin ile karşılaştırıldığında hücre uzunluğu (her bir antibiyotik için hücre uzunluğunda&gt;% 50 azalma; P &lt;0.05) üzerine önemli etkileri olduğunu saptadık. İlaç tedavisine fenotipik tepki daha önce bu şekilde belgelenmemesine karşın, ilacın MOA&#39;sıyla tutarlıdır ve görüntüleme ve ölçümlerin çok yönlülüğü ve güvenilirliği ile bu tekniğin diğer deneysel bileşikler için uygulanmasını göstermektedir.

Clostridium difficile , spor oluşturan bir bakteridir ve bu nedenle herhangi bir fonksiyonel analizden önce vejetatif ve spor hücreleri arasındaki morfoloji farklılıklarını belirlemek esastır. Şekil 1 , büyüme eğrisinin üstel fazında ve spor hücrelerinde yakalanan vejetatif hücrelerin temsili görüntülerini göstermektedir. Resimde görüldüğü gibi vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılarken, sporlar kaba bir dış görünümü olan küçük oval yapılardır....

Antibiyotik etkinliği en yaygın olarak öldürme kinetik çalışmaları yapılarak ve koloni oluşturma birimleri (CFU'lar) ölçülerek belirlenir. Taramalı elektron mikroskobunu (SEM) bu standart yöntemlerle entegre ederek, tedavinin farmakolojik etkilerini farklı antibiyotikler arasında ayırt edebiliriz.

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Bu mikrobiyolojik görüntüleme yönteminin genel amacı, farmakolojik tedavinin fenotipik etkilerini ayırt etmek için daha tanımlayıcı bir araç sağlamaktır. Bu nedenle, bu yöntem enfeksiyon hastalıkları alanında gerçekten yardımcı olabilir. Özellikle belirli antibiyotiklerin morfolojik etkileri ve C.Difficile'ı nasıl öldürdüğü incelenmektedir.Bu tekniğin temel avantajı, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi in vitro hücre kültürü teknikleriyle birleştirerek farmasötik öldürme etkisine dair ayrıntılı bir bakış sunmasıdır. Bu tekniğin kullanımı, Clostridium difficile enfeksiyonu veya kısaca CDI tedavisine kadar uzanabilir. Bunun nedeni, bu tekniğin bir antibiyotiğin CDI tedavisinde nasıl faydalı olabileceğini belirlemek için bir araç sağlayabilmesidir.Bu yöntem farmakolojik etki hakkında bilgi sağlayabilse de, karma kültür modeli veya in vivo hayvan çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, C.difficile kültürü oluşturmak ve bir taramalı elektron mikroskobu çalıştırmak zor olduğu için kişiler bu yeni yöntemde zorluk yaşamaktadır. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, farklı antibiyotiklerin etki mekanizmalarını ayırt etmeye çalışırken edindik.Sizi bugün tanışacağınız araştırma ekibiyle tanıştırmak isterim. Jahangir Alam bir profesör ve mikrobiyologdur. Bugün göreceğiniz tüm laboratuvar faaliyetlerini o koordine etmektedir.Tasnuva Rashid laboratuvarda lisansüstü öğrencisidir. Günlük mikrobiyoloji çalışmalarının çoğunu o yürütmektedir. Eugenie Bassere ise doktora sonrası araştırmacıdır.Tasnuva'ya birçok beceriyi gerçekten öğretti ve ayrıca laboratuvarda yardımcı oluyor. Brad Endres laboratuvardaki bir diğer doktora sonrası araştırmacıdır. Long Chang'ın yardımıyla birçok mikroskopi çalışması gerçekleştirecek.Steril eldivenler giyili durumdayken çevresel izolatlar hazırlamak için, yer, kapı, kol veya raf gibi ilgilenilen herhangi bir alanın yüzeyini önceden sterilize edilmiş pamuklu bir gazlı bezle silin. Ardından sürüntü çubuğunu sterilize edilmiş bir tüpe yerleştirin. Numuneler arasında eldivenleri değiştirin.Klinik izolatları hazırlamak için, bir ekim özesi kullanarak 10 ila 100 miligram klinik dışkı örneğini cefoxitin cycloserine fructose agar (veya CCFA) üzerine ekim yapın ve örnekleri sıkı anaerobik koşullar altında 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. C.Difficile stokunun izole edilen kolonilerini, daha sonraki analizler için -80 °C'deki kriyoviyallerde saklayın. Çevresel sürüntü örneklerini, %0,5 sodyum taurokolat içeren beyin kalp infüzyonu (veya BHI) besiyerinde zenginleştirin ve örnekleri beş gün boyunca 37 °C'deki bir anaerobik kamaraya yerleştirin.Kültürün bir mililitresini 10,000 ×g'de santrifüjleyin ve pelletin yeniden süspansiyonu için 100 µL etanol kullanın. Yeniden süspanse edilen hücrelerin 50 µL'sini CCFA plaklarına ekin ve kültürleri bir anaerobik kamarada 37 °C'de 40 ila 48 saat inkübe edin. İzole edilen C.difficile stok kolonilerini, ileri analizler için -80 °C'de kriyoviyallerde saklayın.Şüpheli C.difficile kolonilerini test etmek için lateks aglütinasyon reaktifi veya PCR kullanın. Saflaştırılmış çevresel veya klinik C.difficile suşlarını, anaerobik bir kamarada, 37 degrees Celsius sıcaklıkta 48 saat boyunca kanlı agar plaklarında büyütün. Tek bir izole koloniyi almak için bir ekim özesi kullanın ve koloniyi 15 milliliter'lik bir tüpteki beş milliliters BHI besiyerine aktarın.Ardından, kültürü anaerobik bir bölmede 37 °C'de 24 saat boyunca büyütün. Ön kültürleri, yaklaşık 10⁶ CFU/mL olacak şekilde 1:100 oranında seyreltmek için sodyum taurokolat ve uygun konsantrasyonda antibiyotik eklenmiş taze, önceden indirgenmiş BHIS kullanın. Bir pipet yardımıyla her zaman noktasında bir mililitrelik örnek toplayın ve küçük bir alikotu kanlı agar plakasına ekin veya yayın.Plakayı 37 °C'de, anaerobik bir oda içerisinde 48 saat boyunca inkübe edin ve CFU'ları belirlemek için oluşan koloni sayısını sayın. Her zaman noktasından bir mililitre hücreyi mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 10.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkamak için PBS kullanın.Numuneleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, hücreleri yeniden seyreltmek için 1 mL %4 paraformaldehit kullanın ve tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Numuneleri tekrar santrifüjleyip süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 100 µL distile su ile yeniden seyreltmeden önce distile su kullanarak iki kez yıkayın.Hacmi çözeltinin bulanıklığına göre ayarlayın. Lamel üzerine etiketleme yaptıktan sonra, üzerlerine 40 µL örnek ekleyin. Sıvının buharlaşması ve hücrelerin cama yapışması için lamelleri bir steril kabin içinde 15 dakika boyunca inkübe edin.Hala sıvı mevcutsa, bunu uzaklaştırmak için bir hava üfleyici kullanın. Lamel yükselticileri bir masaüstü püskürtme cihazına yerleştirin ve bantla sabitleyin. Püskürtme cihazına saf altın yerleştirin.Ardından cihazı açın ve düşük basınçta sıçratma (sputtering) işlemine başlayın. Hücreleri 80 microamperes akımda 30 saniye boyunca kaplayın; bu, 20 nanometers altın kaplamaya karşılık gelir. Görüntüleme işlemine başlamak için, önce bilgisayar yazılımındaki Vent düğmesine basarak SEM'in havasını uygun şekilde boşaltın.Hücreleri kapladıktan sonra, onları taramalı elektron mikroskobuna (SEM) aktarın. Karbon bant kullanarak, kaplanmış lamel camları metal tablaya sabitleyin. SEM vakumu boşaltıldığında, kapak kolayca açılacaktır.Metal sahneyi vidalayarak SEM haznesine sabitleyin. Ardından, yazılımdaki Pump düğmesine tıklayın. Sistem onay verdiğinde, SEM kullanıma hazır olacaktır.Detector sekmesi altında, SE dedektörüne tıklayın. Voltaj değerini gösteren düğmeye tıklayarak demeti açın. Voltajı artırmadan önce düşük bir voltajda görüntüleme yapmaya başlayın.Işın açıldıktan sonra bir görüntü belirecektir. İzleme fonksiyonunu kullanarak, kaplamalı lameller üzerinde görüntüleme yapılacak bir alan bulun. Bölgeye yakınlaşın ve Clostridium difficile'yi temsil eden çubuk şekilli yapıları bulun.Sistemi kalibre etmek için yakınlaştırma yapın, görüntüyü kaba odakla ayarlayın ve Z eksenini serbest çalışma mesafesine bağlayın. Bu işlem, 15, 9 ve 5 milimetre gibi birden fazla çalışma mesafesinde gerçekleştirilmelidir. Ardından ultra yüksek çözünürlüklü görüntüleme moduna geçin.Yüksek büyütmede odaklama yapmaya başlamak için kaba ve ince odak ayar düğmelerini kullanın. Daha net bir görüntü için astigmatizma düğmelerini ayarlayın ve bilgisayar yazılımını kullanarak görüntüye dijital olarak yakınlaştırıp netliği kontrol edin. Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için yavaş tarama modunu kullanın.Toplanan görüntüyü, analiz sırasında ölçümler yapılacaksa veri çubuğunun seçili olduğundan emin olarak, daha sonraki analizler için bir tiff dosyası olarak kaydedin. SEM'de tablasını eğerek daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak için farklı açılardan görüntüler toplayın. Yavaş tarama görüntüsü toplamadan önce odaklama ve astigmatizmayı optimize edin.Görüntüleme tamamlandıktan sonra ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 milimetreye yükseltin. Ardından hazneyi havalandırın ve numune tablasını çıkarın. Görüntüleri işleyin, görüntü dosyalarını Fiji'de açın.Çizgi işlevini kullanarak ölçek çubuğunu hassas bir şekilde çizin. Analyze sekmesine tıklayın; ardından Select Scale işlevini seçin. Ölçek çubuğuna göre bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere açılacaktır.Uzunluk birimini de değiştirin ve Tamam'a tıklayın. Son olarak, hücre uzunluğunu ölçmek için hücrenin tamamını izlemek üzere çizgi işlevini kullanın. Tekrar Analiz sekmesini seçin ve ardından ölç düğmesine tıklayın.Uzunluk, daha önce belirtilen birimlerle görünmelidir. Bu görüntüler, büyüme eğrisinin eksponansiyel fazı sırasında yakalanan C.difficile vejetatif hücrelerini ve ayrıca spor hücrelerini göstermektedir. Vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılardır; sporlar ise pürüzlü bir dış yüzeye sahip küçük oval yapılardır.Bu şekilde gösterildiği üzere, kontrol hücreleri büyümekte ve bir platoya ulaşmaktadır; buna karşın, vankomisin ve metronidazol antibiyotikleri ile tedavi edilen hücrelerin toplam CFU değerleri saptama sınırına kadar düşerek bakterisidal bir etki olduğunu göstermektedir. Kanıtlandığı üzere, vankomisin ve metronidazol, süper MIC konsantrasyonlarında C.difficile'i öldürmede etkilidir. C.difficile görüntülemede SEM kullanımının faydasını göstermek için, morfolojinin nasıl değiştiğini belirlemek amacıyla hücreler ilaç tedavisinden önce ve sonra görüntülenmiştir.Vankomisin durumunda, hücre duvarlarının bir kısmı etkilenmiş ve metronidazol ile işlem görmüş bazı hücrelerin boyutları daha küçük kalmıştır. Hücre boyutunun etkilenip etkilenmediğini test etmek için, hücre uzunluğu Fiji programı kullanılarak analiz edilmiştir. Bu görüntüde gösterildiği üzere, kontrol grubunda vejetatif hücre boyutu bir miktar değişkenlik gösterebilir; ancak çoğunluğu yaklaşık 6 µm uzunluğundadır.Bununla birlikte, bu grafikte gösterildiği üzere, hücre uzunluğu metronidazol ile işlem görmüş hücrelerde etkilenmiş, ancak vankomisin ile işlem görmüş hücrelerde etkilenmemiştir. Bu teknik bir kez kavrandığında, iki günden kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, kaplama ve görüntüleme işlemlerinden önce örneğinizin fikse edildiğinden ve tamamen kuru olduğundan emin olmanız önemlidir.Bu prosedürü takiben, bakterilerin antibiyotik tedavilerine nasıl tepki vereceği gibi ek soruları yanıtlamak için ek yöntemler uygulayabiliriz; bu durum, örneğin, antibiyotiklerin etki mekanizmalarının anlaşılmasına dair daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu tekniğin muazzam bir potansiyeli vardır ve mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların Clostridium difficile fizyolojisini ve farmakolojisini daha derinlemesine keşfetmelerine yol açabilir. Umarım bugün bu videoyu izlemekten keyif almışsınızdır.Umarım buradan kazandıklarınız; C.difficile hücrelerinin nasıl büyütülüp karakterize edileceği, antibiyotiklerin C.Difficile üzerindeki öldürme kinetiğinin nasıl inceleneceği ve ardından yüksek seviyeli mikroskopi kullanarak bu öldürme modelleriyle ilişkili morfolojik değişikliklerin nasıl değerlendirileceği olmuştur. Clostridium difficile ile çalışırken, ekstra önlemler almalı ve tüm koruyucu

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Winston, J. A. ve diğerleri. Klâlis olarak Önemli Clostridium difficile Strain R20291 için sefoperazonla tedavi edilmiş fare modeli. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, enfekte bir fare modelinden alınan dışkı örneklerinde Clostridium difficile'nin seçici kültür teknikleriyle nicelendirilmesini göstermektedir. Numune toplama, anaerobik işlem, seri seyreltme ve koloni sayımı prosedürlerini özetleyerek bakteriyel kolonizasyon ve konak-patojen etkileşimlerini değerlendirir.

Enfekte Fare Modelinden Dışkı Örneklerinde Clostridium difficile'nin Nicelleştirilmesi

Bu video, bakteri hücrelerinde bir floresan antibiyotik probunun birikimini ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bir akış pompası inhibitörüne maruz kalmak, bakteri hücrelerinde transmembran proton gradyanını bozar ve bunun üzerine florofor konjuge bir antibiyotik eklenir. Bozulmuş proton gradyanı nedeniyle akış pompalarının inhibisyonu, antibiyotiğin bakteri içinde birikmesine neden olur. Bakteri hücreleri parçalanır ve antibiyotik birikimini doğrulamak için floresan yoğunluğu ölçülür.

Bakteri hücrelerinde bir floresan antibiyotik probunun birikimini ölçmek için bir test

Clostridium difficile sıkı anaerob ve antibiyotik ilişkili ishal (AAD) neden olan bir patojen bakteridir. Burada, izole edilmesi ve kültür C muhafaza edilmesi için yöntemler difficile bitkisel hücreleri ve sporlar açıklanmıştır. Bu teknikler optimum C için uygun koşulları sağlamak için düzenli bakım gerektirir, bir anaerobik odasını gerektiren difficile ekimi.

Kültürleme ve bakımı<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Bir Anaerobik Çevre

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Gerilme R20291

Bir 7-plex panel humoral bağışıklık yanıtlarını yüksek profil oluşturma saf insan sera içinde Clostridium difficile antijenleri için bu makalede basit protein mikroarray yöntemi açıklanır. Protokol spesifik antikor yanıt müstahzarları poliklonal intravenöz immünglobulin belirlenmesi için genişletilebilir.

Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Burada, Bacillus cereus'un kolit üzerindeki olumlu etkilerini düzenlemede bağırsak mikrobiyotasının rolünü araştırmak için antibiyotik kaynaklı yalancı mikrop içermeyen dekstran sülfat sodyum kaynaklı kolit fare modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Bacillus cereus Uygulamasının Kolit Üzerindeki Hafifletici Etkilerinin Bağırsak Mikrobiyota Modülasyonu ile Araştırılması

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Keşfedin, taramalı elektron mikroskobu ve in vitro hücre kültürü teknikleriyle Clostridium difficile üzerinde antibiyotiklerin morfolojik etkilerini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, enfeksiyon hastalıklarında tedavi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol

Daha fazla video keşfet