Bacillus cereus Uygulamasının Kolit Üzerindeki Hafifletici Etkilerinin Bağırsak Mikrobiyota Modülasyonu ile Araştırılması

Bu protokol, probiyotik takviyesinin sağlık üzerindeki çift yönlü düzenleyici etkisinin değerlendirilmesine ve istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlara olanak tanır. Probiyotikler için reseptör olarak mikropsuz farelerin kullanılmasında bazı laboratuvar sınırlamalarından kaçınmak için sözde mikropsuz fareler kullanılarak alternatif bir DSS kaynaklı kolit modeli oluşturulmuştur. Bu teknikte probiyotiklerin yararlı etkilerini araştırmak, kronik inflamatuar ilişkili bozuklukların semptomlarını hafifletmek için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için umut verici bir yaklaşımdır.

Başlamak için ampisilin, neomisin sülfat, metronidazol ve vankomisini içme suyunda çözerek bir antibiyotik kokteyli hazırlayın. Tamamen çözündükten sonra çözeltileri dört santigrat derecede saklayın. Antibiyotik kokteyl solüsyonlarını bir su şişesine koyun.

Antibiyotik solüsyonlarını ışıktan korumak için kahverengi şişeler kullandığınızdan veya şişeleri alüminyum folyo ile sardığınızdan emin olun. Şişeyi fare kafesinin üstüne yerleştirin. %2,5'lik bir dekstran sülfat sodyum çözeltisi yapmak için 2,5 gram DSS'yi 100 mililitre damıtılmış suda çözün.

Kolit model fare grubundaki içme suyunu %2,5 DSS solüsyonu ile değiştirin. B cereus'un koliti hafifletme üzerindeki olumlu etkisini değerlendirmek için, fareleri rastgele olarak aşağıdaki üç gruba, kontrol grubuna, DSS kaynaklı kolit modeline ve DSS ile indüklenen fareler için probiyotik B cereus takviyesine atayın. B cereus'un DSS kaynaklı kolit üzerindeki probiyotik etkilerini düzenlemede bağırsak mikrobiyotasının rolünü araştırmak için, fareleri rastgele aşağıdaki üç gruba, ABX/kontrol, ABX/DSS ve ABX/B cereus artı DSS'ye atayın.

Farelerin vücut ağırlığını, antibiyotik kokteylinin uygulanmasından sonra başlangıç ağırlığı olarak kaydedin. Erkek C 57 BL altı fareyi derhal yedi gün boyunca içme suyunda% 2.5 DSS solüsyonu ile tedavi edin. 900 mikrolitre steril normal salin ile doldurulmuş sekiz adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü hazırlayın.

100 mikrolitre logaritmik büyüme B cereus'u pipetleyin ve 900 mikrolitre steril normal salin içinde çözün. B cereus'u tüpler kullanarak seri olarak seyreltin. Her seyreltmenin 40 mikrolitresini, seyreltme oranı ile etiketlenmiş ilgili LB agar plakasına yerleştirin.

Her seyreltme oranı için üç kez tekrarlayın. Plakaları 37 santigrat derece sabit sıcaklıkta bir inkübatörde 16 saat kültürleyin. Saymak için yaklaşık 20 ila 70 koloni içeren plakaları seçin.

B cereus'un miktar tayini yapıldıktan sonra, dokuzuncu CFU'ya bir kez 10 içeren bir mililitre B cereus ortamı toplayın ve 10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra bakteri hücrelerini steril su ile 8.000 G'de 10 dakika santrifüj ederek iki kez yıkayın ve süpernatanı çıkarın. Konsantre B cereus'u steril normal salin ile 200 mikrolitre başına iki kat 10 ila sekizinci CFU'luk bir nihai konsantrasyona seyreltin.

Dağınık bir B cereus süspansiyonu elde etmek için seyreltmeyi tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin. Gavaj iğnesinin dışını %70 etanol ile silin ve uygun doz uygulamasını sürdürün. Fareleri dizginlemek için, onları kuyruklarından tutun ve kuyruğun ucu işleyicinin son iki parmağı arasında sabitlenmiş olarak sırtın gevşek derisini sıkıca kavrayın.

Fareleri dikey konumda tutun. Ardından gavaj iğnesini dikkatlice ve nazikçe ağızdan yemek borusuna sokun. B cereus solüsyonunu uygulayın, iğneyi nazikçe geri çekin ve fareyi kafesine geri koyun.

Farelerin vücut ağırlığını günlük olarak ölçün ve dışkı örneklerini hemen sterilize edilmiş bir santrifüj tüpünde toplayın. Dışkıda gizli kan test kağıdı ile dışkıda gizli kanı belirleyin. Bir aplikatör çubuğunda 10 miligram dışkı örneği toplayın.

Numuneyi test kartına koyun ve karta ince bir leke uygulayın. Arka kapağı açın ve geliştiriciyi smear'ın üzerine uygulayın. Fareleri sırtüstü ameliyat masasına sabitleyin ve periton boşluğunu açın.

Kolonun tamamını cerrahi olarak ayırın ve uzunluğunu bir cetvelle ölçün. Ardından kolonu önceden soğutulmuş PBS ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırınga ile nazikçe yıkayın. Kolon bölümlerini balmumundan arındırın ve nemlendirin.

Ardından, kolon bölümlerini hematoksilen ve eozin ile boyayın. İki bağımsız deneycinin numunenin histolojik skorlarını ışık mikroskobu altında değerlendirmesine izin verin, Hematoksilen ve eozin boyama, kolit model farelerin kolon dokusunun kript kaybı, goblet hücre hasarı, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel kaybı gösterdiğini ortaya çıkardı. B cereus tedavisi, DSS'nin neden olduğu histopatolojik hasarı iyileştirdi.

Kolit farelerinin histopatolojik skorları kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekti. Bununla birlikte, B cereus grubundaki histopatolojik skorlar, kolit farelerine göre önemli ölçüde daha düşüktü. Fareler rastgele üç gruba ayrıldı, ABX/DSS grubunda vücut ağırlığı kaybı, DAI skorları ve histopatoloji skorları ABX/kontrol grubundaki farelere kıyasla daha yüksek ve kolon uzunluğu daha kısaydı.

Vücut ağırlığı kaybı, kolon uzunluğu, DAI skorları ve histopatoloji skorları ABX/DSS ve ABX/B cereus artı DSS grupları arasında istatistiksel olarak farklı değildi. Mevcut sonuçlar dolaylı olarak bağırsak mikrobiyotasının B cereus'un kolit üzerindeki olumlu etkilerinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. En önemli adımlardan biri, farelerde kolit modellemesini oluşturmak için Bacillus cereus'u gavaj yöntemiyle kullanmaktır.

Bacillus cereus tedavisi, DSS'nin neden olduğu koliti ortadan kaldırdı ve bu da kolit tedavisi için probiyotiklerin takip çalışması için bir temel oluşturdu.