Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Bu prosedürün genel amacı, bıçak sırtı tarama mikroskobu veya KESM altında kesitleme ve görüntüleme için biyolojik örneklerin hazırlanmasını ve elde edilen görüntü yığını verilerinin görselleştirilmesini göstermektir. Bu, önce dokuyu KESM altında görüntülemeye hazırlamak için sabitleme, boyama ve gömme ile gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, KESS'yi yapılandırmak ve otomatik kontrol yazılımını kullanarak kesit alma ve görüntüleme yapmaktır.

Elde edilen görüntüler daha sonra gürültü giderme kaydedilir ve kırpılır. Son adım, veri kümelerini web tabanlı bir atlas ve 3B görselleştirme yazılımına yüklemek ve keşfetmektir. Sonuçta, tüm beyin seviyesini, nöronal ve vasküler organizasyonu mikrometre altı çözünürlükte gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, seri blok tabanlı taramalı elektromikroskopi gibi mevcut Mesos'a göre en büyük avantajı, daha düşük çözünürlükte de olsa çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmesidir. Bu yöntem, genel olarak connectomics ve sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem beynin yapısal organizasyonu hakkında fikir verebilir ve ayrıca akciğer ve böbrek gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.

Bu işleme başlamak için, diseke edilen fare beyni Golgi Cox Solüsyonu içeren bir cam kavanoza yerleştirilir. Cam kavanozu 10 ila 16 hafta boyunca oda sıcaklığında ışık geçirmez bir kutuya koyun. Golgi Cox çözeltisi bir fiksatif olarak çalıştığı için ayrı bir fiksasyon adımı gerekli değildir.

10 ila 16 hafta sonra, ertesi gün karanlıkta gece boyunca beyni deiyonize suda durulayın, durulanan beyni, oda sıcaklığında karanlıkta yedi ila 10 gün boyunca deiyonize suda% 5 amonyum hidroksit çözeltisine batırın. Yedi ila 10 gün sonra, beyni dört saat boyunca oda sıcaklığında deiyonize suda tekrar durulayın. Daha sonra beyni, kademeli bir dizi etil alkol ile kurutun ve her bir çözeltide 24 saat,% 50 etanol ve% 70 etanol ve% 85 etanol dört santigrat derecede bırakın.

Oda sıcaklığında %95 etanolde üç değişiklik ve %100 etanolde dört ila beş değişiklik. Daha sonra, susuz kalmış beyni asetona koyun ve her biri bir gün boyunca üç ila dört değişiklik yapın. Bundan sonra, beyni gece boyunca buzdolabına koyun, bu aite aseton karışımlarının her birinde, bir ila iki, bire bir ve ikiye bir ait-aseton oranına sahip olun.

Sonunda beyni buzdolabına% 100 koyun, her seferinde gece boyunca üç değişiklik yapın. Tedavi edilen beyin daha sonra% 100 aite gömülür ve üç gün boyunca 60 santigrat dereceye kadar ısıtılır. Son olarak, kürlenmiş numune bloğu, epoksi kullanılarak metal numune halkasına monte edilir ve bu prosedüre başlamak için bloğun kenarları gerektiği gibi kesilir.

Farenin derin bir şekilde uyuşturulduğunu ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermediğini onaylayın. Daha sonra, oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin kullanılarak fareyi trans olarak perfüze etti, ardından soğuk% 4 fosfat tamponlu para formaldehit izledi. Daha sonra, fareyi% 0.1'lik bir çözelti ile perfüze edin ve deiyonize suda boyayın.

Bundan sonra, vücudu 24 saat boyunca dört santigrat derece buzdolabına koyun. 24 saat sonra, beyni buzağıdan çıkarın ve% 0.1 Tiyonin içeren taze bir çözeltiye koyun. Beyni yedi gün boyunca dört santigrat derecede bırakın.

Yedi gün sonra, beyni kademeli bir dizi etil alkol ile alıkoyun ve kurutun. Altı haftalık bir süre boyunca,% 50 etanolde üç ila beş gün,% 70 etanolde yedi ila 10 gün,% 85 ve% 95 etanolde yaklaşık iki hafta ve geri kalan% 100 etanolde. Oda sıcaklığında üç aseton değişiminden sonra, beyin 60 derecelik bir fırında bilgili plastiğe gömülür.

Vasküler ağı Hindistan mürekkebi ile boyama prosedürüne başlamak için, farenin derin bir şekilde uyuşturulduğunu ayak parmağı çekme refleksi eksikliği ile onaylayın. Daha sonra, oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin, ardından oda sıcaklığında,% 10 nötr tamponlu formin kullanarak fareyi samimi bir şekilde perfüze edin. Kardiyovasküler sistemden kanın temizlenmesi ve dokuların sabitlenmesi için tuzlu su ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir.

Ardından, fareyi 3.0 cc Seyreltilmemiş Hindistan mürekkebi perfüzyonu ile perfu uygulayın. Hindistan ile kardiyovasküler sistemin damar sistemini tamamen doldurmak için mürekkep gereklidir. Fareden çıkarıldıktan sonra, elde edilen beyin bir dizi dereceli etil alkol yoluyla kurutulur ve daha sonra erudit plastiğe gömülür.

Görüntüleme için KESS'yi ayarlamak için daha önce gösterilen protokolü izleyerek, kamerayı, aydınlatıcıyı ve sahneyi açın, bıçağı ve hedefi kaldırın. Ardından, numune halkasını takın. Ardından hedefi ve bıçağı indirin.

Numune boyutlarını ölçün. Ardından KESM aşama kontrolörü için bir konfigürasyon dosyası oluşturun. İki uygulama, aşamayı başlatmadan önce bıçağı ve KESC'nin amacını kaldırın.

KESM aşama denetleyicisini ikinci başlatın ve aşamayı başlatın. Ardından bıçağı ve hedefi indirin ve pompayı açın. Optik mekanizma üzerindeki odaklama düğmesini çevirerek ve kameranın görüş alanını bıçak sırtına göre ayarlayarak objektifi ve kamerayı odaklayın.

Görüntüleme ve kesit oluşturmanın ilk birkaç adımını kontrol etmek için adım adım tıklayın. Ardından git'i tıklayın. Görüntü işleme için görüntüleme ve kesit oluşturmayı başlatmak.

Aydınlatma artefaktını kaldırmak ve tüm görüntülerdeki arka plan yoğunluğunu normalleştirmek için KESM yığın işlemcisini çalıştırın. Tüm veri alt klasörleri için bu işlemi tekrarlayın. KESM beyin atlasını kullanarak verileri görselleştirmek için bu web sitesine gidin ve farklı bir derinliğe gitmek için uygun atlası seçin.

Açılır menüden, her adımda ne kadar derine ineceğinizi seçin ve ardından Z derinliğini artırmak için artıya veya azaltmak için eksiye tıklayın. Diğer seçenekler arasında KESM beyin atlasını kullanarak yakınlaştırma veya gezinme yer alır. VIS lab'ı kullanarak verileri görselleştirmek üzere bindirme numarasını ve bindirme aralığını ayarlamak için açılır menüyü kullanın.

Uygulamayı başlatın, yeni bir proje oluşturun. Proje şunları içermelidir: 2B dosyalardan 3B oluşturun, dünya matrisini ayarlayın, aritmetik olanı ayarlayın ve 3B'yi bağlantılı olarak görüntüleyin. Bu sırayla, farenin sağ tuşuna basarken 3D görünümde gösterildiği gibi uygun parametreler ayarlanmalıdır.

Eşiği ayarlamak için fareyi hareket ettirin, bölgeler kırpılabilir. Yön değişti, aydınlatma değişti veya arka plan açıldı ya da kapatıldı. Temsili KESM sonuçları aşağıdakilerle gösterilmiştir: İlk olarak gösterilen video klipler, yaklaşık 100 mikron genişliğinde vasküler verilerin yakın çekiminden başlayarak, vasküler veri seti için tüm Brain India mürekkep veri yığınları olan KESM'nin hacim görselleştirmeleridir.

KESM'nin bu ikinci klibi, tüm Brain India mürekkep verileri, yaklaşık 10 milimetre genişliğinde yüksek çözünürlüklü verilerden örneklenen tüm fare beyin damar sisteminin üç standart görünümünü gösteriyor. Sagital görünüm, koronal görünüm ve yatay görünümün yanı sıra koronal bölümün içinden bir uçuş. KESM. Tüm beyin faresi Golgi verileri, blok görünümünden başlayarak, sagital görünüm, koronal görünüm ve yatay görünüm ile devam eden üç farklı kesit düzlemi boyunca bir sineği gösteren bu video klipte gösterilmektedir.

KESM tüm beyin faresi GoGy verilerinin sonraki ayrıntıları gösterilmektedir. Bu ilk video klip, beyincik ve purkinje hücrelerine aittir. Bu ikinci klip, korteks ve parametal hücreleri göstermektedir.

Son olarak, KESM. Tüm beyin verileri bu iki video klipte gösterilmektedir. İlk olarak NLE verilerinin yakın çekimi gösterilmektedir.

Bu ikinci klip, yüksek çözünürlüklü verilerden örneklenen tüm fare beyni Nle veri aboneliklerinin üç standart görünümünü gösterir. Bu gelişmeden sonra iç yapıların net bir şekilde görülebilmesi için bir kesit de gösterilmiştir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların fare beynindeki nöronal ve vasküler ağları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bıçak sırtı tarama mikroskobu için numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.