Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik örneklerin bıçak ucu taramalı mikroskobunda (KESM) kesit alma ve görüntüleme için hazırlanmasını ve elde edilen görüntü yığını verilerinin görselleştirilmesini göstermektir. Bu işlem, öncelikle dokunun KESM altında görüntülemeye hazır hale getirilmesi için tespit edilmesi, boyanması ve gömülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, KESM'nin konfigüre edilmesi ve otomatik kontrol yazılımı kullanılarak kesit alma ve görüntüleme işlemlerinin yürütülmesidir.

Elde edilen görüntüler daha sonra gürültüden arındırılır, kaydedilir ve kırpılır. Son adım, veri setlerini web tabanlı bir atlas ve 3D görselleştirme yazılımına yüklemek ve bunları incelemektir. Nihayetinde, tüm beyin düzeyinde, neuronal ve vasküler organizasyonu alt mikrometre çözünürlükte gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, seri blok tabanlı taramalı elektron mikroskobu gibi mevcut Mezo yöntemlere göre temel avantajı, daha düşük çözünürlükte olsa da çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmesidir. Bu yöntem, konnektomik alanı ve genel olarak nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, beynin yapısal organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca akciğer ve böbrek gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için, diseke edilmiş fare beyni Golgi Cox Çözeltisi içeren cam bir kavanoza yerleştirilir. Cam kavanozu oda sıcaklığında, ışık geçirmeyen bir kutuda 10 ila 16 hafta boyunca bekletin. Golgi Cox çözeltisi bir fiksatif olarak görev yaptığı için ayrı bir fiksasyon adımına gerek yoktur.

10 ila 16 hafta sonra, ertesi gün beyni karanlıkta gece boyunca deiyonize su ile yıkayın; ardından yıkanmış beyni, oda sıcaklığında ve karanlıkta yedi ila 10 gün boyunca deiyonize su içindeki %5 amonyum hidroksit çözeltisine daldırın. Yedi ila 10 gün sonra, beyni oda sıcaklığında dört saat boyunca tekrar deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra beyni, her bir çözeltide 24 saat bekleterek kademeli bir etil alkol serisi ile dehidrate edin; %50 etanol ve %70 etanol dört santigrat derecede, ardından %85 etanol.

Oda sıcaklığında üç kez %95 etanol ve dört ila beş kez %100 etanol değişimi yapın. Ardından,ydehidre edilmiş beyni asetona koyun ve her biri bir gün sürecek şekilde üç ila dört değişim gerçekleştirin. Bundan sonra beyni, bir ila iki, bir ila bir ve iki ila bir aite-aseton oranına sahip bu aite-aseton karışımlarının her birinde gece boyunca buzdolabında bekletin.

Son olarak beyni buzdolabında %100 aite içerisine yerleştirin ve her seferinde gece boyunca olacak şekilde üç kez değişim gerçekleştirin. İşlem görmüş beyin daha sonra %100 aite içine gömülür ve üç gün boyunca 60 °C'ye ısıtılır. Son olarak, kürlenmiş numune bloğu, epoksi kullanılarak metal numune halkasına monte edilir ve prosedüre başlamak için bloğun kenarları gerektiği şekilde düzeltilir.

Farelerin derin anestezi altında olduğundan ve ayak parmağı sıkıştırma işlemine yanıt vermediğinden emin olun. Ardından fareyi oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin ve ardından soğuk %4'lük fosfat tamponlu paraformaldehit kullanarak transkardiyak olarak perfüze edin. Son olarak, fareyi deiyonize su içerisinde %0,1'lik thi ve boya çözeltisi ile perfüze edin.

Ardından, gövdeyi 4 °C'lik bir buzdolabında 24 saat bekletin. 24 saat sonra, beyni kılıftan çıkarın ve %0,1 Thionine içeren taze bir çözeltiye yerleştirin. Beyni 4 °C'de yedi gün boyunca bekletin.

Yedi gün sonra, beyni kademeli bir etil alkol serisi aracılığıyla sabitleyin veledehidrate edin. Altı haftalık bir süre boyunca; üç ila beş gün %50 etanolde, yedi ila 10 gün %70 etanolde, 85 ve 95% etanolde yaklaşık ikişer hafta ve kalan sürede %100 etanolde bekletin. Oda sıcaklığında üç kez aseton değişimi yapıldıktan sonra beyin, 60 derece Celsius'lik bir fırında plastik reçineye gömülür.

Vasküler ağı çini mürekkebi ile boyama prosedürüne başlamak için, ayak parmağı çekme refleksinin yokluğu ile farenin derin anestezi altında olduğunu doğrulayın. Ardından fareyi, oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin ve ardından oda sıcaklığındaki %10'luk nötral tamponlu formaldehit kullanarak transkordial olarak perfüze edin. Kardiyovasküler sistemdeki kanı temizlemek ve dokuları fikse etmek için salin ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir.

Ardından, fareye 3,0 ccs Seyreltilmemiş Hindistan mürekkebi perfüzyonu uygulayın. Kardiyovasküler sistemin damar ağını tamamen doldurmak için Hindistan mürekkebi kullanımı gereklidir. Fareden çıkarıldıktan sonra, elde edilen beyin bir dizi dereceli etil alkol ile dehidre edilir ve ardından erudite plastiğe gömülür.

Görüntüleme için KESM kurulumunu gerçekleştirmek üzere daha önce gösterilen protokolü takip ederek kamerayı, aydınlatıcıyı ve sahneyi açın, bıçağı ve objektifi yukarı kaldırın. Ardından, numune halkasını yerleştirin. Son olarak objektifi ve bıçağı aşağı indirin.

Numune boyutlarını ölçün. Ardından KESM tabla kontrolcüsü için bir yapılandırma dosyası oluşturun. Tablayı başlatmadan önce bıçağı ve KESM objektifini yukarı kaldırın.

KESM sahne kontrol cihazı ikisini başlatın ve sahneyi ilklendirin. Ardından bıçağı ve objektifi indirin ve pompayı çalıştırın. Optik düzenek üzerindeki odaklama düğmesini çevirerek ve kameranın görüş alanını bıçak kenarına göre ayarlayarak objektifi ve kamerayı odaklayın.

Görüntüleme ve kesit almanın ilk birkaç adımını kontrol etmek için adım adım tıklayın. Ardından, görüntü işleme için görüntüleme ve kesit alma işlemini başlatmak üzere "git" (go) düğmesine tıklayın.

Tüm görüntülerdeki aydınlatma artefaktlarını gidermek ve arka plan yoğunluğunu normalize etmek için KESM yığın işlemcisini çalıştırın. İşlemi tüm veri alt klasörleri için tekrarlayın. Verileri KESM beyin atlasını kullanarak görselleştirmek için bu web sitesine gidin ve farklı bir derinliğe geçmek için uygun atlası seçin.

Açılır menüden her adımda ne kadar derine inileceğini seçin ve ardından Z derinliğini artırmak için artıya veya azaltmak için eksiye tıklayın. Diğer seçenekler arasında yakınlaştırma yapmak veya KESM beyin atlasını kullanarak gezinmek yer alır. VIS lab kullanarak verileri görselleştirmek için üst üste bindirme numarasını ve üst üste bindirme aralığını ayarlamak amacıyla açılır menüyü kullanın.

Uygulamayı başlatın ve yeni bir proje oluşturun. Proje, 2D dosyalardan 3D oluşturma, dünya matrisi aritmetiğini bir olarak ayarlama ve 3D görünümü bağlama adımlarını içermelidir. Bu sırayla, sağ fare düğmesine basılı tutarken 3D görünümde gösterildiği gibi uygun parametreler ayarlanmalıdır.

Eşik bölgelerini ayarlamak için fareyi hareket ettirerek kırpma işlemi yapabilirsiniz. Yönelim değiştirilebilir, aydınlatma değiştirilebilir veya arka plan açılıp kapatılabilir. Temsili KESM sonuçları şu şekilde örneklendirilmiştir: İlk olarak gösterilen video klipler, vasküler veri seti için yaklaşık 100 mikron genişliğindeki vasküler verilerin yakın çekimiyle başlayan, KESM'nin hacimsel görselleştirmeleri ve tüm beyin Hindistan mürekkebi veri yığınlarıdır.

KESM'nin bu ikinci klibinde, yaklaşık 10 milimetre genişliğindeki yüksek çözünürlüklü verilerden alt örneklemelerle elde edilen tüm beyin Hindistan mürekkebi verileri, tüm fare beyin vaskülaritesinin üç standart görünümünü sunmaktadır: sagital görünüm, koronal görünüm ve horizontal görünümün yanı sıra koronal kesitin içinden bir geçiş. KESM tüm beyin fare Golgi verileri, blok görünümüyle başlayan, ardından sagital görünüm, koronal görünüm ve horizontal görünümle devam eden üç farklı kesit düzlemi boyunca bir geçişin gösterildiği bu video klibinde örneklendirilmiştir.

KESM tüm beyin fare GoGy verilerinin sonraki detayları gösterilmektedir. Bu ilk video klip serebellum ve purkinje hücrelerine aittir. Bu ikinci klip ise korteksi ve parametal hücreleri göstermektedir.

Son olarak, KESM'e ait tüm beyin nle verileri bu iki video klibinde gösterilmiştir. İlk olarak, NLE verilerinin yakın çekimi sunulmaktadır.

Bu ikinci klip, yüksek çözünürlüklü verilerden alt örnekleme yoluyla elde edilmiş, tüm fare beynine ait Nle verilerinin üç standart görünümünü göstermektedir. Dahili yapıların net bir şekilde görülebilmesi için ayrıca bir kesit de sunulmuştur. Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların fare beynindeki nöronal ve vasküler ağları keşfetmesinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bıçak kenarı tarama mikroskobu için numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi konularında iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.