Name: Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, fare beyni örneklerini KESM ile görüntülemek için fiksasyon, boyama ve gömme yöntemlerini kullanarak hazırlama sürecini. Bu teknik, nöron ve damar ağlarını yüksek çözünürlükte incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, NSF (# 0.905.041, # 0.079.874), Texas İleri Teknoloji Programı (ATP-000.512-0146-2001, # ATP-000.512-0261-2001), Texas (# 1R01-NS54252), Ulusal Sağlık Enstitüsü / NINDS tarafından finanse edildi A &amp; M Araştırma Vakfı, Texas A &amp; M Üniversitesi, 3Scan Bilgisayar Bilimi ve Mühendisliği Bölümü. Bernard Mesa (Micro Star Teknolojileri) Biz, teknik danışmanlık ve KESM enstrümantasyon destek için teşekkür etmek istiyorum. Bruce H. McCormick, 2007 yılında ölen KESM tasarım ve uygulama ana bölümden yapıldı.

1. Örnek hazırlama: Golgi-Cox <ol><li> Bu protokol Mayerich ark protokol 7 yakından takip etmektedir. </li><li> C57BL/6J fare izofluran uçucu anestezi ile derin anestezi ve daha sonra dekapite. </li><li> Beyin Golgi Cox, fiksasyon solüsyonu (% 1 potasyum kromat,% 1 potasyum dikromat, ve deiyonize su içinde% 1 civa klorür) kaldırılır ve yerleştirilir. </li><li> Beyin, 10 ila 16 hafta boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta Golgi-Cox çözüm bırakılır. </li><li> Beyinleri, karanlık bir gecede, deiyonize su ile durulanır. </li><li> Durulanır beyin deiyonize su karanlıkta oda sıcaklığında 7 ila 10 gün için% 5 amonyum hidroksit çözeltisi batırılır. Bu uzun hazırlık süresi, siyah bir çökelti tamamen doku oluşturmak için bir şansı vardı, böylece bütün beynin infiltrasyonu sağlamak için. </li><li> Beyin, 4 saat ve t oda sıcaklığında, deiyonize su ile tekrar durulanıroda sıcaklığında% 50 ve buzdolabında (4 ° C)% 70 ve% 85,% 95 (3 değişikliklerin) ve 100 (% 4 ila 5 değişiklik): etil alkoller kademeli serisi ile kurutulmuş tavuk. Beyni 24 saat boyunca her çözüm bırakılır. </li><li> Susuz beyin sonra araldit-aseton oranı 1:2, 1:1, 2:1, ve nihayet bir araldit-aseton karışımı ile takip (3 ila 4 değişiklikleri, her bir gün için), aseton içinde alınır % 100 araldit buzdolabında (3 değişiklik, bir gecede her zaman), (4 ° C). </li><li> Son olarak, tedavi beyin% 100 araldit gömülü ve 60 ° C'de 3 gün (bkz. Abbott ve Sotelo 2 gömme protokolü) kadar ısıtılır. Örnekleri LR Beyaz gömülü Eğer örnekleri önce polimerizasyon için standart bir prosedür her gece buzdolabında tutulur üç değişiklikler, LR Beyaz çözüm yoluyla, son% 100 etanol çözüm aktarılır. Üç tam infiltrasyonu sağlamak için yapılır. Örnek t60 yaşında, kapalı bir kap içinde polimerize taze LR Beyaz transfer tavuk ° C, 24 saat boyunca uygun polimerizasyon için gerekli zaman ve sıcaklık miktarıdır. </li><li> Şekil 1 Araldite gömülü bir Golgi Cox lekeli beyin gösterir. </li><li> Sonra tedavi örnek blok, epoksi kullanarak metal örnek halkası monte, ve blok tarafına (bkz. Şekil 2) gerektiği gibi kesilmiş. </li></ol> 2. Numune hazırlama: Nissl <ol><li> Ketamin ve ksilizin (1.7 mg ketamin / 20 gram vücut ağırlığı başına 0,26 mg ksilizin) intraperitoneal olarak enjekte kullanarak fare derin anestezi ve sonra oda sıcaklığında 50 ml transcardially kullanmadan perfüze fosfat tamponlu salin (pH, 7.4 ') 250 ml oda tarafından takip sıcaklık,% 10 nötr formalin tamponlu (pH, 7.4 '). ve son olarak 3.0 cc sulandırılmamış Hindistan mürekkep. </li><li> Fiksatif ve tuzlu su ile bütün vücudu kardiyovasküler sistem perfüzyon kan temizlemek ve ti düzeltmek için gerekli ssues. Hindistan mürekkep ile Perfüzyon kardiyovasküler sistem damarsal tamamen doldurmak için gereklidir. </li><li> Sonucu beyin kademeli etil alkoller (25% -100%), bir dizi sonra kurutulmuş ve daha sonra yukarıda 1,8-1,9 protokol araldit plastik gömülü. LR beyaz gömme ortamı ise, o zaman yukarıda 1.10 'da protokol izledi. </li></ol> 4. Numune hazırlama: Genel türleri, genel organlar <ol><li> Genel durum için, fiksasyon ya da% 10'luk nötral tamponlu formalin veya% 4 paraformaldehid ile yapılabilir. </li><li> Küçük bir doku birimler için, difüzyon yerine perfüzyon fiksasyon ve boyama için tavsiye edilir. Küçük organizmalar veya organlar durumunda, ayrıca boyama dehidratasyon işlemi sırasında yapılabilir. </li><li> Gömme protokolü çözüm infiltrasyon için organ veya tüm fare beyin çok daha küçük organizmalar için azaltılmış olmasına rağmen, yukarıdaki ile aynı. </li></ol>jove_title "&gt; 5 KESM kurulum ve görüntüleme <ol><li> Pompa, sahnede açmak, kamera açmak, ışığını açın. </li><li> Bıçak ve amaç kaldırın. </li><li> Örnek yüzük takın. </li><li> Ölçü numune boyut ve KESM Sahne Controller2 uygulama için bir yapılandırma dosyası oluşturmak. </li><li> KESM Sahne Controller2 başlatın ve sahne başlatılamadı. </li><li> Alt bıçak / amaç, pompa açın. </li><li> Optik tren odaklanarak düğmeyi çevirerek ve bıçak kenarına göre kameranın görüş alanında ayarlayarak, objektif ve kamera odaklanın. </li><li> Görüntüleme başlatmak için [] tuşuna basın. </li><li> Bkz: Şekil. 3-8. 9, 7 teknik detaylar için bkz. </li></ol> 6. Görüntü işleme ve veri hazırlama <ol><li> KESM Yığın İşlemci çalıştırılabilir (00000, 00001, vb.) Yapılandırma dosya klasörü altında veri klasörünün içine kopyalayın. </li><li> Aydınlatma artifakı kaldırmak ve tüm arka plan yoğunluğu normale KESM Yığın İşlemci çalıştırıngörüntüler. Tüm verileri alt klasörler için tekrarlayın. </li><li> Veri ölçek fayans hazırlayın ayarlamak ve KESM Beyin Atlas web sunucu dosyalarını yükleyebilir ve kurmak. </li><li> Bkz: Şekil. 9 - </li></ol> 7. Veri analizi ve görselleştirme <ol><li> KESM Beyin Atlası kullanarak Görselleştirme. Git <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> ve uygun atlas seçin. <ol><li> Google Maps gibi gidin. </li><li> Google Maps gibi Yakınlaştırma ve uzaklaştırma. </li><li> [-] Z derinliği arttırmak veya azaltmak için farklı bir derinlik gitmek için, ya da [+] veya üzerine tıklayın daha sonra açılan menüden her adımda ne kadar derin seçin ve. </li><li> Açılan menüyü kullanarak bindirme sayısını ayarlayın. </li><li> Açılan menü ile kaplamayı aralığı ayarlayın. </li><li> Bkz: Şekil. 11. </li></ol></li><li> MeVisLab kullanarak Görselleştirme. <ol><li> MeVisLab başlatın. </li><li> Yeni bir proje oluşturun. </li><li> Aşağıda, yeni modüller ty oluşturmaya olabilirping komutu kutusunda modül adı. </li><li> Oluştur modülü [Compose3Dfrom2DFiles], ve istediğiniz klasöre gidin. Dosya dize girin ve [GetFileList] tıklayın. Seçilen görüntüleri hafıza sığabilecek emin olun. [Create3D] birim oluşturmak için. </li><li> Oluşturun modülü [SetWorldMatrix] ve altında "Ölçek" uygun voksel boyutu (0.6, 0.7, 1.0 10X 0.45NA bir amaç için) x, y, z "İlköğretim Dönüşümleri". Link [Compose3Dfrom2DFiles] [SetWorldMatrix]. </li><li> Matrix ayarlayın ve "İleri", "Yoksay", "Yoksay", "Matrix Kompozisyon" altında Dönüşümler. </li><li> Oluştur modülü [Arithmetic1] "(Max-Img) İnvert" "Fonksiyon" ayarlayın. Link [SetWorldMatrix] [Arithmetic1]. </li><li> Oluştur modülü [View3D] ve [Arithmetic1] bağlayın. </li><li> View3D, sağ fare tuşu basılı iken, ayarlayabilirsiniz.Özellik etrafında fareyi hareket ettirin. Bölgeler, değişimin yönünü (sol fare tuşu basılı iken hareket fare), değişim aydınlatma (hacim renderin kırpabilirsinizg veya MIP), vb / arka plan kapatmak </li><li> Bkz: Şekil. 10. </li></ol></li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Burada, bütün beyin veri ve detay sunuyoruz. İncir. 12-15 gösterisi Hindistan Mürekkep, Golgi, tüm beyin ve Nissl veri, 1, 4, 3 ayarlar . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, Sabit, lekeli, ve gömülü fare beyin <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Gömülü fare beyin örnek numune halkası üzerine monte edilmiş. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Knife Edge Tarama Mikroskobu (KESM). Önemli bileşenleri işaretli bir fotoğrafı KESM gösterilir: (1) yüksek hızlı hat-tarama kamera, (2) mikroskop objektif, (3) elmas bıçak montaj ve ışık kolimatör, (4) SPEÇimen tankı (su altında kalacak görüntüleme için) (5) üç-eksenli hassas hava taşıyan sahne, (6) beyaz ışık mikroskobu aydınlatıcı, (7) kesitli dokusunun çıkarılması için su pompası (arka), (8) sahne kontrolü ve görüntü alımı, (9) granit taban, ve (10) granit köprü için PC sunucu. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 KESM Görüntüleme ilkeleri. KESM çalışma başlıca gösterilmiştir. Objektif ve bıçak örnek ise 20 nm ve 1-5 seyahat hızı çözünürlükte konumlandırma aşamasında hamle (düz çizgi ile ok) yapıştırılmış (5 mm genişliğinde, bir yerde tutulur ve elmas bıçakla karşı kazınarak alır 10X objektif), bıçak (düz çizgi ile ok) üzerinden akan ince bir bölümü oluşturuyor. Line-tarama görüntüleme bıçak ucuna yakın yapılır. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5KESM kamera ve objektif odaklama kontrolleri. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 KESM bıçak montaj ve kontrolleri. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7 gözlem bağlantı noktası üzerinden odaklama İlk. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 KESM Sahne Controller 2 uygulama (ekran görüntüsü). <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 9"> Şekil 9 KESM yığın işlemci uygulamasını (ekran görüntüsü). <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 10"> Şekil 10 MeVisLab uygulama (ekran görüntüsü). <img alt="Şekil 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 11"> Şekil 11 KESM Beyin Atlas: Web arayüzü (ekran görüntüsü). <img alt="Şekil 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 12"> Şekil 12 KESM bütün beyin Hindistan mürekkep veri. KESM veri yığınlarının Cilt görselleştirme vasküler veri seti için gösterilmiştir. (A) Yakın çekim vasküler veri. Genişlik ~ 100 um. (Bd) tüm fare beynin damarsal Üç standart görünümler (yüksek çözünürlüklü veri alt örneklendirilmiştir). Genişlik 10mm ~. <img alt="Şekil 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 13"> Şekil 13 KESM tüm beyin fare Golgi veri. <img alt="Şekil 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 14"> Şekil 14 KESM Golgi veri ayrıntılar. <img alt="Şekil 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 15"> Şekil 15 KESM tüm beyin Nissl veri. K (a) Yakın çekimissl veri. ~ 300 um 3. (Bd) tüm fare beyin Nissl veri Üç standart görünümler (yüksek çözünürlüklü veri alt örneklendirilmiştir). Kesit iç yapıları net bir şekilde görmek için gösterilmiştir.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman 3Scan KESM Teknolojisi (US Patent # 6.744.572) üreten ve pazarlayan bir ticari şirket.

KESM biyolojik numune (~ 1 cm 3) geniş hacimli bir submicrometer düzeyinde araştırma için izin verir. Bu tür hacim, beyin, akciğer, kalp, böbrekler gibi tüm küçük hayvan organları, tutmak için yeterli, vb benzeri görülmemiş bu organların yapısal organizasyon hakkında niceliksel bilgi sağlamak ve çeşitli fonksiyonel sayısal modelleme etkinleştirmek gibi organların görüntüleri Taranmış devre ve ağ dinamiği, elektriksel özellikleri, sıvı ve hava akış dinamikleri, ve kas dinamikleri de dahil olmak üzere bu organların yönleri. Bu makalede ayrıntılı olarak numune hazırlama protokolü ve analiz sonrası protokol KESM kolay erişim ve ortaya çıkan veriler araştırma grupları dışında yardımcı olması beklenmektedir. KESM çalışma protokolü, bu benzersiz bir görüntüleme yönteminin yararları ve sınırlamaları takdir bu dış araştırmacılar yardımcı olacaktır.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

bıçak kenar tarama mikroskopi için numune hazırlama, görüntüleme ve analiz protokolleri

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Submicrometer çözünürlükte nöroanatomik veri geniş hacimli satın alma, yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü, 3 boyutlu mikroskopi teknikleri büyük gelişmeler sağlamıştır. Tüm-beyin ölçekli veri üreten ilk bu tür araçların biri Knife-Edge Tarama Mikroskobu (KESM) 7, 5, 9, gelişmiş ve yazarların laboratuvar barındırılan . KESM, nöron ağları karmaşık ayrıntıları (Golgi) 1, 4, 8, damar ağları (Hindistan mürekkep) 1, 4, ve hücre gövdesi dağılımı (Nissl) 3 ifşa, bölüm ve tüm fare beyinleri submicrometer çözünürlükte görüntü için kullanılır olmuştur . KESM kullanımı, fare, ne de beyin sınırlı değildir. Biz başarıyla ahtapot beyin 6, fare akciğer ve sıçan beyin görüntülü var. Şu anda tüm zebra balık embriyoları üzerinde çalışıyoruz. Mikrodolaşım ve hemodinamik araştırma; bu gibi veriler connectomics araştırma 10 büyük katkıda bulunabilir ve yazarlara stereology araştırmading bir zemin gerçeği tam. Bu makalede, numune hazırlama (sabitleme, boyama ve gömme) dahil olmak üzere bir boru hattı, KESM konfigürasyon ve kurulum, kesit ve görüntüleme KESM ile, görüntü işleme, veri hazırlama ve veri analizi ve görselleştirme anlatacağız. Vurgu, numune hazırlama ve elde edilen KESM veri görselleştirme / analiz olacaktır. Biz bu yazıda ayrıntılı protokol KESM erişim ve kullanımını artırmak için genişletmeye yardımcı olmak için bekliyoruz.

Beyin numune hazırlama, veri analizi ve görselleştirme, Bıçak-Kenar Tarama Mikroskobu kullanılarak seri kesit görüntüleme için tam bir süreç tarif edilir. Bu teknik şu anda fare beyni verileri elde etmek için kullanılan, ancak diğer organları, diğer türler için geçerli.

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Yüksek kapasiteli, yüksek çözünürlüklü 3D mikroskopi tekniklerindeki önemli ilerlemeler, ... seviyesinde büyük hacimli nöroanatomik verilerin elde edilmesine olanak sağlamıştır.

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik örneklerin bıçak ucu taramalı mikroskobunda (KESM) kesit alma ve görüntüleme için hazırlanmasını ve elde edilen görüntü yığını verilerinin görselleştirilmesini göstermektir. Bu işlem, öncelikle dokunun KESM altında görüntülemeye hazır hale getirilmesi için tespit edilmesi, boyanması ve gömülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, KESM'nin konfigüre edilmesi ve otomatik kontrol yazılımı kullanılarak kesit alma ve görüntüleme işlemlerinin yürütülmesidir.Elde edilen görüntüler daha sonra gürültüden arındırılır, kaydedilir ve kırpılır. Son adım, veri setlerini web tabanlı bir atlas ve 3D görselleştirme yazılımına yüklemek ve bunları incelemektir. Nihayetinde, tüm beyin düzeyinde, neuronal ve vasküler organizasyonu alt mikrometre çözünürlükte gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, seri blok tabanlı taramalı elektron mikroskobu gibi mevcut Mezo yöntemlere göre temel avantajı, daha düşük çözünürlükte olsa da çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmesidir. Bu yöntem, konnektomik alanı ve genel olarak nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, beynin yapısal organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca akciğer ve böbrek gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.Bu prosedüre başlamak için, diseke edilmiş fare beyni Golgi Cox Çözeltisi içeren cam bir kavanoza yerleştirilir. Cam kavanozu oda sıcaklığında, ışık geçirmeyen bir kutuda 10 ila 16 hafta boyunca bekletin. Golgi Cox çözeltisi bir fiksatif olarak görev yaptığı için ayrı bir fiksasyon adımına gerek yoktur.10 ila 16 hafta sonra, ertesi gün beyni karanlıkta gece boyunca deiyonize su ile yıkayın; ardından yıkanmış beyni, oda sıcaklığında ve karanlıkta yedi ila 10 gün boyunca deiyonize su içindeki %5 amonyum hidroksit çözeltisine daldırın. Yedi ila 10 gün sonra, beyni oda sıcaklığında dört saat boyunca tekrar deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra beyni, her bir çözeltide 24 saat bekleterek kademeli bir etil alkol serisi ile dehidrate edin; %50 etanol ve %70 etanol dört santigrat derecede, ardından %85 etanol.Oda sıcaklığında üç kez %95 etanol ve dört ila beş kez %100 etanol değişimi yapın. Ardından,ydehidre edilmiş beyni asetona koyun ve her biri bir gün sürecek şekilde üç ila dört değişim gerçekleştirin. Bundan sonra beyni, bir ila iki, bir ila bir ve iki ila bir aite-aseton oranına sahip bu aite-aseton karışımlarının her birinde gece boyunca buzdolabında bekletin.Son olarak beyni buzdolabında %100 aite içerisine yerleştirin ve her seferinde gece boyunca olacak şekilde üç kez değişim gerçekleştirin. İşlem görmüş beyin daha sonra %100 aite içine gömülür ve üç gün boyunca 60 °C'ye ısıtılır. Son olarak, kürlenmiş numune bloğu, epoksi kullanılarak metal numune halkasına monte edilir ve prosedüre başlamak için bloğun kenarları gerektiği şekilde düzeltilir.Farelerin derin anestezi altında olduğundan ve ayak parmağı sıkıştırma işlemine yanıt vermediğinden emin olun. Ardından fareyi oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin ve ardından soğuk %4'lük fosfat tamponlu paraformaldehit kullanarak transkardiyak olarak perfüze edin. Son olarak, fareyi deiyonize su içerisinde %0,1'lik thi ve boya çözeltisi ile perfüze edin.Ardından, gövdeyi 4 °C'lik bir buzdolabında 24 saat bekletin. 24 saat sonra, beyni kılıftan çıkarın ve %0,1 Thionine içeren taze bir çözeltiye yerleştirin. Beyni 4 °C'de yedi gün boyunca bekletin.Yedi gün sonra, beyni kademeli bir etil alkol serisi aracılığıyla sabitleyin veledehidrate edin. Altı haftalık bir süre boyunca; üç ila beş gün %50 etanolde, yedi ila 10 gün %70 etanolde, 85 ve 95% etanolde yaklaşık ikişer hafta ve kalan sürede %100 etanolde bekletin. Oda sıcaklığında üç kez aseton değişimi yapıldıktan sonra beyin, 60 derece Celsius'lik bir fırında plastik reçineye gömülür.Vasküler ağı çini mürekkebi ile boyama prosedürüne başlamak için, ayak parmağı çekme refleksinin yokluğu ile farenin derin anestezi altında olduğunu doğrulayın. Ardından fareyi, oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin ve ardından oda sıcaklığındaki %10'luk nötral tamponlu formaldehit kullanarak transkordial olarak perfüze edin. Kardiyovasküler sistemdeki kanı temizlemek ve dokuları fikse etmek için salin ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir.Ardından, fareye 3,0 ccs Seyreltilmemiş Hindistan mürekkebi perfüzyonu uygulayın. Kardiyovasküler sistemin damar ağını tamamen doldurmak için Hindistan mürekkebi kullanımı gereklidir. Fareden çıkarıldıktan sonra, elde edilen beyin bir dizi dereceli etil alkol ile dehidre edilir ve ardından erudite plastiğe gömülür.Görüntüleme için KESM kurulumunu gerçekleştirmek üzere daha önce gösterilen protokolü takip ederek kamerayı, aydınlatıcıyı ve sahneyi açın, bıçağı ve objektifi yukarı kaldırın. Ardından, numune halkasını yerleştirin. Son olarak objektifi ve bıçağı aşağı indirin.Numune boyutlarını ölçün. Ardından KESM tabla kontrolcüsü için bir yapılandırma dosyası oluşturun. Tablayı başlatmadan önce bıçağı ve KESM objektifini yukarı kaldırın.KESM sahne kontrol cihazı ikisini başlatın ve sahneyi ilklendirin. Ardından bıçağı ve objektifi indirin ve pompayı çalıştırın. Optik düzenek üzerindeki odaklama düğmesini çevirerek ve kameranın görüş alanını bıçak kenarına göre ayarlayarak objektifi ve kamerayı odaklayın.Görüntüleme ve kesit almanın ilk birkaç adımını kontrol etmek için adım adım tıklayın. Ardından, görüntü işleme için görüntüleme ve kesit alma işlemini başlatmak üzere "git" (go) düğmesine tıklayın.Tüm görüntülerdeki aydınlatma artefaktlarını gidermek ve arka plan yoğunluğunu normalize etmek için KESM yığın işlemcisini çalıştırın. İşlemi tüm veri alt klasörleri için tekrarlayın. Verileri KESM beyin atlasını kullanarak görselleştirmek için bu web sitesine gidin ve farklı bir derinliğe geçmek için uygun atlası seçin.Açılır menüden her adımda ne kadar derine inileceğini seçin ve ardından Z derinliğini artırmak için artıya veya azaltmak için eksiye tıklayın. Diğer seçenekler arasında yakınlaştırma yapmak veya KESM beyin atlasını kullanarak gezinmek yer alır. VIS lab kullanarak verileri görselleştirmek için üst üste bindirme numarasını ve üst üste bindirme aralığını ayarlamak amacıyla açılır menüyü kullanın.Uygulamayı başlatın ve yeni bir proje oluşturun. Proje, 2D dosyalardan 3D oluşturma, dünya matrisi aritmetiğini bir olarak ayarlama ve 3D görünümü bağlama adımlarını içermelidir. Bu sırayla, sağ fare düğmesine basılı tutarken 3D görünümde gösterildiği gibi uygun parametreler ayarlanmalıdır.Eşik bölgelerini ayarlamak için fareyi hareket ettirerek kırpma işlemi yapabilirsiniz. Yönelim değiştirilebilir, aydınlatma değiştirilebilir veya arka plan açılıp kapatılabilir. Temsili KESM sonuçları şu şekilde örneklendirilmiştir: İlk olarak gösterilen video klipler, vasküler veri seti için yaklaşık 100 mikron genişliğindeki vasküler verilerin yakın çekimiyle başlayan, KESM'nin hacimsel görselleştirmeleri ve tüm beyin Hindistan mürekkebi veri yığınlarıdır.KESM'nin bu ikinci klibinde, yaklaşık 10 milimetre genişliğindeki yüksek çözünürlüklü verilerden alt örneklemelerle elde edilen tüm beyin Hindistan mürekkebi verileri, tüm fare beyin vaskülaritesinin üç standart görünümünü sunmaktadır: sagital görünüm, koronal görünüm ve horizontal görünümün yanı sıra koronal kesitin içinden bir geçiş. KESM tüm beyin fare Golgi verileri, blok görünümüyle başlayan, ardından sagital görünüm, koronal görünüm ve horizontal görünümle devam eden üç farklı kesit düzlemi boyunca bir geçişin gösterildiği bu video klibinde örneklendirilmiştir.KESM tüm beyin fare GoGy verilerinin sonraki detayları gösterilmektedir. Bu ilk video klip serebellum ve purkinje hücrelerine aittir. Bu ikinci klip ise korteksi ve parametal hücreleri göstermektedir.Son olarak, KESM'e ait tüm beyin nle verileri bu iki video klibinde gösterilmiştir. İlk olarak, NLE verilerinin yakın çekimi sunulmaktadır.Bu ikinci klip, yüksek çözünürlüklü verilerden alt örnekleme yoluyla elde edilmiş, tüm fare beynine ait Nle verilerinin üç standart görünümünü göstermektedir. Dahili yapıların net bir şekilde görülebilmesi için ayrıca bir kesit de sunulmuştur. Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların fare beynindeki nöronal ve vasküler ağları keşfetmesinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, bıçak kenarı tarama mikroskobu için numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi konularında iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Mukherjee, K., et. al. Beyin Mitokondrilerinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video hazırlığı göstermektedir,  Mitokondriyal üst yapıyı görselleştirmek için bir seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) kullanarak fare beyin dokusunun görüntülenmesi ve analizi, aksonal ve dendritik nöronal bölmelerdeki morfolojilerinin ve uzamsal dağılımlarının hassas bir şekilde haritalanmasını sağlar.

 Nöronal Mitokondrinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Görüntülenmesi

Burada, hücreden arındırılmış kalp dokularında hücre dışı matriks üst yapısını görselleştirmek için bir yöntem gösterilmiştir.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Kuantum nokta (QD) nanopartiküllerinin epoksi gömülü insan patoloji dokusunun korelasyon immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabileceği bir yöntem tanımlanmıştır. Geniş alan floresan ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirilen ticari antikor fragmanı konjuge QD'ler kullanıyoruz.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

Bu rapor, kalın biyolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron tomografisini gerçekleştirmek için bir numune hazırlama protokolünü ve özel görüntüleme koşullarını açıklar.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk...

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

Öğrenin, fare beyni örneklerini KESM ile görüntülemek için fiksasyon, boyama ve gömme yöntemlerini kullanarak hazırlama sürecini. Bu teknik, nöron ve damar ağlarını yüksek çözünürlükte incelemeyi sağlar.

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Daha fazla video keşfet