VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Bu prosedürün genel amacı, floresan etiketli bileşenlere sahip yapıların süper çözünürlüklü görüntülerine tek parçacık analizi uygulayarak virüslerin veya makro-moleküler komplekslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini üretmektir. Bu yöntem, karmaşık virüslerin protein mimarisi ve bunun enfeksiyon seyri sırasında nasıl değiştiği de dahil olmak üzere viroloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı yapının birden fazla görüntüsünü toplayarak, bileşenlerinin yüksek hassasiyetli bir haritasını oluşturmanın mümkün hale gelmesidir.

Bu yöntem virüslerin yapısı hakkında bilgi verebilse de, memeli hücrelerindeki diğer patojenler ve makromoleküler kompleksler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, numuneyi süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İstenmeyen floresan yapıları olmayan yüzlerce ila binlerce iyi ayrılmış parçacık içeren çeşitli görüş alanlarının görüntülerini elde edin.

Görüntüler alındıktan ve işlendikten sonra, görüntüleri içe aktarın ve birleştirilmiş kanallara sahip bir yığın halinde birleştirin. Gerekirse, birleştirilmiş görüntüyü hiper yığından yığına dönüştürün. Ardından, VirusMapper alt menüsünde Viral Yapıları Çıkar"ı seçin ve çıkarılan parçacıklar için dosya yolunu ayarlayın.

Görüntülenen floresan kanallarının sayısını doldurun. Referans kanalını, parçacıkların en tutarlı görünüme sahip olduğu floresan kanalına ayarlayın. Bu parçacıklar merkezi bir maksimumdan yoksunsa, birinin görünümünü indüklemek için ön algılama Gauss bulanıklığı uygulayın.

Ardından, en büyük parçacıkların çapını piksel cinsinden tahmin edin. ROI yarıçapını bu değerin yarısından biraz daha fazlasına ayarlayın. Kare başına gereken yatırım getirisi sayısını tahmin edin.

Başlangıçta yüzden fazla yatırım getirisi kullanmayın. Parçacık ayrımına bağlı olarak maksimum ROI örtüşmesini ayarlayın. Bu karenin yatırım getirilerini önizleyin.

Yarıçapı, ROI sayısını ve maksimum örtüşmeyi, çerçevedeki her parçacığın tek bir ROI içine alınması için ayarlayın. ROI'lerin en büyük parçacıklardan en az birkaç piksel daha geniş olduğundan emin olun. Ardından, segmentasyonu çalıştırmak için Tamam'ı tıklayın.

Ayıklama işleminden sonra ROI yöneticisinde örnek görüntüyü kapatın. Çıkarılan parçacık kümelerini yeniden adlandırmayın. Tohum Oluştur'u seçin" ve çıkarılan parçacık verilerini içeren klasörü açın.

Referans kanalını ayarlayın ve bir tohumun oluşturulması gereken tüm kanalları seçin. Önceki modellerle eşleşmesi gerekirse, tohumları doksan derece döndürün. Parçacıkların merkezi bir maksimuma sahip olmadığı kanallar için, ön hizalama Gauss bulanıklığı değerini daha önce olduğu gibi artırın.

Kanallar yakından hizalanmamışsa, referans olmayan kanallar için kaydırma düzeltmesini etkinleştirin. Tutarlı bir şekilde görünen bir yapı için parçacık dizisini arayın. Temsili bir parçacık tanımlayın ve Kullanılacak çerçeveler" alanına ilgili çerçeve numarasını girin.

Elde edilen tohumları gözden geçirin. Tohum seçimi bu prosedürün kritik bir aşamasıdır. Modellenecek bir veya daha fazla yapıyı tanımlamak için ham verileri dikkatlice görüntüleyin.

Model kalitesi, bu yapıları doğru bir şekilde yansıtan tohumların seçilmesine büyük ölçüde bağlıdır. Benzer tohumlara sahip ek karelerin tanımlanmasını optimize etmek için referans kanalını, Gauss bulanıklık yarıçapını ve kaydırma düzeltmesini gerektiği gibi ayarlayın. Ortalama yapı, verilerde gözlemlenen bir yapıyı en iyi şekilde temsil edene kadar çerçeve eklemeye ve oluşturma parametrelerini ayarlamaya devam edin.

Tohumlar için klasör adını ve dosya önekini girin. Tohum görüntülerini daha sonra modellemek üzere kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Tohumlara Dayalı Modeller Oluştur'u seçin ve çıkarılan parçacık klasörünü açın.

Her kanal için çekirdek ortalamalarını yükleyin. Başvuru tabanlı yapı keşfi yapıyorsanız, hizalama için bir referans kanalı seçin. Bir kanaldaki bilinen parçacık yapısı, ikinci bir bilinmeyen kanalı hizalamak için bir referans olarak kullanılabilir.

Bu, bilinmeyen yapının tarafsız bir şekilde haritalandırılmasına izin verir. Kanallar arasındaki renk kaymasının önceden düzeltilmesi gerektiğini unutmayın. Analiz, modelde küçük farklılıklar veya ince özellikler arıyorsa, şablon eşleştirme sırasında Kare görüntü yoğunluğu'nu seçin.

Minimum benzerliği yüzde altmış ile seksen arasında ve yineleme sayısını bir olarak ayarlayın. Hesaplama sırasında gösterilecek modelleri ve parçacıkları seçin ve önizleme modellerini oluşturun. Önizleme modellerini inceleyin.

Yalnızca istenen morfolojiye sahip parçacıkları dahil etmek için minimum benzerliği artırın. Diğer model hesaplama parametrelerini gerektiği gibi optimize edin ve istenirse model oluşturma sürecinde gösterilecek ek öğeleri seçin. Önizleme modelleri tatmin edici olduğunda, yineleme sayısını ona yükseltin.

Klasör adını ve dosya önekini ayarlayın. Son modelin tüm yinelemelerini içeren model evrimi yığınlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Yeşil ve kırmızı floresan proteinleri ile etiketlenmiş iki proteine sahip bir rekombinant Vaccinia virüsü, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile görüntülendi ve VirusMapper eklentisi ile modellendi.

Tohumlar, her biri beş temsili parçacıktan ortalama alınan frontal ve sagital yönelimler için ayrı ayrı üretildi. Virüsün oryantasyonuna bağlı olarak, bir veya iki yan cisim ayırt edilebilir. Bu nedenle, iki yönlendirme için ayrı modeller oluşturulabilir.

Bu yordamı denerken, modellerin kalitesinin büyük ölçüde elde edilen ham verilerin kalitesine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Tek parçacık analizi hassasiyeti artırabilirken, düşük kaliteli görüntüleri telafi edemez. Bu prosedürü takiben, bu modeller üzerinde daha fazla miktar belirleme veya model uydurma yapılabilir.

Bu, özellikle enfeksiyon sırasında viral mimarideki nano ölçekli değişiklikler gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, süper çözünürlüklü görüntülerden moleküler mimari modelleri oluşturmak için tek parçacıklı analiz yazılımı VirusMapper'ın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.