Name: VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin, süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülerinde tek parçacık analizi kullanarak virüslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini nasıl oluşturacağınızı. VirusMapper yazılımı ile viral mimariyi ve enfeksiyon sırasındaki yapısal değişiklikleri keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz VirusMapper özgün gelişim ve doğrulama katkılarından dolayı Corina Beerli Jerzy Samolej Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck ve Kathrin Scherer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca yazının eleştirel okuma için Artur Yakimovich teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi hibe ile finanse edildi (BB / M022374 / 1) (RH); Moleküler Hücre Biyolojisi MRC Laboratuvarına çekirdek fonlama, University College London (JM); Avrupa Araştırma Konseyi (649.101-UbiProPox) (JM); ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MR / K015826 / 1) (RH ve JM). RG Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (AP / M506448 / 1) tarafından finanse edilmektedir.

NOT: Bu protokol ve video daha ayrıntılı olarak yazılım paketini açıklayan orijinal kağıt 10 tamamlar. Okuyucular yazılımın kullanımına yönelik ek rehberlik için dikkatli bir şekilde inceleyin teşvik edilmektedir. üç ana aşama vardır: parçacık ekstraksiyon, tek tek parçacıklar halinde bölümler büyük görüntüler; ortak yapılar son aşamada kullanılan tohum üretmek için veri tanımlanır ve hizalanır tohum seçimi; ve şablon uygun bu tohumlar göre modeli üretme, ekstre parçacıkları ve ortalamalar SPA modeller üretmek için bir alt hizalar. 1. Kur öncesinde Yazılım Paketi Koşu için <ol><li> Bir lamel veya ilgili deney koşullarında çalışılan yapının örnekleri hazırlayın. </li><li> Resim gibi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) 11 veya stimula olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile örnekleri,ted emisyon tükenmesi (STED) 12 mikroskopi. NOT: hazırlamak ve ilgili literatür danışılmalıdır böylece görüntü örnekleri, çalışmanın altında yapının niteliğine büyük ölçüde bağlıdır nasıl kesin detayları. Bir örnek olarak, hazırlama ve burada kullanılanlar gibi aşı virüsü örnekleri, görüntüleme için kesin usul, temsili sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir. </li><li> yapı ya da tanecikler, tercihen binlerce ayrı kopyalar, çok sayıda gösteren birkaç bakış alanları görüntü oluşturma. hem de mümkün olduğu kadar birbirlerinden ayrılmış ve görüntüler kir veya ilgi olmayan diğer floresan yapılar olduklarından emin olan Resim parçacıkları. </li><li> Fiji araç çubuğu içine dosyaları sürükleyerek veya&gt; &quot;Aç&quot; &quot;Dosya&quot; seçerek Fiji partikülleri içeren tüm görüntüleri açın. </li><li> bitiştirmek için &quot;Concatenate&quot; &quot;Görüntü&quot;&gt; &quot;Yığın&quot;&gt; &quot;Araçlar&quot;&gt; seçinTek bir yığın halinde ve görüntüler. çıkan görüntü bir hyperstack ise, daha sonra,&gt; &quot;Hyperstacks&quot;&gt; &quot;hyperstack Stack için&quot; &quot;Image&quot; seçeneğini seçerek bir yığın haline getirmek. NOT: Nihai yığın interkalantlı kanalları olmalıdır. iki kanal varsa, istifin ilk dilim ilk görüntü kanal 1 olmalıdır, ikinci dilim karşılık gelen kanal 2, üçüncü dilim ikinci görüntü kanal 1 olabilir, ve böylece gereken olmalıdır. </li></ol> 2. Partiküllerin ekstrakte <ol><li> segmente resim seçin ve &quot;Viral Yapılar Özü&quot; seçeneğini seçin. çıkarılan parçacıkları kaydetmek ve &quot;Özü Viral Yapılar&quot; görmek yeri seçin iletişim (Şekil 2). </li><li> aşağıdaki gibi &quot;Viral Yapılar Özü&quot; iletişim girerek ilk tahminleri ile ekstraksiyon parametrelerinin atayın. görüntü segmentasyon önizledikten sonra bu parametreler ince ayar. <ol><li> uyuşmuş ayarlaimaged farklı floresan kanalların sayısı veri kümesi kanal er (örneğin, 2). </li><li> parçacıklar kanal seçim numarasını girerek bu kanal piklerin tespiti ile ekstre edildiği bir referans kanalı olarak ayarlayın. en tutarlı kanalı seçin; yani, kanal içinde en parçacıklar aynı görünüme sahiptir. NOT: Bu kanalda parçacıkların bir merkezi maksimum olacaktır Mümkünse. </li><li> Önceden tespit Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 önceden tespit Gauss bulanıklığı ayarlayın; bu değer arttırılırsa, belirli bir yarıçapın bir Gauss bulanıklığı filtre lokal maksimumlar algılama önce uygulanır. Referans kanal bir orta maksimum (örneğin, halka şekli) sahip değildir, bu özelliği kullanılır; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır. NOT: Bu özellik sadece kullanımıdır gibi ilgi Parçalara bölgeleri (ROI), kendilerine uygulanan Gauss bulanıklığı yokd referans kanalı olarak ROI konumlandırmak için. </li><li> piksel olarak (her bir yerel maksimum yaklaşık ayarlanacaktır) YG çapındaki ayarlayın. Bu ROI, örneğin Şekil 3&#39;te olduğu gibi büyük partiküllerin, biraz daha büyük olacak şekilde bir değer seçin. büyük parçacıklar (göz ile kabaca tahmin edilen), yaklaşık 30 piksellik bir çapa sahip olduğu görülmektedir, örneğin, daha sonra 20 piksel YG çapındaki ayarlayın. </li><li> 100&#39;ün altında bir ilk, nispeten daha küçük bir değere çerçeve başına kullanımı İB&#39;nin sayısını ayarlar. </li><li> Maksimum YG örtüşme ayarlayın. Partiküller ayrılır, bu küçük tutmak; partiküller, kümelenmiş ise, üst üste gelecek şekilde ROI etkinleştirmek için bu artış. </li></ol></li><li> &quot;Gösterisi önizleme&quot; seçiniz. Not: Bu seçildiğinde, mevcut çerçeve ile ilişkili bir referans kanalı için ekstre ROI&#39;ler görünür. </li><li> YG çapındaki, ROI sayısı ve mümkün olduğu kadar çok partiküller etrafında uygun boyutta ROI için maksimum YG örtüşme ayarlamaŞekil 3&#39;te olduğu gibi. </li><li> segmentasyon çalıştırmak için &quot;OK&quot; i seçin. Görüntüyü ve YG yöneticisini kapatın. NOT: parçacık kümeleri dosyaların isimlerini değiştirmeyin. Bu isimler biçiminde olmalıdır &quot;Viral parçacıklar - channelX&quot; Aşağıdaki bölümler için. </li></ol> 3. Tohumları <ol><li> &quot;Tohumlar üret&quot; Seç çıkarılan parçacıklar kaydedildiği klasörü seçin ve &quot;Tohumlar üret&quot; iletişim ve pencereler (Şekil 4) görmek. </li><li> aşağıdaki gibi, &quot;Seeds üret&quot; iletişim girerek ilk tohum seçimi parametrelerini atama. <ol><li> Tüm kanallar hizalamak ve merkez uydurulur referans kanalı olarak ayarlayın. parçacıkların çoğu aynı görünüme sahip ve mümkünse bu, merkezi bir maksimuma sahip olan bir kanal seç. </li><li> Bir tohum oluşturulacağı için tüm kanallar için kutuları seçin. </li><li> Tohumlar rotat olmalıdır eğer seçin90 ° ed. diğer modelleri ile tutarlı uyum sağlamak için bu özelliği kullanın </li><li> Önceden hizalama Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 her bir kanal için bulanıklık çapındaki ayarlayın. yeniden düzenlenmesinden önce verilen yarıçaplı bir Gauss bulanıklığı filtre uygulamak için bu değeri arttırın. parçacıkların bir merkezi maksimum yoksa bu özelliği kullanın; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır. NOT: Bu özellik, tutarlı uyum almak için tek olduğu gibi tohumları, uygulanan bulanıklık olmaz. </li><li> kontrol ya da her bir kanal için &quot;Kaydırma düzeltme&quot;, kutuları, döndürmek olmamakla birlikte, ayrı ayrı referans olmayan kanallar için tohum merkezi kaydırma düzeltme kullanmak için seçin. NOT: Kanallar birbirlerini iyi hizalanmış değilse bunu kullanın; Bu aynı zamanda kaydırma düzeltme olmaksızın sadece referansa göre diğer kanallar hizalamak için yararlı olabilir. </li></ol></li><li> Tohum olarak kullanmak için parçacıkların seçin. t yoluyla arao model ve çerçeve sayısını kaydetmek için aşağıdaki yapıya benzer bir parçacık bulmak için sekansı partikül. </li><li> Kutusu &quot;kullanmaya Çerçeveler&quot; in numarasını girin ve daha pencereler (Şekil 5) görünecektir. virgülle ayrılmış birden çok çerçeve numarasını girin. </li><li> görünen pencerelerde tohum çerçeveleri ve sonuçta ortalama tohum görüntüle. NOT: Günlük ortalamaya benzer tohum önerir. </li><li> Bulunan tohum kare bir dizi benzer bir görünüme sahip olacak şekilde, tohum seçimi işlemi optimize etmek için bir referans kanalı, Gauss bulanıklığı çapındaki ve kaydırma düzeltme seçeneklerini ayarlayın. Ortalama tohumlar tatminkar modellenmiş edilecek verilerde görülen yapıyı benzediğini oluşturulur kadar eklenmeye tohumları devam edin. </li><li> tohum Ad ve onlar kaydedilebilir ve seçmek olacaktır nerede &quot;Tamam&quot; modeli nesil sonra kullanılmak üzere nihai tohum görüntüleri kaydetmek için. </li></ol> 4. Modelleri üret <ol><li> Select, &quot;tohumları Dayalı modelleri oluşturmak&quot; ekstre parçacıkları kaydedilir klasörü seçin ve &quot;modelleri oluşturmak&quot; iletişim (Şekil 6). </li><li> işaret kutularını kullanarak her bir kanal için tohum yükleyin. NOT: Tohumlar &quot;Seeds üret&quot; iletişim kutusunda seçildi bir alt klasörde kaydedilir. Varsayılan ad &quot;Analiz&quot; dir. Tohum Ortalamalar değil de referans için kaydedilir Çerçeveler, seçmek için özen gösterin. </li><li> aşağıdaki gibi, &quot;Modeller üret&quot; iletişim girerek ilk modeli oluşturma parametrelerini atama. Bu parametreler daha sonra ince ayar. <ol><li> Sadece referans kanalından translasyon ve rotasyon hesaplar ile bütün kanallar için uygular hizalama için bir referans kanalı kullanmak için seçin. Bu seçeneği kullanılıyorsa, referans olarak kullanmak üzere kanalı seçin. NOT: Bu seçenek yalnızca özel bir refere olarak bir kanal kullanmayı tercih edilmelidirBu tür bir referans tabanlı yapı bulma durumu gibi nce. Aksi takdirde, daha az doğru modellere sonuçlanacaktır. kanallar da bu seçeneği kullanılarak eğer aynı hizada olmalıdır. </li><li> Şablon eşleme sırasında görüntü yoğunluklarını kare seçin. Bu küçük farklılıkları vurgulamak, bu nedenle özellikle ince özelliklere sahip bir model oluştururken bunu kullanır. </li><li> &quot;En az bir benzerlik tohum karşı&quot; sürgüyü kullanarak ya da kutuya bir sayı girerek tohum karşı minimum benzerlik seçin. NOT: Sadece kullanılan bu kesme daha büyük tohumlara bir benzerliği olan parçacıklar. % 60-80, tipik ile başlamak için iyi bir seçimdir. </li><li> 1&#39;e Maksimum yineleme sayısı ayarlama tohum karşı en az benzerlik optimize etmek ve gerekirse, daha sonra artar. </li><li> görünecektir model üretme sürecinin unsurlarını seçmek için kutuları işaretleyin. NOT: &quot;Göster tohumlar&quot; kutularda yükledik tohum gösterecektirİletişim kutusunun üstündeki s. &quot;Göster modelleri&quot; tohum karşı asgari benzerlik karşılayan parçacıkların alt kümesini ortalaması alınarak oluşturulan modellerin tüm yinelemeleri gösterecektir. &quot;Göster MSE&quot; En değişkendir modelin yerleri vurgulamaktadır ortalama kare hatası (MSE) karesini gösterir. &quot;Göster parçacıklar&quot; görüntülenir modelin en yüksek yineleme gereği kayıtlı modelleri oluşturmak için kullanılan parçacıkların alt kümesini, gösterecektir. </li></ol></li><li> önizleme modellerini oluşturmak ve sonuçlarını görüntülemek için &quot;göster önizleme&quot; seçiniz. NOT: Bu sürecin en yoğun hesaplama gerektiren adımdır. Bir masaüstü bilgisayarda piksel birkaç onlarca çaplı birkaç bin parçacıkların kümesi için çalışma süresi yaklaşık 10 dakika olmalıdır. hesaplama zamanı sorunu ise, kullanıcılar ilk verilerin daha küçük bir alt kümesinde algoritması denemelisiniz ya da mümkünse, adım 2.2.4 daha küçük bir ROI yarıçapı kullanın. </li><li> üretmek görüntüled model parametreleri, tohum karşı, özellikle en az bir benzerlik optimize. modellenen morfolojisinin tek gerçek parçacıklar modeline dahildir kadar tohum karşı asgari benzerliği arttırın. </li><li> sürgünün &quot;Maksimum yineleme sayısı&quot; kullanarak veya kutusuna bir numara girerek Maksimum yineleme sayısı artırmak ve model üretme işlemi yineleme izin verir. maksimal yineleme için 10 civarında bir değeri kullanın. </li><li> modellerini Ad ve son model üretme sürecinin tüm yinelemeleri ihtiva modeli evrim yığınlarını kaydetmek için &quot;Tamam&quot; ı seçin. NOT: tohum karşı asgari benzerlik yok parçacıklar bu benzerliği var o kadar yüksektir ki, hiçbir şey güncellenecektir. eklenti dondurulacak görünüyorsa, asgari benzerlik çok yüksek olma olasılığını göz önünde bulundurun. </li></ol>

<ol><li>Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALM+and+STORM%3A+Unlocking+live-cell+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution.</a> Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).</li>
<li>Gustafsson, N., Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nat Commun. 7, 12471(2016).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+scaffold+structure+analyzed+by+super-resolution+microscopy+and+particle+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging.</a> Science. 341 (6146), 655-658 (2013).</li>
<li>Broeken, J., Johnson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+improvement+by+3D+particle+averaging+in+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy.</a> Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003(2015).</li>
<li>Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+with+particle+averaging+reveals+novel+roles+for+yeast+centrosome+components+during+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication.</a> Elife. , (2015).</li>
<li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li>
<li>Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Gray, R. D. M., Beerli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusMapper%3A+open-source+nanoscale+mapping+of+viral+architecture+through+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy.</a> Sci Rep. 6, 29132(2016).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Micros%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Let%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Let. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+proteome%3A+identification+of+proteins+in+vaccinia+virus+intracellular+mature+virion+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles.</a> J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).</li>
<li>Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoss%2C+B+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , Ovid. (2010).</li>
<li>Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+nutshell%3A+structure+and+assembly+of+the+vaccinia+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion.</a> Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+entry+is+followed+by+core+activation+and+proteasome-mediated+release+of+the+immunomodulatory+effector+VH1+from+lateral+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies.</a> Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).</li>
<li>Nanoj-virusmapper. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> (2016).</li>
<li>Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7389457/">Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept.</a> IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntemle, araştırmacılar virüs ve diğer makromoleküler kompleksleri protein mimarisinin yüksek hassasiyet, çok kanallı 2D modellerini oluşturmak için SPA ve SR mikroskobu gücünü birleştirmek için donatılmıştır. Ancak, bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır. Tohumlar sürekli görülen bir yapıyı temsil etmek seçilmelidir. Bu nedenle, ham veriler tohum seçilir önce dikkatlice kontrol edilmelidir. Bu önyargılı modellerini önlenmesi açısından önemlidir. Seçimleri modellerinde parçacıkların belirli bir sayıda içerir için gereken minimum benzerlik eşikleri incelenmesiyle doğrulanabilir. Açıktır ki, tohum seçimi için, daha yüksek Bu eşik parçacıklarının belirli bir sayıda olması gerekmektedir, daha bu yapı verileri belirgindir. veri heterojenlik olduğunda şablon uygun konsept, özellikle yararlıdır. vi olan bütün farklı yapılarsible tespit edilmeli ve farklı modeller her durum için yarattı. bir kanalda heterojen yapıların ayrılması, ancak eş zamanlı olarak ikinci bir kanala modelleri oluşturarak, desen hususu derhal olmazdı ortaya çıkabilir. Diğer bir faktör bu algoritma kullanılarak iterasyon prosedürü stokastik asimetri maksimize edeceği zaman farkında olmak. iki simetrik bir maksimaya sahip bir yapı modellerken Örneğin, maksimum arasındaki tüm hafif asimetriler yineleme sırasında birbirleri ile aynı hizada olacak ve nihai modeli, maksimum asimetrik olacaktır. Bu modellenen yapının bilinen bir simetri yansıtmaz, o zaman bu hesaba alınmalıdır. VirusMapper model üretme sürecine simetri eksenleri dahil etmek için potansiyel bir gelişme olacağını rağmen şu anda bu maksimizasyonu önlemenin tek yolu, 1 yineleme sayısını sınırlamaktır. VirusMapper Herhangi yeni versiyonları avai olacakBaşvurulan web sitesinde tıklamanız yeterli olacaktır (Malzeme Tablo). Kullanıcılar ayrıca herhangi bir ortak sorularına yanıt burada SSS bulacaksınız. açıklandığı gibi yazılım kullanıcı modellemek istediği özelliklere görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahip görüntülü olabilir herhangi yapıya uygulanabilir. SPA çözünürlüğünü artırabilir rağmen, açıkça aksi görünmez özelliklerin görünürlüğünü artırmak olmayacaktır. Bu protokol, bu nedenle, yöntem, verilerin kalitesini artırmak için değildir. En temiz veri ve iyi çıkan modellerini sağlayacak görüntüleme stratejisinin herhangi bir teknik, dikkatli numune hazırlama ve optimizasyon olduğu gibi. SR görüntüleme yönteminin seçimi genel olarak el altında numunenin bağlı olacaktır, ayrıca önemlidir ve. , VirusMapper SIM ve STED&#39;in 10 iyi çalışacak şekilde valide edilmiş ve aynı zamanda yüksek kaliteli yerelleştirme mikroskopi verileri ile kullanılabilir, ancak bakım bu durumda alınmalıdırolarak seyrek etiketleme asimetri maksimizasyonu benzer sorunlara yol açabilir. Şu anda, VirusMapper floresans görüntüleri tek parçacık analiz ve sadece genel amaçlı 2D SPA ortalama yazılımın tek serbestçe algoritmadır. Aynı ilkeler 4, 6 kullanımı yaptık Diğer çalışmalar, 8 her bir çalışma için uzman özel yazılım kullandık. Hiçbir yazılım sağlandı, ancak 3D veri yeniden inşası için Genel amaçlı algoritmalar, 5, 18 yayınlandı. Bu makalede tarif edildiği gibi kullanıldığında, VirusMapper virüs ve diğer kompleksler makromoleküler proteini mimarisi, hassas, doğru ve sağlam bir modeli üretmek için kullanılabilir. Bu model ile, araştırmacılar yapının ortalama boyutları hassas ölçümler alabilirÇalışmanın altında ures, potansiyel olarak onları başka türlü mümkün olmazdı biyolojik sonuçlara ulaşmanıza olanak verir. Ayrıca, bu tekniğin çok kanallı yetenekleri ile, komplekslerin proteinler ve bileşenlerin sınırsız sayıda eşlemek için ve yeni protein organizasyonu bilgiye mümkündür. Böyle bir virüs yaşam döngüsünün farklı aşamalarında farklı biyolojik ilgili koşullar, içinde nano ölçekli yapısında değişiklikler inceleyen biyoloji değerli bilgiler sunma potansiyeline sahiptir.

Süper çözünürlüklü (SR) mikroskopi onları anlama açısından son derece önemli moleküler özgü etiketleme ile birlikte görüntü anahtar moleküler süreçler yeteneği sağlayarak hücre biyolojisi üzerinde büyük bir etkisi oldu. SR şu anda bu tür görüntü canlı hücreleri 1, 2 potansiyeli gibi ışık mikroskobu önemli faydalar elde edilmesi esnasında, elektron mikroskopisi (EM) ile, daha önce sadece elde çözünürlükleri (20-150 nm) yaklaşmak için ışık mikroskobu sağlar. Bundan başka, nano ölçekli düzeyinde bulunan yapısal koruma SR verilere tek parçacık analizi (SPA), elektron mikroskobu 3 yaygın olarak kullanılan bir kavramın uygulamaya izin verir. SPA kullanarak, bir yapının çok yüksek ölçüde korunmuş kopya görüntülenmiş ve çözünürlük, hassas ya da sinyal-gürültü görüntülenmiştir nesnenin artırmak için birlikte ortalaması alınabilir. SR ile kombinasyon halinde kullanıldığında, SPA yüksek p için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirHIV 7 ve HSV-1 ile 8 olarak çekirdek gözenek kompleks 4, 5 bileşenleri, sentrozom 6 ve virüslerin recision eşleme. Bununla birlikte, SR, SPA rutin birlikte uygulama yazılım mevcut eksikliğinden öne sürülmüştür. Bu nedenle, biz VirusMapper, popüler görüntü işleme yazılımı ImageJ / Fiji 9&#39;a bir eklenti geliştirdi. Bu SR mikroskobu ile görüntülenmiş yapıların hızlı, kullanıcı dostu, çok kanallı naif ortalamayı sağlamak üzere tasarlanmış floresan görüntüleri 10 ile genelleştirilmiş SPA için ilk serbestçe kullanılabilir yazılım paketidir. virüsler için tasarlanmış olsa da, farklı moleküler türler, görüntülenen tanımlanmıştır ve lokalize edilebilir her hangi bir makromoleküler kompleks uygulanabilir. VirusMapper yüksek hassasiyetli molekül üretmek için kullanılabilmektedirortalama boyutları ve diğer parametrelerin hesaplanması için izin veren herhangi bir bilinen yapı model bulunur. algoritma tasarımı farklı yönlerde veya farklı morfolojik durumlarının saptanması için temin yapıların popülasyonları ayrılması için elverişli hale getirmektedir. Buna ek olarak, çok kanallı görüntüleme temel yapısı iyi bilinmektedir burada bu şekilde referans tabanlı yapı bulma için izin durumlarda bir referans kanalı kullanmak için kullanılabilir. Yazılım indirme ve yükleme talimatları üzerine sağlanmaktadır <a href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> . Örnek verileri de orada bulunabilir ve kullanıcıların kendi uygulamak denemeden önce örnek veriler üzerinde yazılım kullanarak uygulama tavsiye edilir. Burada, ham verilerden SPA modeller üretmek için bu eklentisi kullanarak adımları tarif edilmiştir. Yazılım tek o içeren ham görüntüleri alırgiriş olarak çok etiketli yapılar r. Bu yazılım çalıştırıldığında olarak ayarlanır parametrelerin bir dizi konu, döner, görüntülü yapıları içinde etiketlenmiş bileşenlerin ortalama dağılımlarını gösteren SPA modelleri. Bu protokolün amacı, Şekil 1 &#39;de ana hatlarıyla boru hattına göre görüntülenen yapıları içinde bileşenlerinin ortalama lokalizasyonu veren hassas SPA modelleri üretmektir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, program akışı yararlı üç aşamaya ayrılır. İlk aşamada, her bir kanal için parçacık yığınları ile sonuçlanan, kademeli bir çok görüntü etmektir. Bu parçacıklar modelleri oluşturmak için ve model üretimi için tohum üretmek için ortalaması alınır birimleridir. İkinci aşamada son aşamada partiküllerinin tüm dizi kaydetmek için kullanılan tohum görüntü oluşturmak için. Bu s katkıda bu kanalda parçacıkların, el ile, bir referans kanalı seçme ve yapılıreeds. Tohumlar, bu referans kanalı olarak seçilir, ancak tüm kanallar için oluşturulabilir. Parçacıklar başlangıçta bu kanalda bir 2D Gauss uydurma ile yeniden düzenlenebilir edilir. Seçilen ve yeniden düzenlendi olan tüm parçacıkları daha sonra bir tohum üretilmesi için ortalaması alınmıştır. modellenecek olan veriler görülen her bir ortak bir yapı için, parçacıklar açık ve doğru bir şekilde yapıyı temsil tohum olarak seçilmelidir. Bu aşamada arayüz ayrıca, yapıları için verileri taramak için faydalıdır. Son aşama şablon eşleştirme kullanarak modellerini üretmektir. Bu, başlangıçta, çapraz korelasyon önceki bölümde oluşturulan tohum resimlere ekstre parçacıklarının kayıt ile elde edilir. Kayıtlı parçacıklarının alt birlikte ortalaması alınır ve proses ayrıca arzu edildiği takdirde, hata kare ortalaması modeli azaltmak için tekrarlanır. Bu alt küme yerine getirilmesi gereken tohum karşı minimum benzerlik kurarak belirlenir. model oluştururkenbirden fazla kanal eş zamanlı olarak s, eklem benzerlik, ya da her bir kanal için benzerlikler ortalama kullanılır. bunlara katkıda elde edilen model ve kayıt parçacıklar daha sonra analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>NanoJ-VirusMapper</td><td>, Henriques lab</td><td></td> tarafından geliştirildi <td>Açık kaynak-Fiji eklentisi (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)</td></tr><tr><td>VectaShield antifade montaj ortamı</td><td>Vector Labs</td><td>H-100</td><td></td></tr><tr><td>Elyra PS1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN SİYAH</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SIM için görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>Yüksek performanslı lamel</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; 474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck boncuklar</td><td>ThermoFisher</td><td>T7279</td><td></td></tr></tbody></table>

virusmapper süper çözünürlüklü mikroskopi açık kaynak tek parçacık analizi

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi şu anda hücre biyolojisi araştırma devrim yaratıyor. Onun kapasitesi nano ölçekli biyolojik kompleksleri ve süreçlerin rutin görüntüleme için izin verir nm yaklaşık 300 çözünürlüğü sınırı kırmak için. Çözünürlükteki bu artış, aynı zamanda, tek parçacık analizi gibi elektron mikroskopisinde popüler yöntem, hali hazırda süper çözünürlüklü floresan mikroskobu uygulanabilir olduğu anlamına gelir. süper çözünürlük optik görüntüleme ile analitik bir yaklaşım birleştirerek, yarı kararlı bir yapı içinde moleküler elemanlar yapısal haritaları oluşturmak için floresan mikroskopi molekülü özel etiketleme kapasitesi yararlanmak mümkün olur. VirusMapper - - bir, yüksek performanslı kullanımı kolay ve yüksek verimli ImageJ eklentisi olarak paketlenmiş Bu amaçla, yeni bir algoritma geliştirdik. Bu makale, biyolojik m yeni yapısal özelliklere ortaya çıkarmak için yeteneğini vitrine, bu yazılım için derinlemesine bir kılavuz sunuyorolecular kompleksleri. Burada, uyumlu veri araya ve süper çözünürlüklü görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için bu algoritmayı nasıl kullanılacağına ilişkin bir adım-adım protokolünü nasıl sağlanacağı sunuyoruz.

Burada, modeli poksvirüs, aşı virüsü yazılımı göstermektedir. En kompleks bir memeli virüsleri, aşı paketi bir 350 x 270 x 250 mil 3 tuğla şekilli parçacık 13, 14 içinde yaklaşık 80 farklı proteinler. Üç altyapılar elektron mikroskobu ile ayırt edilebilen: dsDNA genomu içeren bir merkezi çekirdek; İki protein yapıları, çekirdek kuşatan adı yanal gövdeleri; ve tek bir proteolipid iki tabakalı 15 zarf. Rekombinant floresan protein etiketleme büyük boy, karmaşık bir yapı ve yatkınlığını vaccinia VirusMapper akışını göstermek için mükemmel bir sistem yapmak. Burada açıklandığı gibi yazılım kullanılarak, aşı virionun proteinlerin çeşitli dağılımı modellenebilir. Bir proteini, etiketlenmiş ve kombi muhtemelen, görüntülenmiştirparçacık o proteinin lokalizasyonu ortalama modeller üretmek için tarif edildiği gibi, bir referans olarak bilinen dağıtım başka protein ve yazılım ile ulus kullanılmıştır. Bu örnekte, iki proteinin, iç çekirdek proteini L4 model ve ana yanal gövde bileşeni, F17 edildi. F 17 sahip olan bir rekombinant vaccinia virüsü, GFP&#39;li etiketlenmiş ve MCherry 16 kullanılmıştır L4 etiketli. Saflaştırılmış virüsü 1 mM Tris, pH 9 içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kaplanmasıyla yıkandı ve yüksek performanslı lamelleri bağlanmıştır. Numuneler daha sonra 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit uygulanması ile tespit edilmiştir. Lameller antifade montaj ortamda slaytların üzerine derhal monte edildi. Görüntüleme ticari bir SİM mikroskop SİM tarafından gerçekleştirilmiştir. görüntü alanı 5 faz değişimleri ve 561 nm 3 ızgara dönüşleri (32 um ızgara pe kullanılarak elde edildi virüs ve yüzlerce görüntü içeren seçildiön em) ve 488 nm (32 um Izgara periyodu) lazerler. Görüntüler bir sCMOS kamera kullanılarak elde ve mikroskop yazılımı kullanılarak işlenmiştir. Kanallar aynı görüntü elde etme ayarları ile görüntülenmiş çok renkli boncuk slayt dayalı hizalanmış edildi. SİM yeniden yapılanma ve kanal hizalama görüntü Fiji açıldı ve tek bir görüntü yığını halinde birleştirilmiş edildikten sonra. Bu tanecikler, bir merkezi en fazla gibi viral partiküller, referans olarak ve herhangi bir Gauss bulanıklığı uygulamadan L4 kanalı kullanarak görüntü elde edildi. Yaklaşık 15,000 parçacıklar, bu deneyde ekstre edildi. Nedeniyle ineklerdeki geometrisine, yanal gövdeleri virüs yönlendirmesine göre belirgin bir şekilde farklı bir görünüme sahiptir. Bu bir ya da iki yan organları ayırt edilebilir olan iki yönelimleri görüntülenmiştir. Biz frontal ve sagittal, saygı gibi bu yönelimlerin anılacaktıryanıtını verdiler. Ön ve sajital yönelimleri için ayrı tohumlar &quot;tohumları oluşturmak&quot; aşamasında parçacık liste boyunca arama yolu ile seçildi (Şekil 4 ve 5); Bir yönde açık olan ya da başka seçilmiştir parçacıkları. L4 kanalı birbirleriyle tohum hizalamak için referans kanalı olarak kullanılmıştır. Yine, herhangi bir Gauss bulanıklığı gerekliydi. Her yönlendirme için 5 parçacıkları, ve tohum üretmek için ortalaması alınmıştır. Modeller bu tohumlar dayalı olarak her bir yönlendirme için üretilmiştir. Bir referans kanalı veya kare yoğunluk değerleri ne kullanılmıştır. Maksimum yineleme sayısı 1 başlangıçta ayarlandı ve en az benzerlik, her yönlendirme için tutarlı bir görünüm veren her bir durumda, yaklaşık 1000 parçacıklar içerir ayarlandı. Maksimum yineleme sayısı, daha sonra yükseltilmiştirModelin yakınlaşma için izin verir. Modeller, böylece iki kanal iki yönelimleri (Şekil 7) için üretilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig1.jpg" /> Şekil 1: VirusMapper akışı. eklenti üç ana aşamada düzenlenir. Viral parçacıklar geniş görüntülerden çıkarılır, şablon resim veya tohumlar verilerinden yarı elle seçilir ve nihai SPA modelleri tohum başvurarak veriden üretilmesidir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig2.jpg" /> Şekil 2: iletişim &quot;Viral Yapıları Özü&quot;. seçerken &quot;Viral structur Özü<html> es ROI önizlenemiyor sağlayan Önizleme göster &#39;o zaman seçilebilir&quot;, bu iletişim görünecektir. parametreleri. Optimal segmentasyon için ilk tahminler ile doldurulmalıdır&#39; ve parametreler ince ayar olması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">Bir görüntülemek için lütfen tıklayınız Bu rakamın daha büyük versiyonu.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig3.jpg" /> Şekil 3: ekstraksiyon parametrelerinin ayarlanması. çıkartılacaktır ROI, YG çapındaki, ROI sayısı ve en yüksek YG örtüşme önizleme sonra böyle bir durum elde etmek için ayarlanır. ROI tüm parçacıkların bir ROI dahil edilir ve ROI&#39;ler kümelenmiş parçacıkların ayrılmasına olanak sağlamak için yeterince üst üste binerek, parçacıklar biraz daha büyüktür.ank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig4.jpg" /> Şekil 4: şablon uygun tohum üretme. &quot;Tohum üret&quot; iletişim (1) atanacak parametrelerini ortaya koyar. Referans parçacıkları sekansı (2), kullanıcı referans kanalı olarak parçacıklar aracılığıyla tarama sağlar. bir parçacık referans parçacıkları sırayla bakıldığında, her kanal için yeniden düzenlenebilir parçacıklar realigned parçacık önizleme (3) &#39;de izlenebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig5.jpg" /> Şekil 5: tohum resimler ekleme. Tohumlar eklendikçe<html> kutusu &quot;çerçeveleri kullanımı&quot;, ilgili tüm tohumlar (4) ortalama ve çerçeveler (5) gösterildi. mevcut ortalama tohumlara benzer parçacıklar iletişim kutusunda (6) öneriliyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig6.jpg" /> Şekil 6: iletişim &quot;Modeller üret&quot;. seçme &quot;Tohum dayanarak Modelleri üret,&quot; Ne zaman bu iletişim görünecektir. parametreleri optimal model üretimi için başlangıç ​​tahminlerinin ile doldurulmalıdır, ve model üretme işleminden unsurları seçilmelidir hesaplama sırasında gösterilebilir. &quot;Önizlemeyi göster&quot; o zaman çalıştırmak için bir model oluşturma sürecini sağlayan seçilebilir ve parametreler ince ayar olması.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/55471/55471fig7.jpg" /> Şekil 7: VirusMapper oluşturulacak modeller. mCherry ile etiketlenmiş L4 çekirdek proteini ve EGFP ile etiketlenmiş F17 lateral vücut proteini ile vaccinia virionlar SIM kullanılarak görüntülendi. protokolde tarif edildiği gibi modeller, daha sonra yazılım ile elde edilmiştir. ön ve sajital iki yönelimleri, yan cisimlerin ortaya çıkması ile ayırt edilir. Ölçü bar = 100 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Bu prosedürün genel amacı, floresanla işaretlenmiş bileşenlere sahip yapıların süper-çözünürlüklü görüntülerine tek parçacık analizi uygulayarak, virüslerin veya makromoleküler komplekslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini üretmektir. Bu yöntem, kompleks virüslerin protein mimarisi ve bunun enfeksiyon seyri sırasında nasıl değiştiği dahil olmak üzere viroloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı yapının birden fazla görüntüsünün toplanması sayesinde bileşenlerinin yüksek hassasiyetli bir haritasının oluşturulmasının mümkün hale gelmesidir.Bu yöntem virüslerin yapısı hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer patojenler ve memeli hücrelerindeki makromoleküler kompleksler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, numuneyi süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İstenmeyen floresan yapıların bulunmadığı, iyi ayrılmış yüzlerce ila binlerce partikül içeren birkaç farklı görüş alanının görüntülerini elde edin.Görüntüler elde edilip işlendikten sonra, görüntüleri iç içe geçmiş kanallara sahip bir yığın (stack) şeklinde içe aktarın ve birleştirin. Gerektiğinde, birleştirilmiş görüntüyü hiper-yığından (hyper-stack) yığına dönüştürün. Ardından, VirusMapper alt menüsünden "Extract Viral Structures" seçeneğini belirleyin ve çıkarılan partiküller için dosya yolunu ayarlayın.Görüntülenen floresan kanal sayısını girin. Referans kanalı, partiküllerin en tutarlı görünüme sahip olduğu floresan kanal olarak ayarlayın. Eğer bu partiküller merkezî bir maksimuma sahip değilse, merkezî bir görünüm oluşturmak için tespit öncesi Gauss bulanıklaştırma uygulayın.Ardından, en büyük partiküllerin piksel cinsinden çapını tahmin edin. ROI yarıçapını bu değerin yarısından biraz daha fazla olacak şekilde ayarlayın. Kare başına gereken ROI sayısını tahmin edin.Başlangıçta yüzden fazla ROI kullanmayın. Maksimum ROI örtüşmesini parçacık ayrımına göre ayarlayın. Söz konusu kare için ROI'lerin önizlemesini görüntüleyin.Kaderdeki her bir parçacığın tek bir ROI içine alınması için yarıçapı, ROI sayısını ve maksimum örtüşmeyi ayarlayın. ROI'lerin, en büyük parçacıklardan en az birkaç piksel daha geniş olduğundan emin olun. Ardından, segmentasyonu çalıştırmak için OK'ye tıklayın.Ekstraksiyondan sonra ROI yöneticisindeki örnek görüntüyü kapatın. Ekstrakt edilen partikül setlerini yeniden adlandırmayın. "Generate Seeds" seçeneğini belirleyin ve ekstrakt edilen partikül verilerini içeren klasörü açın.Referans kanalı ayarlayın ve tohum oluşturulacak tüm kanalları seçin. Önceki modellerle eşleşmesi gerekiyorsa, tohumları doksan derece döndürün. Parçacıkların merkezi maksimumunun eksik olduğu kanallar için, daha önce yapıldığı gibi ön hizalama Gaussian bulanıklığı değerini artırın.Kanallar yakından hizalanmamışsa, referans olmayan kanallar için kayma düzeltmesini etkinleştirin. Parçacık dizisinde sürekli olarak görünen bir yapı arayın. Temsili bir parçacık belirleyin ve ilgili kare numarasını "Kullanılacak Kareler" alanına girin.Elde edilen tohumları inceleyin. Tohum seçimi, bu prosedürün kritik bir aşamasıdır. Modellenecek bir veya birden fazla yapıyı belirlemek için ham verileri dikkatlice görüntüleyin.Model kalitesi, bu yapıları doğru şekilde yansıtan tohumların seçilmesine büyük ölçüde bağlıdır. Benzer tohumlara sahip ek karelerin tanımlanmasını optimize etmek için referans kanalını, Gaussian bulanıklık yarıçapını ve kayma düzeltmesini gerektiği şekilde ayarlayın. Ortalama yapı, verilerde gözlemlenen bir yapıyı en iyi şekilde temsil edene kadar kare eklemeye ve oluşturma parametrelerini ayarlamaya devam edin.Tohumlar için klasör adını ve dosya ön ekini girin. Tohum görüntülerini daha sonraki modelleme işlemleri için kaydetmek üzere "Tamam"a tıklayın. "Tohumlar Tabanlı Modeller Oluştur"u seçin ve çıkarılmış partikül klasörünü açın.Her kanal için başlangıç ortalamalarını yükleyin. Referans tabanlı yapı keşfi yapılıyorsa, hizalama için bir referans kanal seçin. Bir kanaldaki bilinen partikül yapısı, ikinci bir bilinmeyen kanalı hizalamak için referans olarak kullanılabilir.Bu, bilinmeyen yapının tarafsız bir şekilde haritalandırılmasına olanak tanır. Kanallar arasındaki kromatik kaymanın önceden düzeltilmesi gerektiğini unutmayın. Analiz modeldeki küçük farkları veya ince ayrıntıları arıyorsa, şablon eşleştirme sırasında Square görüntü yoğunluğunu seçin.Minimum benzerliği yüzde altmış ile seksen arasında ve iterasyon sayısını bir olarak ayarlayın. Hesaplama sırasında gösterilecek modelleri ve partikülleri seçin ve önizleme modellerini oluşturun. Önizleme modellerini inceleyin.Sadece istenen morfolojiye sahip partikülleri dahil etmek için minimum benzerliği artırın. Gerektiğinde diğer model hesaplama parametrelerini optimize edin ve model oluşturma sürecinde, istenirse gösterilecek ek elementleri seçin. Ön izleme modelleri tatmin edici olduğunda, iterasyon sayısını ona çıkarın.Klasör adını ve dosya ön ekini ayarlayın. Final modelinin tüm iterasyonlarını içeren model evrim yığınlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Yeşil ve kırmızı floresan proteinlerle etiketlenmiş iki proteine sahip rekombinant bir Vaccinia virüsü, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile görüntülenmiş ve VirusMapper eklentisi ile modellenmiştir.Tohumlar, her biri beş temsili parçacıktan ortalanarak frontal ve sagittal oryantasyonlar için ayrı ayrı oluşturulmuştur. Virüsün oryantasyonuna bağlı olarak, bir veya iki lateral gövde ayırt edilebilir. Bu nedenle, iki oryantasyon için ayrı modeller oluşturulabilir.Bu prosedürü uygularken, modellerin kalitesinin büyük ölçüde elde edilen ham verilerin kalitesine bağlı olduğunu unutmak önemlidir. Tek parçacık analizi hassasiyeti artırabilse de düşük kaliteli görüntülerin telafisini sağlayamaz. Bu prosedürün ardından, bu modeller üzerinde daha ileri nicel analizler veya model uyumlama işlemleri gerçekleştirilebilir.Bu, örneğin enfeksiyon sırasında viral mimaride meydana gelen nano ölçekli değişikliklerle ilgili ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, süper çözünürlüklü görüntülerden moleküler mimari modelleri oluşturmak için tek parçacık analiz yazılımı VirusMapper'ın nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.

open-source-single-particle-analysis-for-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu makale, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak görüntülenen influenza virüslerinin veri işlemesi ve ardından hemaglutinin glikoproteininin subtomogram ortalaması için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, görüntü ön işlemeden son model iyileştirmeye kadar adım adım veri işlemeyi kapsar.

İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Öğrenin, süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülerinde tek parçacık analizi kullanarak virüslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini nasıl oluşturacağınızı. VirusMapper yazılımı ile viral mimariyi ve enfeksiyon sırasındaki yapısal değişiklikleri keşfedin.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Daha fazla video keşfet