VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi
April 9th, 2017
Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.
Bu prosedürün genel amacı, floresan etiketli bileşenlere sahip yapıların süper çözünürlüklü görüntülerine tek parçacık analizi uygulayarak virüslerin veya makro-moleküler komplekslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini üretmektir. Bu yöntem, karmaşık virüslerin protein mimarisi ve bunun enfeksiyon seyri sırasında nasıl değiştiği de dahil olmak üzere viroloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı yapının birden fazla görüntüsünü toplayarak, bileşenlerinin yüksek hassasiyetli bir haritasını oluşturmanın mümkün hale gelmesidir.
Bu yöntem virüslerin yapısı hakkında bilgi verebilse de, memeli hücrelerindeki diğer patojenler ve makromoleküler kompleksler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, numuneyi süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İstenmeyen floresan yapıları olmayan yüzlerce ila binlerce iyi ayrılmış parçacık içeren çeşitli görüş alanlarının görüntülerini elde edin.
Görüntüler alındıktan ve işlendikten sonra, görüntüleri içe aktarın ve birleştirilmiş kanallara sahip bir yığın halinde birleştirin. Gerekirse, birleştirilmiş görüntüyü hiper yığından yığına dönüştürün. Ardından, VirusMapper alt menüsünde Viral Yapıları Çıkar"ı seçin ve çıkarılan parçacıklar için dosya yolunu ayarlayın.
Görüntülenen floresan kanallarının sayısını doldurun. Referans kanalını, parçacıkların en tutarlı görünüme sahip olduğu floresan kanalına ayarlayın. Bu parçacıklar merkezi bir maksimumdan yoksunsa, birinin görünümünü indüklemek için ön algılama Gauss bulanıklığı uygulayın.
Ardından, en büyük parçacıkların çapını piksel cinsinden tahmin edin. ROI yarıçapını bu değerin yarısından biraz daha fazlasına ayarlayın. Kare başına gereken yatırım getirisi sayısını tahmin edin.
Başlangıçta yüzden fazla yatırım getirisi kullanmayın. Parçacık ayrımına bağlı olarak maksimum ROI örtüşmesini ayarlayın. Bu karenin yatırım getirilerini önizleyin.
Yarıçapı, ROI sayısını ve maksimum örtüşmeyi, çerçevedeki her parçacığın tek bir ROI içine alınması için ayarlayın. ROI'lerin en büyük parçacıklardan en az birkaç piksel daha geniş olduğundan emin olun. Ardından, segmentasyonu çalıştırmak için Tamam'ı tıklayın.
Ayıklama işleminden sonra ROI yöneticisinde örnek görüntüyü kapatın. Çıkarılan parçacık kümelerini yeniden adlandırmayın. Tohum Oluştur'u seçin" ve çıkarılan parçacık verilerini içeren klasörü açın.
Referans kanalını ayarlayın ve bir tohumun oluşturulması gereken tüm kanalları seçin. Önceki modellerle eşleşmesi gerekirse, tohumları doksan derece döndürün. Parçacıkların merkezi bir maksimuma sahip olmadığı kanallar için, ön hizalama Gauss bulanıklığı değerini daha önce olduğu gibi artırın.
Kanallar yakından hizalanmamışsa, referans olmayan kanallar için kaydırma düzeltmesini etkinleştirin. Tutarlı bir şekilde görünen bir yapı için parçacık dizisini arayın. Temsili bir parçacık tanımlayın ve Kullanılacak çerçeveler" alanına ilgili çerçeve numarasını girin.
Elde edilen tohumları gözden geçirin. Tohum seçimi bu prosedürün kritik bir aşamasıdır. Modellenecek bir veya daha fazla yapıyı tanımlamak için ham verileri dikkatlice görüntüleyin.
Model kalitesi, bu yapıları doğru bir şekilde yansıtan tohumların seçilmesine büyük ölçüde bağlıdır. Benzer tohumlara sahip ek karelerin tanımlanmasını optimize etmek için referans kanalını, Gauss bulanıklık yarıçapını ve kaydırma düzeltmesini gerektiği gibi ayarlayın. Ortalama yapı, verilerde gözlemlenen bir yapıyı en iyi şekilde temsil edene kadar çerçeve eklemeye ve oluşturma parametrelerini ayarlamaya devam edin.
Tohumlar için klasör adını ve dosya önekini girin. Tohum görüntülerini daha sonra modellemek üzere kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Tohumlara Dayalı Modeller Oluştur'u seçin ve çıkarılan parçacık klasörünü açın.
Her kanal için çekirdek ortalamalarını yükleyin. Başvuru tabanlı yapı keşfi yapıyorsanız, hizalama için bir referans kanalı seçin. Bir kanaldaki bilinen parçacık yapısı, ikinci bir bilinmeyen kanalı hizalamak için bir referans olarak kullanılabilir.
Bu, bilinmeyen yapının tarafsız bir şekilde haritalandırılmasına izin verir. Kanallar arasındaki renk kaymasının önceden düzeltilmesi gerektiğini unutmayın. Analiz, modelde küçük farklılıklar veya ince özellikler arıyorsa, şablon eşleştirme sırasında Kare görüntü yoğunluğu'nu seçin.
Minimum benzerliği yüzde altmış ile seksen arasında ve yineleme sayısını bir olarak ayarlayın. Hesaplama sırasında gösterilecek modelleri ve parçacıkları seçin ve önizleme modellerini oluşturun. Önizleme modellerini inceleyin.
Yalnızca istenen morfolojiye sahip parçacıkları dahil etmek için minimum benzerliği artırın. Diğer model hesaplama parametrelerini gerektiği gibi optimize edin ve istenirse model oluşturma sürecinde gösterilecek ek öğeleri seçin. Önizleme modelleri tatmin edici olduğunda, yineleme sayısını ona yükseltin.
Klasör adını ve dosya önekini ayarlayın. Son modelin tüm yinelemelerini içeren model evrimi yığınlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Yeşil ve kırmızı floresan proteinleri ile etiketlenmiş iki proteine sahip bir rekombinant Vaccinia virüsü, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile görüntülendi ve VirusMapper eklentisi ile modellendi.
Tohumlar, her biri beş temsili parçacıktan ortalama alınan frontal ve sagital yönelimler için ayrı ayrı üretildi. Virüsün oryantasyonuna bağlı olarak, bir veya iki yan cisim ayırt edilebilir. Bu nedenle, iki yönlendirme için ayrı modeller oluşturulabilir.
Bu yordamı denerken, modellerin kalitesinin büyük ölçüde elde edilen ham verilerin kalitesine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Tek parçacık analizi hassasiyeti artırabilirken, düşük kaliteli görüntüleri telafi edemez. Bu prosedürü takiben, bu modeller üzerinde daha fazla miktar belirleme veya model uydurma yapılabilir.
Bu, özellikle enfeksiyon sırasında viral mimarideki nano ölçekli değişiklikler gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, süper çözünürlüklü görüntülerden moleküler mimari modelleri oluşturmak için tek parçacıklı analiz yazılımı VirusMapper'ın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu el yazması, süper çözünürlüklü mikroskopi görüntüleri üzerinde tek-parçacık analizi kullanarak virüslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini oluşturma yöntemi sunmaktadır. Teknik, viral yapının ve enfeksiyon sırasındaki değişikliklerini anlamamızı geliştirmek için VirusMapper yazılımını kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Mikroskopi
- Strüktürel Biyoloji
Arka Plan
- Tek-parçacık analizi, nanoölçekli yapıların ayrıntılı modellemesine olanak tanır.
- Süper çözünürlüklü mikroskopi, floresan olarak etiketlenmiş bileşenlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlar.
- Yöntem, virüslerin ötesinde çeşitli biyolojik sistemlere uygulanabilir.
- Viral yapının anlaşılması, enfeksiyon mekanizmaları hakkında bilgiler sağlamak için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Virüsler ve makromoleküler komplekslerin doğru moleküler modellerini üretmek.
- Kompleks virüslerin protein yapısını araştırmak.
- Virüs enfeksiyonu süreci boyunca yapısal değişiklikleri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi kullanarak görüntü elde etmek.
- Görüntüleri analiz için bir yığına işleme ve birleştirme.
- Virüs yapılarını çıkarmak ve tohumlar oluşturmak için VirusMapper kullanmak.
- Seçilen tohumlara dayalı model üretimi ve iteratif rafine.
Ana Sonuçlar
- Virüs yapılarının yüksek hassasiyetli modelleri başarıyla oluşturuldu.
- Virüsün farklı yönleri ayrı ayrı modellendi.
- Modellerin kalitesi, ham görüntüleme verilerinin kalitesine bağlıydı.
- Viral yapının nanoölçekli değişiklikleri hakkında bilgiler elde edildi.
Sonuçlar
- Tek-parçacık analizi, yapısal modellerin hassasiyetini artırır.
- VirusMapper, viral yapıyı incelemek için değerli bir araçtır.
- Daha fazla niceleme, viral dinamikler hakkında daha derin bilgiler sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
VirusMapper enables high-precision structural modeling of viral components from super-resolution microscopy data, supporting target validation in antiviral discovery. By quantifying nanoscale architecture and conformational changes, it provides mechanistic de-risking for early-stage virology programs. The open-source, high-throughput plugin facilitates scalable application across discovery teams studying viral entry, assembly, or host-pathogen interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral protein architecture and structural dynamics during infection cycles.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven target selection through direct visualization of macromolecular complexes.
- Predictive Value: Generates structural maps that inform epitope accessibility and druggable site identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, reproducible structural outputs for assay standardization.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological models for downstream compound screening.
- Platform Value: Facilitates reuse of imaging workflows across multiple viral targets or mutants.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links nanoscale structural changes to functional viral phenotypes.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation via consistent structural readouts.
- Risk Mitigation: Enables data-driven go/no-go decisions based on architectural stability across strains or conditions.
Pipeline & Workflow Integration
VirusMapper fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing structural insights that inform antiviral design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral assembly mechanisms and host-factor interactions.
- Screening: Delivers assay-ready structural models with quantitative spatial resolution for compound binding studies.
- Analytics: Generates iterative model refinements and similarity metrics that enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects structural observations to preclinical efficacy through architecture-function correlation.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, open-source platform for structural virology across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence through direct, high-resolution visualization of viral components.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability via automated particle extraction and iterative modeling.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead selection by validating structural assumptions early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on structural conservation or vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and image analysis workflows.
- Depends on access to structured illumination or comparable super-resolution platforms.
- Necessitates standardized image acquisition protocols for consistent particle separation and signal quality.
- Involves cross-team alignment on reference channel selection and seed generation parameters.
- Limited by the quality of raw imaging data; cannot compensate for poor labeling or high background.
