VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Bu prosedürün genel amacı, floresanla işaretlenmiş bileşenlere sahip yapıların süper-çözünürlüklü görüntülerine tek parçacık analizi uygulayarak, virüslerin veya makromoleküler komplekslerin yüksek hassasiyetli moleküler modellerini üretmektir. Bu yöntem, kompleks virüslerin protein mimarisi ve bunun enfeksiyon seyri sırasında nasıl değiştiği dahil olmak üzere viroloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı yapının birden fazla görüntüsünün toplanması sayesinde bileşenlerinin yüksek hassasiyetli bir haritasının oluşturulmasının mümkün hale gelmesidir.

Bu yöntem virüslerin yapısı hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer patojenler ve memeli hücrelerindeki makromoleküler kompleksler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, numuneyi süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İstenmeyen floresan yapıların bulunmadığı, iyi ayrılmış yüzlerce ila binlerce partikül içeren birkaç farklı görüş alanının görüntülerini elde edin.

Görüntüler elde edilip işlendikten sonra, görüntüleri iç içe geçmiş kanallara sahip bir yığın (stack) şeklinde içe aktarın ve birleştirin. Gerektiğinde, birleştirilmiş görüntüyü hiper-yığından (hyper-stack) yığına dönüştürün. Ardından, VirusMapper alt menüsünden "Extract Viral Structures" seçeneğini belirleyin ve çıkarılan partiküller için dosya yolunu ayarlayın.

Görüntülenen floresan kanal sayısını girin. Referans kanalı, partiküllerin en tutarlı görünüme sahip olduğu floresan kanal olarak ayarlayın. Eğer bu partiküller merkezî bir maksimuma sahip değilse, merkezî bir görünüm oluşturmak için tespit öncesi Gauss bulanıklaştırma uygulayın.

Ardından, en büyük partiküllerin piksel cinsinden çapını tahmin edin. ROI yarıçapını bu değerin yarısından biraz daha fazla olacak şekilde ayarlayın. Kare başına gereken ROI sayısını tahmin edin.

Başlangıçta yüzden fazla ROI kullanmayın. Maksimum ROI örtüşmesini parçacık ayrımına göre ayarlayın. Söz konusu kare için ROI'lerin önizlemesini görüntüleyin.

Kaderdeki her bir parçacığın tek bir ROI içine alınması için yarıçapı, ROI sayısını ve maksimum örtüşmeyi ayarlayın. ROI'lerin, en büyük parçacıklardan en az birkaç piksel daha geniş olduğundan emin olun. Ardından, segmentasyonu çalıştırmak için OK'ye tıklayın.

Ekstraksiyondan sonra ROI yöneticisindeki örnek görüntüyü kapatın. Ekstrakt edilen partikül setlerini yeniden adlandırmayın. "Generate Seeds" seçeneğini belirleyin ve ekstrakt edilen partikül verilerini içeren klasörü açın.

Referans kanalı ayarlayın ve tohum oluşturulacak tüm kanalları seçin. Önceki modellerle eşleşmesi gerekiyorsa, tohumları doksan derece döndürün. Parçacıkların merkezi maksimumunun eksik olduğu kanallar için, daha önce yapıldığı gibi ön hizalama Gaussian bulanıklığı değerini artırın.

Kanallar yakından hizalanmamışsa, referans olmayan kanallar için kayma düzeltmesini etkinleştirin. Parçacık dizisinde sürekli olarak görünen bir yapı arayın. Temsili bir parçacık belirleyin ve ilgili kare numarasını "Kullanılacak Kareler" alanına girin.

Elde edilen tohumları inceleyin. Tohum seçimi, bu prosedürün kritik bir aşamasıdır. Modellenecek bir veya birden fazla yapıyı belirlemek için ham verileri dikkatlice görüntüleyin.

Model kalitesi, bu yapıları doğru şekilde yansıtan tohumların seçilmesine büyük ölçüde bağlıdır. Benzer tohumlara sahip ek karelerin tanımlanmasını optimize etmek için referans kanalını, Gaussian bulanıklık yarıçapını ve kayma düzeltmesini gerektiği şekilde ayarlayın. Ortalama yapı, verilerde gözlemlenen bir yapıyı en iyi şekilde temsil edene kadar kare eklemeye ve oluşturma parametrelerini ayarlamaya devam edin.

Tohumlar için klasör adını ve dosya ön ekini girin. Tohum görüntülerini daha sonraki modelleme işlemleri için kaydetmek üzere "Tamam"a tıklayın. "Tohumlar Tabanlı Modeller Oluştur"u seçin ve çıkarılmış partikül klasörünü açın.

Her kanal için başlangıç ortalamalarını yükleyin. Referans tabanlı yapı keşfi yapılıyorsa, hizalama için bir referans kanal seçin. Bir kanaldaki bilinen partikül yapısı, ikinci bir bilinmeyen kanalı hizalamak için referans olarak kullanılabilir.

Bu, bilinmeyen yapının tarafsız bir şekilde haritalandırılmasına olanak tanır. Kanallar arasındaki kromatik kaymanın önceden düzeltilmesi gerektiğini unutmayın. Analiz modeldeki küçük farkları veya ince ayrıntıları arıyorsa, şablon eşleştirme sırasında Square görüntü yoğunluğunu seçin.

Minimum benzerliği yüzde altmış ile seksen arasında ve iterasyon sayısını bir olarak ayarlayın. Hesaplama sırasında gösterilecek modelleri ve partikülleri seçin ve önizleme modellerini oluşturun. Önizleme modellerini inceleyin.

Sadece istenen morfolojiye sahip partikülleri dahil etmek için minimum benzerliği artırın. Gerektiğinde diğer model hesaplama parametrelerini optimize edin ve model oluşturma sürecinde, istenirse gösterilecek ek elementleri seçin. Ön izleme modelleri tatmin edici olduğunda, iterasyon sayısını ona çıkarın.

Klasör adını ve dosya ön ekini ayarlayın. Final modelinin tüm iterasyonlarını içeren model evrim yığınlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Yeşil ve kırmızı floresan proteinlerle etiketlenmiş iki proteine sahip rekombinant bir Vaccinia virüsü, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile görüntülenmiş ve VirusMapper eklentisi ile modellenmiştir.

Tohumlar, her biri beş temsili parçacıktan ortalanarak frontal ve sagittal oryantasyonlar için ayrı ayrı oluşturulmuştur. Virüsün oryantasyonuna bağlı olarak, bir veya iki lateral gövde ayırt edilebilir. Bu nedenle, iki oryantasyon için ayrı modeller oluşturulabilir.

Bu prosedürü uygularken, modellerin kalitesinin büyük ölçüde elde edilen ham verilerin kalitesine bağlı olduğunu unutmak önemlidir. Tek parçacık analizi hassasiyeti artırabilse de düşük kaliteli görüntülerin telafisini sağlayamaz. Bu prosedürün ardından, bu modeller üzerinde daha ileri nicel analizler veya model uyumlama işlemleri gerçekleştirilebilir.

Bu, örneğin enfeksiyon sırasında viral mimaride meydana gelen nano ölçekli değişikliklerle ilgili ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, süper çözünürlüklü görüntülerden moleküler mimari modelleri oluşturmak için tek parçacık analiz yazılımı VirusMapper'ın nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.