Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı elektron mikroskobuna olan ilgi, nano ölçekli gerçek zamanlı süreçlerde görselleştirebildiğimiz için son yıllarda fırladı. Bu esnek yapılar hakkında gelişmiş bilgi, SARS-CoV-2 gibi ortaya çıkan patojenlerle mücadele etmek için yeni reaktifler geliştirmemize yardımcı olabilir. Proteinleri akışkan bir ortamda görüntülemek, biyolojik sistemleri taklit etmeye yardımcı olur ve bize proteinlere daha dinamik bir şekilde bakma fırsatı verir.

Ve bu deney size hem vitreus buzu hem de sıvı ortamlarda proteinlerin nasıl kullanılacağı ve görselleştirileceği konusunda yeni teknikler gösterecektir. Son sonuçlar, sıvı içinde görüntülenen antikor bazlı tedavilerde aşı adaylarının dinamik görüşlerini içermektedir. Korelasyonel sıvı ve kriyo-EM uygulamaları, moleküler dinamikleri görselleştirme yeteneğimizi geliştirerek insan sağlığı ve hastalığı için benzersiz bir bağlam sağlar.

Geleneksel TEM veya kriyo-EM teknolojilerini kullanan okuyucular, numunelerinin mevcut stratejilerini tamamlayacak şekilde yeni dinamik gözlemlerini sağlamak için sıvı EM iş akışlarını uygulamayı düşünebilirler. Ticari olarak temin edilebilen sıvı-EM sistemleri, birçok gerçek zamanlı görüntüleme uygulaması için gerekli olan akış, karıştırma, elektrokimyasal uyaranlar ve sıcaklık kontrolü sağlayabilir. Burada sunulan mikroçipli sandviç yöntemi, yerinde deneyler için daha karmaşık bir ticari sisteme sıçramadan önce örnekleri sıvı olarak görüntülemenin basit bir giriş seviyesi yolunu açıklar.

Başlamak için, silikon nitrür mikroçiplerini, her bir çipi iki dakika boyunca 150 mililitre asetonda inkübe ederek temizleyin, ardından iki dakika boyunca 150 mililitre metanol içinde inkübasyon. Talaşların laminer hava akışında kurumasına izin verin. Plazma, argon gazı kullanarak 45 saniye boyunca standart koşullar altında çalışan bir kızdırma tahliye cihazı kullanarak kurutulmuş cipsleri temizler.

Daha sonra, numune tutucunun ucuna kuru bir baz mikroçip yükleyin ve numunenin yaklaşık 0,2 mikrolitresini baz çipe ekleyin. Bir ila iki dakika inkübe ettikten sonra, üst çipi numuneyi içeren ıslak taban çipine yerleştirin. Üç pirinç vida ile mekanik olarak yerinde tutulan hermetik olarak kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için tertibatı bir araya getirin.

Turbo pompalı kuru pompa istasyonu kullanarak ucu eksi altı torr'a 10'a kadar pompalayın. Tutucu artık TEM'e takılmaya hazırdır. Plazma, mikroçipleri ve karbon ızgaralarını bir kızdırma boşaltma cihazı kullanarak 45 saniye boyunca temizler.

Ve bir jel paketi üzerine yerleştirilen parıltılı boşaltılmış bir mikroçipe yaklaşık iki mikrolitre numune ekleyin. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı veya pipet kullanarak çıkarın ve bir ila iki dakika boyunca inkübe edin. Ardından, parıltılı boşaltılmış karbon ızgarasını, numuneyi içeren ıslak mikroçipe ekleyin.

Hermetik olarak kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için oda sıcaklığında tek bir eğimli numune tutucu kullanarak tertibatı bir araya getirin. Alternatif olarak, otomatik yükleyici ızgara klipslerini kullanın ve sandviç tertibatını alt C klipsine yerleştirin. Üst klipsi montajın üstüne yerleştirin ve montajı birbirine kapatmak için standart sıkıştırma aletini kullanın.

Örnek şimdi TEM'e yerleştirilmeye hazırdır. Otomatik yükleyicilere yerleştirilen numuneleri kriyo koşullarında veya oda sıcaklığında inceleyin. Sıvı-EM görüntüleme için, numune tutucuyu bir alan emisyon tabancası ile donatılmış TEM'e yükleyin ve 200 kilovoltta çalıştırın.

Tabancayı açın ve mikroskop aşamasının ösentrik yüksekliğini, yalpalama fonksiyonunu kullanarak numuneye göre ayarlayın, numuneyi sütunda eksi 15 dereceden artı 15 dereceye kadar eğin. Bu prosedür, numune kalınlığına uyum sağlamak için sahneyi Z yönünde ayarlar ve görüntü kaydı sırasında doğru bir büyütme sağlamaya yardımcı olur. Otomatik görüntüleme rutinleri uygulayarak seri veri toplama yazılım paketini kullanarak görüntüleri uzun çerçeveli filmler veya tek tek görüntüler olarak kaydedin.

Düşük doz koşulları altında, saniyede 28.000X ila 92.000X ve 40 kare arasında değişen büyütmelerde görüntüler elde edin. Numuneye ışın hasarını en aza indirmek için pozlama sürelerini ayarlayın ve belirtilen büyütmede eksi bir ila dört mikrometrelik bir bulanıklaştırma aralığı kullanın. Kalın bir çözümle karşılaşılırsa, daha yüksek bulanıklaştırma değerleri kullanın veya farklı bir ilgi alanı seçin.

Elektron ışınını, kabarcıklar oluşana kadar veri toplama için kullanılmayan kurban edilen bir alana odaklayarak görüntüleme oturumu boyunca örneklerde çözeltinin bulunduğundan emin olun. RELION-3.0.8 programını veya başka bir görüntü işleme yazılımını kullanarak SARS-CoV-2 parçacıkları için filmleri analiz edin. MotionCor2 programını kullanarak hareket düzeltme gerçekleştirin.

Düzeltildikten sonra, program yazılım paketindeki otomatik toplama aracını kullanarak parçacıkları ayıklayın. Tipik kutu boyutları sıvı numuneler için 330 piksel ve buz örnekleri için 350 pikseldir. Programın 3B başlangıç modeli rutini ve veri işleme yazılım paketindeki ab initio model seçenekleriyle C1 simetrisini kullanarak ilk rekonstrüksiyonları hesaplayın.

Ardından, veri işleme yazılımında iyileştirme protokolleri gerçekleştirin. Dinamik değişiklikleri değerlendirirken moleküler yapı analizi yazılım paketini kullanarak sonuçları inceleyin. Adeno ilişkili virüs alt tipi üç veya AAV'deki sıvı-EM ve kriyo-EM yapılarının karşılaştırılması burada gösterilmiştir.

Temsili görüntüler, AAV'nin çözeltideki ve buzdaki yapısını göstermektedir. Sıvı ve buz yapılarından ekstrakte edilen AAV VP1 alt ünitesinin rotasyonel görünümleri burada gösterilmiştir. Bu görüntüler, moleküler yapı analiz yazılımındaki morf haritası fonksiyonu kullanılarak oluşturulan sıvı yapılardaki dinamik değerleri temsil eder.

Çoklu virüs gruplarından elde edilen ortalama yapılar, EM verileri kullanılarak ölçülen neredeyse% 5'lik bir çap değişikliği ile konformasyonel değişiklikler göstermektedir. COVID-19 hastalarından serum fraksiyonlarından izole edilen SARS-CoV-2 subviral gruplarının bir görüntüsü burada gösterilmiştir. Bu beyaz kabarcıklar numunede sıvı varlığını gösterir.

Bu subviral montajların EM rekonstrüksiyonu, harita boyunca beş nanometre diliminde renkli radyal yoğunluklarla burada gösterilmiştir. Temsili görüntü, mikroçipli sandviç tekniği kullanılarak vitreus buzda hazırlanan rotavirüs çift katmanlı parçacıkların analizini açıklamaktadır. Sıvı-EM görüntüleme için deterjan, gliserol, polietilen, glikol ve yüksek düzeyde şeker kullanımı en aza indirilmeli veya kaçınılmalıdır.

Bu reaktifler artefaktlar oluşturabilir, ışın hasarı nedeniyle aşırı köpürme, hidroliz ürünleri ve serbest radikaller oluşturabilir. Bu protokollerin kullanımı, bilim adamlarının dinamik süreçleri atomik detaylarda inceleyebilmelerini sağlayacaktır. Ve bu, tıp, yaşam bilimleri ve malzeme araştırması dahil olmak üzere birçok bilim alanına yayılmaktadır.

Burada sunulan protokoller, son teknoloji ürünü araçların biyolojik makromolekülleri yeni gözlerle görselleştirmek için nasıl heyecan verici bir araç sağlayabileceğini açıklamaktadır. Sıvı elektron mikroskobu alanı, insan sağlığına tehdit oluşturan bu yeni virüsleri nasıl incelediğimizi yükseltebilir, hatta belki de pandemik hazırlık önlemlerimize katkıda bulunabilir.